质粒转化、细胞转染步骤
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
双荧光素酶报告实验质粒转染详细步骤及说明
1. 待测细胞在10 cm dish 中培养至80-90% 融合时，倾去培养液，用2ml PBS 洗涤细胞两次；
2. 加1ml Trypsin-EDTA solution, 混匀后，小心吸去胰酶溶液，37ºC 放置1-5分钟；
3. 加入2 ml 完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；
4. 血球计数板计数，将细胞稀释至1×10 6 细胞/ml；
5. 取100 μl 上述细胞稀释液加入96 孔板，使细胞密度达到1×10 5 个细胞/孔，混匀后于37ºC 5% CO 2 培养24 小时；
6. 在3 个1.5 ml EP 管中各加入50 μl 无血清培养基，分别加入0.2 μg，0.4 μg，0.8 μgpEX-1 质粒，混匀；取另一1.5 ml EP 管，加入150 μl 无血清DMEM，加入1.5 μl 转染试剂，充分混匀，室温放置5 分钟后将150 μl 平均3 等份对应加入含有质粒的3个EP 管，充分混合，室温放置20 分钟；
7. 吸去96 孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入96 孔板中，混匀后，在培养箱中
温育5 小时；
8. 吸弃转染液，加入100 μl 完全培养液。
37ºC 5% CO 2 继续培养, 24h 和48h 观察并拍照质粒转染效果图片。
质粒扩增、提取、转化和转染
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序60质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB 培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
一般普通质粒扩增：先将质粒转化到DH5α等大肠杆菌中，通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。
大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基，配方见下文。
根据质粒带有的抗生素抗性基因，还需要在LB中加入适量相应抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素等。
LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调pH至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭菌20 分钟。
质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售，可按照相应试剂盒的说明书操作。
转化：①取出感受态细胞（也有商品化感受态销售），冰浴10分钟。
②取连接产物10μl 放入感受态细胞中（100μl/管），轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30分钟。
③42℃热休克120 秒（按照需要加长或减少时间），不能摇动Ep管。
冰浴5 分钟，然后转移到事先预热至37℃的无抗生素的普通LB培养基800ul，50~100rpm 37℃恒温振荡 1 小时30 分钟。
④用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul 菌液铺于含有抗生素的LA平板。
⑤铺菌的LA 平板于37℃正放2~3 小时，然后倒置培养16-24 小时。
⑥将疑似阳性克隆的白斑选出，接到新的含有抗生素的LB中培养14小时左右，做菌液PCR或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。
转染：①将3μl（约4μg）纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250μl 无血清培养基DMEM (无双抗) 中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
②再吸取10 μl 脂质体溶入250 μl 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，室温放置5 mim。
③将制备好的DNA 与脂质体轻轻混合均匀，室温放置20 mim。
然后加入1.5 ml 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，即为包裹好的脂质体/DNA。
④将包裹好的脂质体/DNA小心滴加至备用细胞表面，37℃，5% CO2，饱和湿度中孵育10小时。
[说明]转染详细步骤大攻略
![[说明]转染详细步骤大攻略](https://img.taocdn.com/s3/m/8d4c02e6bb68a98270fefa98.png)
[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。
(6)37?水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
转染步骤范文
转染步骤范文转染是指将外源DNA导入到受体细胞中的过程，用于基因工程、基因治疗等研究和应用。
转染步骤是实现转染的关键步骤，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
以下是转染步骤的详细描述。
第一步：细胞培养在进行转染实验之前，首先需要培养并扩增所使用的细胞。
细胞的培养基因常见的有DMEM、RPMI等，培养基中会添加适当的酵素抑制剂（如胰酶）和生长因子，以促进细胞的生长和增殖。
第二步：转染试剂制备转染试剂可以是化学试剂，也可以是病毒载体或质粒DNA。
化学试剂常见的有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、阳离子聚合物等。
病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、大肠杆菌之Coli phage等。
质粒DNA则是将外源DNA经过酶切和纯化处理得到的。
第三步：转染试剂处理在这一步中，将转染试剂与细胞一起孵育，以使转染试剂与细胞内部的DNA互相结合。
转染试剂的使用方法根据具体试剂的特点而定，常见的方法有磷酸钙共沉淀、脂质体包裹、病毒载体包装等。
第四步：细胞培养和分析在细胞孵育一定时间后，可以对转染效率进行分析。
常见的分析方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术、PCR等。
通过这些分析方法，可以观察到转染后的外源DNA是否成功导入到细胞，并根据实验需要进行下一步操作。
除了以上步骤，还有一些实验时需要注意的要点，例如选择合适的细胞密度和培养时间、优化转染条件、进行有效杀菌等。
同时，也需要仔细阅读相关实验操作手册，并参考先前类似研究的文献，以确保实验的准确性和可重复性。
总结起来，转染步骤是进行基因转染的重要环节，包括细胞培养、转染试剂制备、转染试剂处理、细胞培养和分析。
通过精确执行每个步骤，并结合适当的方法和实验操作要点，可以高效地将外源DNA导入到受体细胞中，实现基因工程和基因治疗等研究和应用的目的。
质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB培养基加入琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
质粒转化细胞转染步骤
质粒转化细胞转染步骤质粒转化和细胞转染是两种常用的实验技术，用于将外源DNA引入到细胞中。
一般情况下，质粒转化用于细菌细胞，而细胞转染适用于非细菌的真核细胞。
以下将详细介绍质粒转化和细胞转染的步骤。
一、质粒转化质粒转化是将外源质粒DNA转移到细菌细胞中。
它通常与革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）一起使用，并且可以通过化学法、热冲击法或电穿孔法进行。
1.预处理细菌细胞：将细菌单克隆培养在含有抗生素的培养基中，以筛选出含有质粒的细胞。
通常使用革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。
2.质粒DNA处理：将质粒DNA与细菌细胞一起孵育，以促进质粒与细菌细胞的结合。
孵育时间和孵育条件取决于所使用的方法。
3.转化：将孵育混合物涂布在含有适当营养物和抗生素的琼脂平板上，使质粒转移到接收细胞中。
4.筛选和鉴定：根据在琼脂平板上形成的菌落的形态、大小、颜色等特征进行筛选。
同时，还可以通过PCR、限制性酶切、测序等方法鉴定是否成功转化。
二、细胞转染细胞转染是将外源DNA引入到真核细胞中。
常见的方法包括化学转染、电穿孔转染和病毒载体转染。
1.预处理细胞：将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到适宜的生长状态。
2.DNA和转染试剂处理：将外源DNA与转染试剂（如转染剂、细胞渗透剂等）共同孵育，以增加DNA进入细胞的效率。
3.转染：将DNA和转染试剂的混合物加入到细胞培养物中，启动转染过程。
不同的转染方法有不同的具体操作步骤，如化学转染通过溶液浸泡法将DNA引入细胞，电穿孔转染通过电脉冲打开细胞膜孔，病毒载体转染通过病毒感染细胞等。
4.培养和筛选：将转染后的细胞培养在适宜的培养条件下，保证其正常生长。
根据转移的DNA携带的标记或筛选标志基因，使用特定的培养基或抗生素进行筛选。
5.鉴定：通过PCR、蛋白质表达分析、荧光染色等方法检测外源DNA 是否成功进入细胞，并得到所需的表达或功能。
综上所述，质粒转化和细胞转染是两种将外源DNA引入到细胞中的常见方法。
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。
细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。
目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。
1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。
质粒转染实验步骤
质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
2.从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。
3.加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
4.42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
5.向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。
6.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。
同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
真核细胞转染操作方法——【感受态细胞的制备及其转化技术】
真核细胞转染操作方法一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。
由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。
利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：(1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。
(2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。
(3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况。
(5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。
(6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为mRNA的基因组序列得到表达。
(7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。
DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。
目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。
进行真核转染的一般程序：1克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。
基因编辑质粒转录转染细胞方法
基因编辑质粒转染细胞方法基因编辑载体/体外转录RNA可以使用多种转染试剂进行转染：1) 以24 孔培养板操作为例，转染前一天，将0.5~2×10 5个细胞接种于培养板中，每孔中加入约500 μL 无抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50％；2) 取1 μL/ 孔Lipofectamine2000（使用前轻轻摇匀），用50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释。
轻轻混和后在室温孵育5 分钟；3) 取1 μg 质粒载体/ 体外转录RNA，用50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释，轻轻混和均匀;4) 稀释后的Lipofectamine2000 经过5 分钟孵育后，与稀释后的质粒载体/ 体外转录RNA 轻轻混和，室温静置20 分钟，以形成载体- 转染试剂混和物/RNA- 转染试剂混和物；注意：稀释后的Lipofectamine2000 尽量在25 分钟之内，和质粒载体/ 体外转录RNA 混和，如果放置时间过长，可能导致转染试剂活性的降低。
5) 将载体- 转染试剂混和液/RNA- 转染试剂混和物加入含有细胞及培养液（约含400 μL）的孔中，轻轻摇晃孔板，使其混和；6) 在37 ℃的CO 2 培养箱中培养，4~6 小时后可将培养基换为含血清的完全培养基( 该步骤可以省略)；7) 如果载体含荧光基因，转染24 小时后即可在荧光显微镜下观察到荧光，一般转染后72 小时，收集细胞检测突变。
转染24~48小时后可利用载体表达荧光，通过流式细胞仪富集转染细胞，或通过载体表达puro，通过抗性富集转染细胞。
如果体外转录RNA 为荧光基因mRNA，转染6 小时后即可在荧光显微镜下观察到荧光，24~48 小时荧光强度较强，48 小时之后荧光强度逐渐降低，到120 小时基本消失。
注：体外转录RNA 转染细胞时使用无RNase 枪尖及EP 管。
质粒的转化及转染
质粒的转化转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。
这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种；转化的研究不但在理论上有重要意义，而且在基因工程中是将质粒或病毒载体引入宿主细胞的一种重要手段。
质粒转化的目的：将质粒转入细菌内以便获得更多的质粒，达到扩增的目的。
1、从－80℃冰箱中取出感受态的细菌在冰上融化。
（感受态下的细菌更容易接受外源性的DNA）2、打开大实验室（千万不可拿进细胞房，天敌）的细菌专用超净操作台的紫外灯灭菌10min。
3、打开水浴锅加热，温度设置为42℃。
4、取若干EP管，标记后，每EP管中加入50μL的菌液。
如質粒難抽，則加大用量。
5、每EP管加入2.5μL的质粒后打匀，动作要轻柔，感受态细菌比较脆弱。
6、将EP管放在冰上孵育25min。
7、将EP管插入浮萍放入42℃水浴锅加热60s（要求时间绝对精确）。
8、将EP管插入冰块90s。
9、每EP管加入1ml细菌培养基后放入大摇床上摇45min（大摇床带有加热功能，温度为37℃）。
10、将Amp细菌培养板（培养基预先加入Amp）放入细菌培养箱中加热至37℃。
11、将枪头预先折弯，吸入菌液后均匀涂在细菌培养板上。
（每盘100μ）12、待液体稍干后将细菌培养板倒置放入细菌培养箱中12—16h。
（过夜）（倒置的目的是为了液体影响细菌生长，另外液体影响观察单克隆体）Amp青霉素（氨苄青霉素Ampicillin）：目的并不是为了灭菌，Amp本身就是抗生素，而是用它来筛菌。
是一种抗生素。
为广谱半合成青霉素，毒性极低。
抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。
对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉素相同。
对肠球菌及李司忒菌的作用则优于苄青霉素。
对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉素酶的细菌均无抗菌作用。
转化 转染 质粒提取等步骤
转化步骤1.取5μl的连接产物到1.5ml离心管中，放置于冰盒中，余下连接产物放回4°C冰箱保存。
2.从-70°C冰箱中取出trans-5α感受态细胞转化菌种，迅速放置于冰盒上，在冰上解冻，待到感受态细胞刚刚融化，取50μl加入到盛有连接产物的离心管中。
3.轻柔晃动离心管，冰上放置30 min。
4.在42℃水浴锅中热激45s，立刻放置于冰上2 min。
5.提前将超净台紫外灯打开，杀菌15min。
6.在超净台中往盛有热激过的感受态细胞的离心管中加入500μl LB培养基，209转/min,37℃摇床培养一个半小时至离心管中液体呈现雾状。
PEI（聚乙烯亚胺）转染（对于35mm培养皿而言）1、待细胞生长24h ，贴壁80%时开始转染；2、提前30min 37℃预热OPTI-MEM培养基；3、稀释好用于转染的质粒至1ug/ul，一般转染1ug；4、加入100ul OPTI-MEM于1.5ml 离心管中；5、加入质粒DNA，混匀；6、加入PEI（DNA：PEI=1（ug）：2（ul）），立即混匀（一定要马上混匀）；7、室温静置15min；8、向离心管中补加opti-MEM至1ml；9、细胞培养液弃旧液，D.Hanks 洗一遍，加入转染液，稍晃下培养皿使其均匀分布；10、4h 后，向细胞培养皿中补加1ml 含20%FBS 无PS的培养基；11、37℃5%CO2培养箱培养24h。
Lipo2000转染（对于35mm培养皿而言）1、待细胞生长24h ，贴壁80%时开始转染；2、提前30min 37℃预热OPTI-MEM培养基；3、稀释好用于转染的质粒至1ug/ul，一般转染1ug；4、取1个1.5ml离心管，标注为lipo2000，加入200ulOPTI-MEM，及适量lipo2000（DNA：lipo2000=1（ug）：2.5（ul）），室温放置5min（注意：lipo2000加到液面以下，不能加到壁上）；5、质粒及lipo2000混合，混匀，室温放置20min；6、追加opti-MEM至1ml；7、细胞培养液弃旧液，D.Hanks 洗一遍，加入转染液，稍晃下培养皿使其均匀分布；8、4-6h 后，更换DMEM+10%FBS培养基（不含PS）；碱裂解法提质粒1.取检验正确的PCR管对应的试管，提取质粒。
质粒转染细胞的原理和方法
质粒转染细胞的原理和方法
质粒转染细胞是一种常用的实验技术，用于将外源DNA导入到细胞中，使其表达或编辑目标基因。
下面是质粒转染细胞的原理和方法。
原理：
质粒转染的原理基于细胞膜是一个有电荷的脂质双层结构，而DNA带有负电荷。
通过外源性方法，如化学法、电穿孔法或矢量法等，在细胞膜上形成孔隙，从而使DNA能够穿过细胞膜进入细胞质。
一旦进入细胞质，质粒DNA可以通过细胞的DNA修复机制，如非同源末端连接或同源重组等方式稳定地导入细胞核。
方法：
1. 化学法：常用的化学转染方法包括钙磷法和聚合物转染法。
钙磷法中，将质粒DNA与钙盐共沉淀后加入细胞培养基中，利用钙离子与DNA结合形成颗粒，然后通过细胞膜内吞作用将DNA转运入细胞。
聚合物转染法中，质粒DNA与聚合物复合后形成纳米颗粒，然后通过电静力吸引力或细胞膜内吞作用内入细胞。
2. 电穿孔法：通过外源电场作用于细胞，使细胞膜产生短暂的微孔，从而使质粒DNA能够进入细胞。
电穿孔法可通过电击、电泳或仪器辅助技术实现。
3. 载体法：将质粒DNA与细菌或病毒等载体结合，形成复合物，然后通过载体的侵入特性将质粒DNA导入细胞内。
常用的载体法包括细菌介导的转染、病毒介导的转染等。
以上是质粒转染细胞的原理和常用方法。
不同方法具有各自的优势和适用范围，选择合适的方法取决于实验目的和研究对象。
转染质粒步骤
转染质粒步骤嘿，你问转染质粒步骤啊？那咱就来好好说说。
这转染质粒啊，可得小心仔细地来。
首先呢，得准备好要转染的质粒和细胞。
质粒就像是一个小包裹，里面装着我们想要送进细胞的东西。
细胞呢，就像是一个小房子，我们要把质粒送进去让它发挥作用。
把质粒和细胞都准备好，放在合适的地方，就像准备好要去旅行的行李和目的地一样。
然后呢，要选择合适的转染试剂。
转染试剂就像是一个小快递员，能把质粒送进细胞里。
有很多种转染试剂可以选择，得根据自己的实验需求来挑。
就像你去寄快递，得选一个靠谱的快递公司一样。
接着，把质粒和转染试剂混合在一起。
这时候要注意比例哦，不能太多也不能太少。
就像做菜放盐一样，得放得恰到好处。
把它们混合好后，让它们在一起待一会儿，就像让两个新朋友互相认识一下。
然后把混合好的质粒和转染试剂加到细胞里。
可以用移液器慢慢地加，不能太急。
就像给花浇水一样，要轻轻地浇。
加完后，把细胞放在合适的环境里，让它们好好相处。
在这个过程中，要注意观察细胞的状态。
看看它们有没有不舒服，有没有出问题。
就像你照顾一个小宠物一样，要时刻关注它的情况。
打个比方吧，转染质粒就像给细胞送一个神秘的礼物，每一步都得小心谨慎。
我给你讲个例子哈。
我有个朋友在实验室做转染质粒的实验。
一开始他不太会，弄得手忙脚乱的。
后来他认真学习了步骤，一步一步来，终于成功了。
他可高兴了，觉得自己像个小魔法师。
从那以后，他对转染质粒的步骤记得牢牢的。
所以啊，转染质粒的步骤很重要呢，大家做实验的时候一定要认真仔细。
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质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。