流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。
本文将探讨流式细胞术的质量控制。
1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。
对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。
（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。
在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。
（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。
应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。
2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。
为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。
具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。
（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。
（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。
3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。
（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。
（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。
同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。
4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。
为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。
免疫荧光间接法流式细胞法
免疫荧光间接法流式细胞法引言免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞学技术，通过结合免疫荧光染色和流式细胞术，能够快速、准确地分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况。
本文将介绍该方法的原理、步骤以及应用领域。
一、原理免疫荧光间接法流式细胞法基于免疫荧光染色的原理，利用免疫学技术中的特异性抗原与抗体结合的原理，将标记有荧光物质的二抗与目标细胞上的特定抗原结合，通过流式细胞仪的激光器激发荧光物质，从而实现对细胞的定量和定位分析。
二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样本收集并处理，如血液样本需要进行红细胞溶解，组织样本需要进行细胞分离等。
2. 免疫反应：将细胞与特异性的一抗进行孵育，使一抗与细胞表面或内部的特定抗原结合。
3. 洗涤：用含有缓冲剂的洗涤液洗去未结合的一抗。
4. 二抗结合：加入标记有荧光物质的二抗，使其与一抗结合。
5. 洗涤：用洗涤液洗去未结合的二抗。
6. 流式细胞术：将样本放入流式细胞仪中，通过激光激发荧光物质，收集并分析细胞的荧光信号。
三、应用领域免疫荧光间接法流式细胞法在许多领域都有广泛应用。
1. 免疫学研究：该方法可用于分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况，从而研究免疫细胞的功能和相互作用机制。
2. 肿瘤学研究：通过检测肿瘤细胞上的特异性抗原，可以实现肿瘤细胞的鉴定和分类，进而指导肿瘤的诊断和治疗。
3. 感染病原体检测：该方法可用于检测感染病原体在宿主细胞中的定位和表达水平，为感染病原体的诊断和治疗提供重要依据。
4. 免疫监测：通过定量分析细胞表面的特定抗原，可以评估免疫功能的状态，如淋巴细胞亚群的分析、免疫细胞活化的检测等。
5. 药物研发：该方法可用于评估药物对细胞表面或内部蛋白质的影响，为药物研发提供重要参考。
结论免疫荧光间接法流式细胞法是一种快速、准确的细胞学技术，通过免疫荧光染色和流式细胞术的结合，能够对细胞表面或内部的蛋白质表达进行分析。
该方法在免疫学研究、肿瘤学研究、感染病原体检测、免疫监测以及药物研发等领域有着广泛的应用前景。
流式细胞术的质量控制
⑷ DNA二倍体标准不稳定，Schutter等发现用新鲜正 常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞 DNA含量 (例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为石蜡包埋组 织细胞DNA含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新 鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度 不稳定，解决DNA二倍体标准不稳定的办法，可将 正常组织与肿瘤组织作为一个内标的二倍体标准参 照，可减少DNA倍体分析的误差，对存档中的石蜡 包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本， 作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二 倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品(例如鸡血细 胞等)。
流式细胞术的质量控 制和影响因素
河北省肿瘤研究所 左连富
一、标本的采集和固定方法的质量控制
标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程， 需注意： ①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要 避免出血坏死组织。 ②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织 发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。 ③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。
ห้องสมุดไป่ตู้
在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石 蜡可，影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的 方法是弃去二甲苯(Hedley强调用Histoclear，即 组织清洗剂代替二甲苯脱蜡，效果更好)，加入 100%乙醇，如果无絮状物浮起，示蜡已脱净 梯度酒精(100% 70% 50%)水化要充分,使组织还 原到与新鲜组织相似的状态。 消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不 造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间 短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又 被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用 0.5%胃蛋白酶PH 1.5。
二、单细胞悬液制备的质量控制
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制介绍:流式细胞术是一种广泛应用于生物学研究中的实验技术。
它利用机器读取细胞表面或细胞内的特定标记以获得细胞的详细信息。
在进行流式细胞术之前，需要进行一系列的质量控制步骤来确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍流式细胞术中的质量控制步骤。
⒈样本制备和处理⑴样本收集和保存●确保样本采集时的准确性和一致性，尽量避免引起细胞损伤或死亡的因素。
●根据所选择的荧光探针或抗体，选择合适的保存液保存样本，并按照推荐的存储温度和时间进行保存。
⑵细胞处理●避免细胞在处理过程中受到机械或酶的损伤。
选择适当的细胞处理方法（如胶凝、裂解或染色）。
⒉样本质量控制⑴细胞数目和浓度●使用细胞计数仪或显微镜对观察区域内的细胞进行计数，并计算细胞的浓度。
⑵细胞活性●使用细胞活性染料（如细胞渗透性染料）检测细胞的活性。
确保细胞在实验过程中保持完整和活跃。
⑶细胞纯度●利用细胞表面标记物或细胞核染色物进行细胞表型分析，以检测细胞样品中的污染物。
⑷细胞均一性●对样本进行混合和搅拌，确保细胞在整个样本中均匀分布。
⒊仪器校准和控制⑴流式细胞仪校准●使用流式细胞仪提供的校准粒子进行仪器校准，包括流速、散射光校准和荧光信号校准等。
⑵仪器控制●使用流式细胞仪的软件设置合适的参数，如触发门、荧光通道选择和数据采集速率。
⒋数据分析和解释⑴数据收集●使用流式细胞仪采集样本数据，并确保数据的完整性和正确性。
⑵数据分析●使用专业的数据分析软件对采集到的数据进行分析和解释。
⑶数据报告●根据实验需求和要求，使用适当的图形、表格和文本来呈现数据结果。
附件：⒈样本收集和保存记录表⒉样本质量控制记录表⒊仪器校准记录表法律名词及注释：⒈样本：指用于流式细胞术的生物样本，如细胞悬液或洗涤液。
⒉流式细胞仪：一种用于分析和计数细胞的仪器，透过仪器对细胞进行流式测量。
⒊标记物：用于识别和分析特定细胞类型或分子的抗体或染料。
⒋数据分析软件：用于处理流式细胞术数据并图形和数据表的计算机程序。
流式细胞仪的简要介绍与注意事项
流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)来源：评论：0我要评论[流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
[关键词:流式细胞仪注意事项]…••一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
二、流式细胞仪的临床应用1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
三、流式细胞仪的科研应用主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
四、流式细胞术常规检测时的样品制备(一) 直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
流式细胞术质量控
流式细胞术质量控预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制一、流式细胞术常规项目操作流程二、样本采集和处理些？荧光染色的两种方法意义和注意事项是什么？三、免疫荧光染色3．单克隆抗体的质量控制IVD抗体和ASR试剂，是临床常规项目的首选抗体，性能参数符合临床常规检测要求，已经对两种抗体的特异性、灵敏度、精密度、适用范围进行了验证。
对于商品化质控物可以帮助监测部分单抗的检测效率，如淋系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数、细胞绝对荧光强度、阳性表达、可以作为CD55和CD59抗体的阳性对照和室内质控物。
对于自做阳性或阴性质控物，监测单克隆抗体的质量。
因为有些抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，如健康人红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59，在正常人中是阳性表达，可作为阳性对照和室内质控物。
（二）荧光染色方法1．细胞膜免疫荧光染色大多数免疫表型分析是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。
正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液的目的，保证细胞膜表面抗原活性不被破坏；防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰。
注意事项：红细胞裂解或分离后至少洗涤1次；减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰；进行绝对计数抗原表达量时，不能洗涤红细胞裂解液，因不能改变初始细胞浓度。
2．细胞内免疫荧光染色细胞内免疫荧光染色是采用荧光素或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法。
他的意义在于诊断疾病和判断预后；细胞内髓性过氧化物酶（MPO）、CD3和CD79a的表达帮助白血病免疫分型。
细胞内染色的关键之处，是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性；细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记；确保固定和透膜的步骤不影响抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合。
细胞内免疫荧光染色的破膜剂有皂角素和70％冷乙醇，皂角素最常用最稳定。
流式细胞仪分析技术
二、数据显示方式
直分析方图 • 单参数直方图 • 双参数直方图:点图 双参数直方图: 二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析 设门分析: 设门分析:REGION和GATE设置 和 设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光) 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 构成， 构成 强度的颗粒数量的多少。 强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 双参数直方图： 量细胞的两个测量参数， 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。 就可以确定细胞在图上的表达位置。 • 双参数信号通常采用对数信号，最常用的 双参数信号通常采用对数信号， 通常采用对数信号 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。 强度的颗粒数量的多少。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动 流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴 不充电 弃去
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。
液中细胞的含量成正比。 液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞 分选纯度：
FS） 激光束照射细胞时， 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 (0.5° 10° 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比
流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
• 功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最 终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
CD4 T cells/ml
Infection
Seroconversion
1000
500 200
0 2-6 weeks
Flu-like Disease
HAART
Death
CD4 T cell depletion
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptom-atic
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为 进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
任意值 <200 <100 <75 <50
主要机会性感染的预防
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性） MAC
CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
荧光染料的特性及应用简介
2.荧光染料
荧光染料是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长 大于吸收光的光波的物质，更具体地说，当荧光染料吸收来 自光源的光时，它们被暂时激发(能量增加的状态)，然后以 光的形式发射能量以恢复到基态。这种发射的光可以被收集 和识别，使研究人员能够通过发射光的波长识别他们看到的 荧光染料。
选择荧光素（染料）的原则
W
① 尽量选择一些可以应用于所拥有的流式细胞
仪而又亮度高的荧光素。例如PE，作为最亮
的荧光素而被首选。但如果所用的细胞样本
D
具有很强的自发荧光时，不推荐用PE;此时可
以选择APC，也能产生最亮的荧光。荧光素
的强弱用染色指数(stain index)(右图) 来判断，
指的是阳性群峰值与阴性群峰值的差别与阴
5. 7- AAD 最大发射波长为647nm，大部分仪器是在FL3通道检测，可用于鉴别死、 活细胞。
6. 别藻青蛋白（APC ) 最大发射波长为660nm，一般在流式细胞仪的FL4通道检 测；其标记的抗体使用与所有配备氦氖激光器的FCM。
用于标记抗体的理想荧光染料应满足一下要求：
① 具有高的光子产量，信号强度高 ② 对激发光有较强的吸收，降低背景信号 ③ 激发光谱和发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰 ④ 易于被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物的特异性 ⑤ 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂等的影响
荧光染料的特性及应用简介
● 荧光染料是流式实验中的重要组成部分之一， 使用荧光染料标记的抗体被广泛应用于免疫学实验 中，包括检测细胞或颗粒表面的特定抗原、细胞表 型和功能分析等，荧光染料工作原理是发出荧光， 接下来，将和大家从四方面分享荧光染料的知识。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制1、引言1.1 背景1.2 目的1.3 范围2、流式细胞术概述2.1 原理2.2 流程2.2.1 样本准备2.2.2 样本标记2.2.3 流式细胞仪设置2.2.4 数据采集2.2.5 数据分析3、质量控制流程3.1 样本质量控制3.1.1 样本准备的要求3.1.2 样本处理的注意事项 3.2 仪器质量控制3.2.1 日常仪器维护3.2.2 校准珠的使用3.3 标记质量控制3.3.1 阴性对照样本的选取 3.3.2 正性对照样本的选取 3.3.3 标记反应的优化3.4 数据质量控制3.4.1 检查数据完整性3.4.2 数据质量评估3.4.3 数据异常处理4、质量控制指标4.1 样本接受率4.2 样本处理成功率4.3 仪器运行状况4.4 标记反应效果4.5 数据完整性4.6 数据准确性5、质量控制记录5.1 样本质量控制记录5.2 仪器质量控制记录5.3 标记质量控制记录5.4 数据质量控制记录6、附件附件1、样本准备要求清单附件2、仪器维护流程图附件3、标记质量控制对照表附件4、数据质量评估标准注释:法律名词及其注释1、流式细胞术：一种利用流式细胞仪对细胞进行分析和排序的技术。
2、质量控制：指采取一系列措施，确保流式细胞术过程中的样本、仪器、标记和数据的质量达到一定要求。
3、样本准备要求清单：包括对样本的收集、保存、处理等要求的清单。
4、仪器维护流程图：说明日常仪器维护的步骤和方法的流程图。
5、标记质量控制对照表：记录每次标记实验中所选用的阴性对照样本、正性对照样本和标记条件的表格。
6、数据质量评估标准：用于评估数据质量的标准，包括数据完整性、数据准确性等指标。
\。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的细胞分析技术。
它通过利用光传感器和激光来检测细胞悬浮液中的细胞数量、大小、形态和表面标记物等信息，从而实现对细胞的分析和分类。
为了保障流式细胞术的准确性和可重复性，质量控制是非常重要的。
样本制备的质量控制在进行流式细胞术之前，样本制备是流式细胞术质量控制的第一步。
样本质量对于结果的准确性和可重复性至关重要。
以下是一些常见的样本制备质量控制步骤：细胞样品准备细胞浓度的准确计数：使用细胞计数仪准确计数细胞数目，以确保每个样本含有足够数量的细胞进行分析。
细胞的适当处理：根据不同实验要求，对细胞进行适当的处理，如洗涤、培养基的选择等，以确保细胞状态的一致性。
样品标记物的质量控制标记物的选择：根据实验需要，选择合适的标记物，并确保其特异性、亲和力和荧光强度等符合要求。
样品标记物的浓度和时间：对于标记物的浓度和反应时间进行优化，避免过高或过低的浓度导致信号失真或信号强度不足。
流式细胞仪的质量控制流式细胞仪作为流式细胞术的核心仪器，其性能的稳定和准确也是流式细胞术质量控制的关键。
以下是常见的流式细胞仪质量控制步骤：光谱校正与补偿荧光信号校正：使用校正颗粒进行荧光信号校正，校正光谱重叠和荧光强度的变化，以提高结果的准确性。
荧光信号补偿：通过对不同通道之间的荧光信号进行补偿，避免荧光信号之间的交叉干扰，确保结果的准确性。
流速标定流速标定：使用标定颗粒进行流速标定，保证流速的准确性，以便对细胞进行准确的定位和计数。
指标质量控制正质量控制：使用已知正样本进行实验，确保仪器的稳定性和结果的准确性。
负质量控制：使用未标记的负样本进行实验，排除背景信号和非特异性结合，保证结果的准确性。
识别和排除异物：通过故障检查和核查流式细胞术结果，识别和排除可能存在的污染源和异常情况。
数据分析的质量控制流式细胞术之后，对数据的准确分析和解读也是质量控制的重要环节。
免疫荧光间接法流式细胞法
免疫荧光间接法流式细胞法免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞分析技术，它能够在单个细胞水平上分析和检测特定分子的表达情况。
该方法结合了免疫荧光技术和流式细胞术的优势，具有高灵敏度和高通量的特点，被广泛应用于生命科学研究和临床诊断。
在免疫荧光间接法流式细胞法中，首先需要标记特定的抗原或抗体。
抗原可以是细胞表面的蛋白质、糖蛋白或其他分子，抗体则是针对这些抗原的特异性抗体。
标记通常选择荧光染料，如荧光素、荧光蛋白等，这些染料能够发出特定颜色的荧光信号。
标记抗原或抗体后，将其与待测样品中的细胞混合，使其充分反应。
接着，通过流式细胞仪进行检测和分析。
流式细胞仪是一种能够对单个细胞进行快速检测和分析的仪器，它能够测量细胞的形态、大小、荧光强度等多个参数。
在流式细胞仪中，待测样品会被分散成单个细胞，并通过激光器照射。
当标记有荧光的抗原或抗体与细胞结合时，会产生荧光信号。
流式细胞仪会通过光学装置收集并分析这些信号，根据荧光信号的强度和颜色，可以确定细胞中特定分子的表达情况。
免疫荧光间接法流式细胞法在生命科学研究中有着广泛的应用。
例如，在免疫学研究中，可以用该方法来检测细胞表面的抗原表达情况，从而研究免疫反应的机制和调控。
在肿瘤学研究中，该方法可以用于检测肿瘤细胞的特异性抗原表达，从而辅助肿瘤的诊断和治疗。
免疫荧光间接法流式细胞法还可以用于临床诊断。
例如，在血液学中，可以通过该方法检测白细胞的表型，从而帮助诊断和监测血液相关疾病。
在免疫缺陷病的诊断中，该方法可以用于检测免疫细胞的表面分子表达情况，评估免疫功能的状态。
总结起来，免疫荧光间接法流式细胞法是一种高灵敏度、高通量的细胞分析技术，通过标记和检测特定抗原或抗体，能够在单个细胞水平上分析和检测特定分子的表达情况。
该方法在生命科学研究和临床诊断中有着广泛的应用前景，为科学研究和医学诊断提供了强有力的工具。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制一、引言流式细胞术是一种重要的细胞分析技术，可以用于细胞计数、细胞表型分析和细胞排序等。
在进行流式细胞术之前，进行质量控制是非常重要的，以确保实验的准确性和可靠性。
本文将详细介绍流式细胞术的质量控制方法。
二、仪器校准1-流式细胞仪校准●清洁流式细胞仪的样品室，并检查激光器和光路系统是否正常工作。
●使用粒子标准物质检查细胞仪的散射、荧光和时间参数的准确性。
●清洗和校准流式细胞仪的液体系统，确保流速和样本量的准确控制。
2-样品准备●均匀悬浮细胞样本，避免细胞团聚和沉积。
可通过离心和重新悬浮样本来实现。
●使用质量可靠的细胞染色方法，确保染色的准确性和一致性。
●调整样本的浓度，以避免过度聚焦和细胞过于稀疏而损失信号。
三、质量控制指标1-样本纯度的质量控制●使用合适的负对照和正对照来评估染色的纯度。
例如，使用未染色细胞作为负对照，使用已知阳性标记的细胞作为正对照。
●定期检查染色结果的一致性，确保负对照细胞没有阳性标记，正对照细胞有预期的阳性标记。
2-流式细胞仪性能的质量控制●定期检查流式细胞仪的性能参数，包括散射灵敏度、荧光检测灵敏度和时间分辨率。
●使用校准颗粒检验流速的准确性和一致性。
●根据实验需要，使用合适的质检颗粒进行分辨率和强度的调整。
四、数据分析和结果解释1-数据质量控制●检查数据文件的完整性，确保数据文件包含所有需要的参数和样本。
●清除实验过程中的噪声信号和非特异性染色的细胞。
●根据预设的阈值和门控策略进行数据清洗和筛选。
2-数据解释和结果报告●根据实验的目的和结果，选择合适的数据可视化方法，如频率直方图、散点图或密度图等。
●在报告中注明样本总数、阳性细胞比例、细胞亚群的比例等相关指标。
●提供结果的解释和分析，例如细胞表型的变化趋势、不同实验组间的比较等。
五、附件附件1、样本染色方案附件2、流式细胞仪校准记录表附件3、数据分析结果表格六、法律名词及注释1-IRB：Institutional Review Board，即伦理审查委员会，负责审查人体试验和研究项目的合法性和伦理性问题。
免疫荧光染色的质量控制
免疫荧光染色的质量控制
单细胞悬液荧光染色关系着流式分析的精度，应特别注意染料的特性及量效关系，由于免疫荧光染色中还涉及抗体特异性及小家问题，应严格按照实验操作的要求进行。
1 温度对荧光染色的影响
环境温度的升高对荧光染色有明显的影响，可使溶液的粘滞性增加，荧光染料分子的动力增大，荧光淬灭的可能性增大，荧光分子的光子产量降低。
如保持温度在20°以下，光子产量的变化不受影响。
尽量减少染色样本的光照射时间，使检测时的荧光强度不受影响。
2PH对荧光发射强度的影响
不同的荧光染料对工作环境的PH要求各不相同，每一种荧光分子在溶液均以离子化状态存在，而溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响最大。
每种荧光染料的光子产量达到最大时，都与其最适PH密切相关。
3 荧光染料浓度的控制
合适的荧光染料浓度是荧光定量检测的最佳信号产生的重要技术指标。
在溶液浓度较稀时，荧光强度与浓度成正比关系，荧光强度随溶液中浓度加大而增强，但当达到一定浓度时，会因溶液中荧光染料分子的增加而增加相互碰撞，使荧光发生淬灭而致光子产量降低，反而使荧光强度减弱。
因此，为了产生最大荧光光子产量，在染色时应选择最适浓度。
4 固定剂对免疫荧光染色的影响
当细胞染色后不能及时上机检测时需进行固定，固定方法应对细胞的体积大小、细胞内分子结构特性、抗体生物学特性和荧光强度无较大影响。
流式细胞术质量控制
流式细胞术质量控制2010-01-08 14:04:03流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。
由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。
同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。
作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。
在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。
分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。
为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。
它包括质量保证、质量控制和质量评估。
质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。
主要利用质量控制和质量评估。
质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。
对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。
质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。
其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。
当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。
因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。
FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。
目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。
2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。
流式细胞术在白血病MICM分型诊断中的作用
50 000/秒(分选) 3：5个激光 4：24色荧光 5：无菌环境
FACSAria II 1：高速分选 2：分选精度1/32滴 3：3个激光 4：13色荧光 5：仪器随开随用
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FCM原理（动画）
FACSCalibur光路图
但是，流式免疫分型结果的解释应与临床、形态学、细胞遗传学等其他方 法结合使用，综合考虑，做出疾病的诊断与分类。
正常血细胞发育过程的抗原表达规律
按《WHO造血和淋巴组织肿瘤分类》（2008年版）
Wood B,etc（2007）
急性白血病的免疫表型
急性髓细胞白血病的免疫表型
细胞碎片
单核细胞
淋巴细胞
阈值
检测信号及意义：
荧光信号 根据荧光素交联的单克隆抗体不同而表达不同的意义
（一）设门 （gating）
（二）荧光强度 （三）单参数分析 （四）多参数分析
二、数据解释及报告
1.定性的描述（阳性或阴性）
2.评估抗原表达强度
3. 区分弱阳性和阴性群体
运用流式分析造血细胞的抗原表达情况，远远多于对形态学结果的简单证 实，能够提供大量的信息，可能帮助形态学确认某些诊断，也可能提出之前 没有考虑的诊断；在一些典型表现下，流式免疫分型可以在其他方法的辅助 之下诊断疾病。
Hale Waihona Puke 免疫分型的抗体组合原则免疫分型的抗体组合原则
一、常用抗体
白细胞分化抗原（leukocyte differentiation antigen）是指血细胞在分化成熟 为不同谱系、不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。
1982年，国际统一使用分化群（cluster of differentiation，CD）作为白细胞 分化抗原和相应单克隆抗体的命名，CD分子在流式细胞术的血液学应用中发挥着 重要作用。
流式细胞仪结果分析.
五、AIDS病检测中的应用
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎(As) 患者
七、移植免疫中的应用
藻青蛋白
别藻青蛋白 能量传递复 合染料
PC
APC PEcy5
488
633 488
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激 发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另 一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。
能量传递复合染料机制
575nm 488nm PE
（四）免疫检测的质控
• 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单 抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
• 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次
实验结果可靠。
第四节
在免疫学检验中的应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学 基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式 细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，
第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维 等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图
流式细胞仪分析技术及 应用
郝圆园
201731830
流式细胞术
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的 一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析
免疫荧光染色质量影响因素分析
免疫荧光染色质量影响因素分析作者：宋瑞龙周子彦徐天祺潘士锋刘宗平来源：《安徽农业科学》2019年第16期摘要免疫荧光技术是标记免疫技术中应用最为广泛的一项技术，具有特异性强、灵敏度高、速度快和便于观察等特点。
影响免疫荧光染色质量的因素多种多样，从荧光染料、抗体、样品前处理、染色过程等几个重要的方面入手，就如何提高免疫荧光染色质量，以获得一张高分辨率的图片做了详细的介绍。
该研究有利于提高免疫荧光染色质量，为生命科学研究提供了有力帮助。
关键词免疫荧光染色技术;抗体;影响因素中图分类号Q2-33文献标识码A文章编号0517-6611（2019）16-0124-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.036开放科学（资源服务）标识码（OSID）：InfluencingFactorsofQualityofImmunofluorescentStainingTechnologySONGRuilong，ZHOUZiyan，XUTianqietal（CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity/JiangsuCoinnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiou sDiseasesandZoonoses，Yangzhou，Jiangsu225009）AbstractAsoneofthemostwidelyusedimmunolabelingtechniques，immunofluorescencehasseveraladvantagesincludinghighspecificity，highsensitivity，rapiddetectionandclearpositioning.However，thequalityofimmunofluorescentstainingcouldbeaffectedbymultiplefactors，suchasfluorescentdyes，antibodies，samplepreparationandstainingprocess.Startingwiththosevitalfactors，weintroducedhowtoimprovethequalityofimmunofluorescentstainingsoastoobtainahighresolutionimagei ndetail.Thisstudyimprovedthequalityofimmunofluorescentstainingandprovidedpowerfulhelpforlifescie nceresearch.KeywordsImmunofluorescentcellstainingtechnology;Antibody;Influencingfactor免疫荧光染色技术是一种以免疫学为基础，结合生物化学技术和显微技术发展而来的蛋白等分子检测技术。
流式细胞仪检测技术与质量控制
流式细胞仪检测技术与质量控制【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比,技术上有很大的改进和突破。
流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视.它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。
【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术,是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。
该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应,利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。
本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。
当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠,目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法1。
1 标本收集收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁,最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体,将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。
由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的.2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针(SSO）在同一孔内进行特异性杂交,再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
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流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制
摘要】流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等基础医学和临床医学的研究中，并提供了成熟的临床常规检测项目。
流式细胞术广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。
【关键词】流式细胞术；免疫荧光染色；质量控制
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）15-0026-02
流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（IQc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
现对免疫荧光染色的质量控制方法进行分析如下。
1.单克隆抗体和荧光素
流式细胞术免疫荧光染色分析所用的荧光探针来源于两方面：一是荧光素标记的单克隆抗体或探针，二是单纯的荧光素。
1.1 单克隆抗体的选择
用于流式细胞术测定的单克隆抗体可分为两类，即直标抗体和纯抗体，前者指单克隆抗体与荧光素已按比例连接，不需要二次染色即可直接用于流式细胞仪测定，这类抗体产生的非特异性结合较少，适于临床常规检测[1]。
纯抗体是指抗体本身不连接有荧光素，需要在标本制备过程中对抗体进行荧光素标记，又称间接染色，间接染色容易产生较多的非特异性荧光信号，可用于研究，但不建议临床常规使用，除非抗体是明确标志的体外诊断（IVD）试剂或分析特异性（ASR）试剂。
1.2 抗体组合的原则
有些情况下，一种荧光抗体的单一免疫荧光染色(单染色法)不能满足临床检测的要求，往往需要两种或以上荧光抗体组合染色进行双色或多色分析。
如在进行T4或T8淋巴细胞亚群分析时，不能采用单一的荧光素标记的CD4或CD8抗体进行荧光染色，必须将二者与CD3抗体进行组合染色，才能准确通过
CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4-CD8+组合抗体检测到的细胞群来分析T4和T8细胞亚群。
1.3 单克隆抗体的质量控制
（1）IVD抗体和ASR试剂是临床常规项目的首选抗体，其特异性、灵敏度、精密度和适用范围均符合临床常规的流式细胞术检测要求。
（2）商品化质控物可以帮助监测部分单克隆抗体的检测效率，现有的商品化室内质控物主要是针对淋巴细胞系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数及细胞绝对荧光强度的监控[2]。
（3）部分抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，因此，实验室可以自做阳性或阴性质控物以检测抗体的质量。
2.免疫荧光染色和质量控制
2.1 细胞膜免疫荧光染色
目前，大多数流式细胞术免疫表型分析主要是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。
为保证细胞膜表面抗原活性不被破坏和
防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰，在进行细胞膜染色时，应特别注意正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液。
除非在绝对计数抗原表达量时不能改变初始细胞浓度，否则，建议红细胞裂解或分离后至少洗涤1次，以减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰。
2.2 细胞内免疫荧光染色
有些细胞内抗原的表达情况对疾病的诊断和预后判断非常重要，如细胞内髓性过氧化物酶(MPO)、CD3和CD79a的表达可以帮助白血病免疫分型。
采用荧光索或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法，称为细胞内免疫荧光染色。
细胞内染色的关键是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性，细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记，同时，抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合力不受固定和透膜的影响。
皂角素是目前用于分析细胞内抗原表达的较好的破膜剂，70%冷乙醇作为破膜剂通常用于荧光染料PI与细胞内 DNA结合分析细胞倍体和周期时相，但细胞内染色不能与细胞活性检测同时进行[3]。
某些情况下，当荧光染料分子的颗粒足够小时，细胞内染色不需要破膜也可以进行，如活细胞染料DAPI、TO和AO等对细胞内核酸的染色。
3.讨论
3.1 制备样本的保存
为避免荧光淬灭，无论是细胞膜染色还是细胞内染色，整个荧光染色过程和流式细胞仪测定前都需要避光；染色完成后标本保存在4℃下并尽快在4小时内完成测定。
如不能在短时间内测定，可保存在终浓度为1％多聚甲醛溶液中达72小时；
3.2 对照设置
对照可以分为两类，一类对照用于设定流式细胞仪的检测阈值，包括同型对照、空白对照和正常对照等；另一类对照用于监测抗体和试剂的质量及整个实验过程，类似于质控品，包括阳性对照、阴性对照和正常对照等。
①同型对照：理论上是理想的对照，主要用于监测细胞自发荧光和抗体的非特异结合，但实际使用时同型对照与测试抗体对细胞的标记偶尔会出现偏差，尤其对表达量很低的抗原进行细胞计数时；②空白对照：主要用于监测细胞的自发荧光，在无法设置同型对照时，可采用空白对照设置检测阈值，如采用荧光素TO对网织红细胞染色时。
同型对照或空白对照通常在每个实验组进行流式细胞仪测定时都需要设定，以本人多年的体会，这两种对照都不是绝对的“对照”，只能作为一种参考，在某些情况下，如阴性峰和阳性峰分界很清楚时，对照的作用不是很大；③阳性对照和阴性对照：对于某些实验无法得到商品化质控品时，必须设置实验室内阳性对照和阴性对照用于监测整个实验过程。
如针对PNH诊断进行CD55和CD59计数和针对血小板无力症和巨大血小板综合征进行血小板膜糖蛋白检测时，必须设置来源于健康人的标本作为阳性对照。
④正常对照：除具有质控品的作用外，正常对照在某些实验中也起到设定阈值的作用，如在PI染色进行细胞周期和倍体分析时，正常淋巴细胞和鸡红细胞的二倍体峰所在位置决定了待测细胞倍体是否正常或异常。
【参考文献】
[1]何丽容，冯海林.流式细胞仪的保养和常见故障的排除[J].分子诊断与治疗
杂志.2000(2):32-33.
[2]何怡青，刘鷖雯，高锋.双质控法在流式细胞分析室内质量控制中的应用[J].
检验医学.2008, 23(05):536-537.
[3]温厚津，陶家平.流式细胞术免疫荧光测量中的直标及间标[J].生物化学与生物物理进展.1995.22(02):159-162.。