流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制

流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制

摘要】流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等基础医学和临床医学的研究中，并提供了成熟的临床常规检测项目。流式细胞术广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。

【关键词】流式细胞术；免疫荧光染色；质量控制

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）15-0026-02

流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（IQc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。现对免疫荧光染色的质量控制方法进行分析如下。

1.单克隆抗体和荧光素

流式细胞术免疫荧光染色分析所用的荧光探针来源于两方面：一是荧光素标记的单克隆抗体或探针，二是单纯的荧光素。

1.1 单克隆抗体的选择

用于流式细胞术测定的单克隆抗体可分为两类，即直标抗体和纯抗体，前者指单克隆抗体与荧光素已按比例连接，不需要二次染色即可直接用于流式细胞仪测定，这类抗体产生的非特异性结合较少，适于临床常规检测[1]。纯抗体是指抗体本身不连接有荧光素，需要在标本制备过程中对抗体进行荧光素标记，又称间接染色，间接染色容易产生较多的非特异性荧光信号，可用于研究，但不建议临床常规使用，除非抗体是明确标志的体外诊断（IVD）试剂或分析特异性（ASR）试剂。

1.2 抗体组合的原则

有些情况下，一种荧光抗体的单一免疫荧光染色(单染色法)不能满足临床检测的要求，往往需要两种或以上荧光抗体组合染色进行双色或多色分析。如在进行T4或T8淋巴细胞亚群分析时，不能采用单一的荧光素标记的CD4或CD8抗体进行荧光染色，必须将二者与CD3抗体进行组合染色，才能准确通过

CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4-CD8+组合抗体检测到的细胞群来分析T4和T8细胞亚群。

1.3 单克隆抗体的质量控制

（1）IVD抗体和ASR试剂是临床常规项目的首选抗体，其特异性、灵敏度、精密度和适用范围均符合临床常规的流式细胞术检测要求。（2）商品化质控物可以帮助监测部分单克隆抗体的检测效率，现有的商品化室内质控物主要是针对淋巴细胞系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数及细胞绝对荧光强度的监控[2]。（3）部分抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，因此，实验室可以自做阳性或阴性质控物以检测抗体的质量。

2.免疫荧光染色和质量控制

2.1 细胞膜免疫荧光染色

目前，大多数流式细胞术免疫表型分析主要是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。为保证细胞膜表面抗原活性不被破坏和

防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰，在进行细胞膜染色时，应特别注意正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液。除非在绝对计数抗原表达量时不能改变初始细胞浓度，否则，建议红细胞裂解或分离后至少洗涤1次，以减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰。

2.2 细胞内免疫荧光染色

有些细胞内抗原的表达情况对疾病的诊断和预后判断非常重要，如细胞内髓性过氧化物酶(MPO)、CD3和CD79a的表达可以帮助白血病免疫分型。采用荧光索或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法，称为细胞内免疫荧光染色。细胞内染色的关键是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性，细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记，同时，抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合力不受固定和透膜的影响。皂角素是目前用于分析细胞内抗原表达的较好的破膜剂，70%冷乙醇作为破膜剂通常用于荧光染料PI与细胞内 DNA结合分析细胞倍体和周期时相，但细胞内染色不能与细胞活性检测同时进行[3]。某些情况下，当荧光染料分子的颗粒足够小时，细胞内染色不需要破膜也可以进行，如活细胞染料DAPI、TO和AO等对细胞内核酸的染色。

3.讨论

3.1 制备样本的保存

为避免荧光淬灭，无论是细胞膜染色还是细胞内染色，整个荧光染色过程和流式细胞仪测定前都需要避光；染色完成后标本保存在4℃下并尽快在4小时内完成测定。如不能在短时间内测定，可保存在终浓度为1％多聚甲醛溶液中达72小时；

3.2 对照设置

对照可以分为两类，一类对照用于设定流式细胞仪的检测阈值，包括同型对照、空白对照和正常对照等；另一类对照用于监测抗体和试剂的质量及整个实验过程，类似于质控品，包括阳性对照、阴性对照和正常对照等。①同型对照：理论上是理想的对照，主要用于监测细胞自发荧光和抗体的非特异结合，但实际使用时同型对照与测试抗体对细胞的标记偶尔会出现偏差，尤其对表达量很低的抗原进行细胞计数时；②空白对照：主要用于监测细胞的自发荧光，在无法设置同型对照时，可采用空白对照设置检测阈值，如采用荧光素TO对网织红细胞染色时。同型对照或空白对照通常在每个实验组进行流式细胞仪测定时都需要设定，以本人多年的体会，这两种对照都不是绝对的“对照”，只能作为一种参考，在某些情况下，如阴性峰和阳性峰分界很清楚时，对照的作用不是很大；③阳性对照和阴性对照：对于某些实验无法得到商品化质控品时，必须设置实验室内阳性对照和阴性对照用于监测整个实验过程。如针对PNH诊断进行CD55和CD59计数和针对血小板无力症和巨大血小板综合征进行血小板膜糖蛋白检测时，必须设置来源于健康人的标本作为阳性对照。④正常对照：除具有质控品的作用外，正常对照在某些实验中也起到设定阈值的作用，如在PI染色进行细胞周期和倍体分析时，正常淋巴细胞和鸡红细胞的二倍体峰所在位置决定了待测细胞倍体是否正常或异常。

【参考文献】

[1]何丽容，冯海林.流式细胞仪的保养和常见故障的排除[J].分子诊断与治疗

杂志.2000(2):32-33.

[2]何怡青，刘鷖雯，高锋.双质控法在流式细胞分析室内质量控制中的应用[J].