4植物基因克隆的策略与方法
拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建
^8S^•研究报告・拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建韦春，杨莉琴，秦利军(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院,贵阳550025)摘要BRs(Brassinostcroids)是植物体内一种重要的类固醇激素，具有十分重要的生理功能。
DWF4是BRs生物合成的关键限速酶，显著影响BRs在植物体中的含量。
本研究以拟南芥(Araiidopsis thaliana)为材料，利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542bp的特异性条带，测序结果表明该条带为ADWF4基因；生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscalc在线预测该蛋白为亲水性蛋白，且SOPM分析表明DWF4蛋白含有c-螺旋(alpha-helix)、/?-折叠(beta-fold)、/?-转角(beta-angle)等多个二级结构。
同时，研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI201-RdI)wf4,并遗传转化烟草K326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。
本研究为进一步探究过表达ADWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。
关键词：拟南芥；BRs；DWF4基因；过表达载体构建DOI：10.16590,/ki.1001-4705.2021.01.001中图分类号：Q943.2文献标志码：A文章编号：1001-4705(2021)01-0001-06Cloning and Bioinformatics Analysis of Arabidopsis thaliana DWF4Gene and Construction of ADWF4-Overexpression VectorWEI Chun,YANG Liqin,QIN Lijun(Institute of Agro-Bioengineering,Key laboratory of Plant.Resources Conservation andGermplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)and College ofLife Sciences,Guizhou University,Guiyang550025,China)Abstract：BRs(Brassinosteroids)is an important steroid hormone in plants,which has very importantphysiological functions.The DWF4is a key rate-limiting enzymein BRs biosynthesis,which significantly affects the content of BRs in plants.In this study,Arabidopsis thaliana was used as the material to clone the objective band.The results showed that a1542bp band from A.thaliana cDNA wascloned and the sequencing results showed that the band was AtDWF4gene.Bioinformatics analysisshowed that this gene encoded513amino acid(aa),and Proscale online predicted that this proteinwas a hydrophilic protein,and SOPM analysis showed that DWF4protein contained multiple secondary structures,including tough-helix,format-fold,and format-angle,etc.Meanwhile,the overexpression vector pRI201-RdDwf4containing AtDWF4gene was also constructed,and the resistant callus and resistant buds were obtained after the genetic transformation of tobacco variety K326.ThispaperprovidesanidealexperimentalmaterialforfurtherstudyingtheinfluenceofoverexpressionofAtDWF4on tobacco morphology and stress tolerance.Key words:Arabidopsis thaliana;BRs;DWF4gene;overexpression vector construction收稿日期2020-08-26基金项目贵州省科技计划项目“因草钾离子通道蛋白及BR对植株抗非生物胁迫研究”(黔科合LH：2016]7449号)；贵大人才培育项目“由菜素内酯介导的烟草抗TMV机理研究”(黔科合平台人才：2018]5781号)作者简介：韦春(1995—),女(壮族)广西河池人；在读硕士，主要从事植物基因工程相关研究(E-mail：*****************).通讯作者：秦利军(1982—)男(汉族)贵州遵义人；博士，副教授，硕士生导师，研究方向：植物生物技术与植物基因工程(E-nail：leequine_chin@126.com)。
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
第五章第四节：植物数量性状QTL图位克隆方法剖析
The advantages of the sequential QTL fine-mapping strategy
To reduce experimental errors caused by both environmental factors and genetic background noise
K.Fengler et al., in press, Plant Genome
QTL精细定位—性状的准确鉴定
➢ 通过控制群体结构和后代测定等手段来消除遗 传背景的影响，同时增加重组机会。在目标 QTL区间建立高分辨率的分子标记图谱，分析 目标QTL与标记的连锁关系。
➢ 主要采用近等基因系(Near-isogenic lines, NILs) , 染色体片段代换系(chromosome segment substitution lines，CSSLs)或导 入系(introgression line, ILs), 及基于重组自 交系衍生的杂合自交家系(heterogeneous inbred family, HIF)或剩余杂合体(residual heterozygous line, RHL) 。
➢ 染色体不同区域重组频率的高低与着丝粒位置、 染色体结构、亲本在QTL区域的序列差异等均相 关。
玉米染色体的重组频率和基因密度分布
MZA Count Genetic Distance (cM)
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
0
0
300 250 200 150 100 50 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 Physical Distance (bands)
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
植物抗逆基因的克隆与功能研究
植物抗逆基因的克隆与功能研究在大自然的舞台上，植物面临着各种各样的生存挑战，如干旱、高温、低温、盐碱、病虫害等。
为了在恶劣的环境中生存和繁衍，植物进化出了一系列的抗逆机制。
其中，抗逆基因起着至关重要的作用。
对植物抗逆基因的克隆与功能研究，成为了当今植物学领域的一个重要课题。
植物抗逆基因的克隆是一项复杂而精细的工作。
首先，需要确定研究的目标抗逆性状。
这可能是某种植物在干旱条件下仍能保持生长的能力，或者是在高盐环境中不受到伤害的特性。
然后，通过各种技术手段，如基因芯片技术、转录组测序等，来筛选和鉴定与该抗逆性状相关的基因。
在克隆过程中，常常会用到一些分子生物学技术。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术可以用于扩增特定的基因片段。
还有基因文库的构建，将植物的基因组 DNA 切成片段，然后插入到载体中，形成一个包含众多基因的文库，再通过筛选和鉴定，找到目标抗逆基因。
一旦成功克隆出抗逆基因，接下来就是对其功能进行深入研究。
这通常需要借助基因工程技术。
将克隆得到的基因导入到模式植物中，如拟南芥，观察转基因植物在逆境条件下的表现，从而推断该基因的功能。
研究发现，许多抗逆基因在植物的抗逆过程中发挥着重要作用。
比如，一些与渗透调节相关的基因。
在干旱或高盐环境下，植物细胞内会积累一些渗透调节物质，如脯氨酸、甜菜碱等，以维持细胞的渗透压平衡。
相关基因的表达调控着这些物质的合成和积累。
还有一些基因参与了抗氧化系统的调节。
逆境条件会导致植物体内产生大量的活性氧物质，对细胞造成损伤。
抗逆基因可以通过调控抗氧化酶的合成，如超氧化物歧化酶、过氧化物酶等，来清除这些活性氧，保护细胞免受伤害。
另外，一些基因与植物的信号转导通路有关。
当植物感知到逆境信号时，会启动一系列的生理生化反应来适应环境。
这些基因在信号的传递和响应中起着关键作用。
植物抗逆基因的功能研究不仅有助于我们深入了解植物的抗逆机制，还为植物抗逆品种的培育提供了理论基础和技术支持。
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术植物生物技术的快速发展为人们改良和改造植物基因提供了广阔的空间。
基因克隆和基因工程技术成为植物生物技术中的两个重要方面。
本文将以“植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术”为题，探讨这两个方面的内容。
一、基因克隆基因克隆是指通过复制和扩增DNA序列，从而制备大量相同DNA分子的过程。
基因克隆是植物生物技术中最早也是最常用的技术之一。
1. PCR技术PCR技术（聚合酶链反应）是一种能够扩增DNA片段的方法，它可以制备大量具有相同DNA序列的片段。
在基因克隆中，PCR技术被广泛应用于检测和扩增目标基因，为基因工程技术的开展提供了基础。
2. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
基因克隆中，通过选择性地使用限制性内切酶来切割DNA，将目标基因从其它无关基因中分离出来，实现基因的纯化与提取。
3. DNA连接DNA连接是将经过切割的DNA分子重新连接起来的过程。
连接后的DNA可以通过转化等方法引导其进入植物细胞，实现外源基因的导入。
二、基因工程技术基因工程技术是通过直接改变植物基因组中的DNA序列，对植物基因进行修改和调控的技术。
它在改良植物性状、提高植物品质等方面具有广泛应用价值。
1. 基因转化基因转化是指将外源基因导入植物细胞并使其稳定表达的过程。
通过选择合适的基因载体和转化方法，将目标基因导入植物细胞的染色体中，实现基因的稳定遗传。
2. 基因编辑基因编辑是指直接对植物基因组中特定基因进行修改和编辑的技术。
通过CRISPR/Cas9等工具，可以对植物基因组中的目标位点进行特定的编辑，实现基因的精确调控。
3. 基因沉默基因沉默是通过RNA干扰等方法，对特定基因的转录或翻译进行抑制的过程。
通过基因沉默技术，可以实现对植物性状的精确调控，提高植物产量和抗病能力等。
三、植物生物技术的应用前景基因克隆和基因工程技术在植物生物技术中的应用前景巨大。
《2024年‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》范文
《‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》篇一西伯利亚百合LiCMK基因克隆及功能分析一、引言西伯利亚百合（Lilium sibiricum）作为一种珍贵的花卉植物，其生长环境和遗传特性吸引了众多科学家的关注。
近年来，随着分子生物学和基因克隆技术的快速发展，关于西伯利亚百合的基因研究也日益深入。
本文旨在介绍西伯利亚百合中LiCMK基因的克隆及其功能分析，为进一步了解该基因的功能及其在植物生长和抗逆性中的作用提供理论基础。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的西伯利亚百合材料采自自然环境下的野生种群，经过分子生物学技术提取其基因组DNA和RNA。
2. 方法（1）基因克隆：通过PCR技术扩增LiCMK基因的cDNA序列，将目的片段与载体连接后转化至大肠杆菌中，筛选阳性克隆并进行测序验证。
（2）功能分析：采用生物信息学方法对LiCMK基因进行序列分析，预测其编码的蛋白质结构和功能；通过构建过表达和沉默载体，分别在植物中实现LiCMK基因的过表达和沉默，观察其对植物生长和抗逆性的影响。
三、实验结果1. LiCMK基因的克隆通过PCR技术成功扩增出LiCMK基因的cDNA序列，与载体连接后转化至大肠杆菌中，经过筛选得到阳性克隆并进行测序验证，确认序列的正确性。
2. LiCMK基因的序列分析通过生物信息学方法对LiCMK基因进行序列分析，发现该基因编码一个具有特定功能的蛋白质。
进一步分析表明，该蛋白质具有跨膜结构和保守的蛋白结构域，可能参与植物的生长和抗逆性等生物学过程。
3. LiCMK基因的功能分析（1）过表达实验：将LiCMK基因构建成过表达载体并转化至植物中，观察其对植物生长的影响。
结果显示，过表达LiCMK 基因的植物表现出更强的生长能力和抗逆性。
（2）沉默实验：通过RNA干扰技术实现LiCMK基因的沉默，观察其对植物生长和抗逆性的影响。
结果显示，沉默LiCMK 基因的植物生长受阻，抗逆性减弱。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
植物光合作用相关基因的克隆与表达
植物光合作用相关基因的克隆与表达植物光合作用是指在光的作用下，植物体内的叶绿素吸收光能，将其转化成化学能，从而产生能量和氧气的过程。
植物光合作用是生命的基础能量来源之一，也是维持生态系统平衡的重要过程。
植物光合作用的相关基因克隆和表达，是近年来植物学研究的热点之一。
这一研究方向主要集中在植物光合作用的细胞生物学、分子生物学和基因组学等方面。
细胞生物学角度，植物体内的光合细胞有两种类型：一种是负责光合作用的叶绿体细胞，另一种是负责运输产物的质体细胞。
这两种细胞在外形和功能上有所不同，其内部的基因表达和调控也存在差异。
因此，研究植物光合作用相关基因的克隆和表达，需要从细胞类型的角度进行分析。
分子生物学角度，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，主要探索基因的结构、功能和调控等方面。
例如，利用PCR技术和基因克隆技术，可以获得植物体内的光合作用相关基因，然后通过生物信息学工具对基因序列、编码蛋白质和表达谱进行分析。
另外，还可以应用转基因技术构建基因敲除或添加的重组植物株系，进一步揭示光合作用相关基因在植物体内的作用和机理。
基因组学角度，随着高通量测序技术的发展和基因组数据的丰富，研究人员可以在全局范围内分析植物光合作用相关基因的基因组学特征、进化关系和功能注释。
例如，通过对一些重要植物基因的全基因组序列比较，可以发现在多个物种中保守的部位和变异的部位，进而获得这些基因在植物演化中的起源和分化过程。
此外，研究人员也可以利用系统生物学的方法，将各个基因的作用和调控网络进行拼凑和模拟，从而模拟出更加细致的植物光合作用模型。
总之，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，对于理解植物生物学和解决环境保护和农业生产中的问题，具有重要意义。
希望未来能够有更多的研究成果和创新突破。
植物基因克隆的方法
阳性克些候选基因，再进行别离，时空表达
特点，同源性比较等分析确定目的基因。
1. 序列克隆 利用目标基因的近等基因系或别离群体分组分析法〔BSA〕进行连锁分析，筛选目标基因所在局部区域的分子标记。
4、目的区域的精细作图 的标记和通过转座子在染色体上
植物基因克隆的方法
基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序 列。
基因克隆：利用体外重组技术，将特定 基因
体中。
和其它DNA顺序插入到载
克隆目标：识别、别离特异基因并获得 基因
的完整全序列，确定染色
植物基因克隆的方法
能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
抑制性扣除杂交〔suppression subtractive
人工合成并克隆基因
方法：根据的氨基酸或核苷酸序列，采 用植物偏爱的密码子，人工合成并
克 隆该基因。〔可对基因进行改造〕
例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人பைடு நூலகம் 合
成并克隆了此肽的基因。
表 型 克 隆〔phonetypical cloning〕
方法：利用植物的表型差异或组织器官特 异 表达产生的差异来克隆植物基因。此方法 试图把表型与基因结构或基因表达联系起 来，从而别离特定表型相关基因。不必事 先知道基因的生化功能或图谱定位，根据 基因的表达效应就直接别离该基因。
3、构建目的基因区域跨叠克隆〔contig〕
测所测序列或氨基酸序列与序列是否同 定位克隆的优点和局限性
通过转座子上的标记基因〔如抗药性等〕就可以检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。
源→发 不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接别离
方法二: 利用Velculescu等建立的基因 表达
水稻GUN4基因克隆与功能概述.doc
水稻GUN4基因克隆与功能概述第一章导论1.1黄玉B及其在杂交稻生产中的应用高纯度的杂交稻种子为维持其在生产中的杂交优势起着极其重要的作用，而杂交种制种过程中的环境和气候条件的波动经常会造成雄性不育系malesterility line, MSL)的育性回复，导致商业杂交种批量生产中受MSL自交种子不同程度的污染舒庆亮等，1996)。
两系杂交稻系统对该类波动特别敏感，因为杂交种制种过程中异常的低温能够恢复光温敏雄性核不育系P/TGMS)的育性，所以对于保持种子纯度是个巨大的威胁斯华敏等，2011)。
为了增加、保证和快速检测种子纯度，在杂交稻生产中己将两类标记性状导入MS系。
第一类包括各类隐性的非绿叶性状，如失绿(董凤高等，1995)、黄叶(Zhou etal., 2006a)、白化转绿Wuetal.，2003和2011)和紫叶牟同敏等，1995);第二类为条件性隐性致死，如苯达松敏感突变Zhang etal.，2002; Wang etal., 2012)。
携带有这些标记性状的MS系配制的杂交稻品种已被广泛应用于商业生产中曹立勇等，1999;余新桥等，2000;鲍正发等，2006;沈圣泉等，2004和2007; HYB的黄叶表型(xantha)由60Co y福照诱变细胞质雄性不育系cytoplasmicmale sterility, CMS)龙特甫A的保持系——龙特甫B (L TB)获得Zhou etal.,2006a)。
与L TB相比，HYB中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量显著降低，但Chi a/b和Car/Chi的比率则更高Zhou et al., 2006b)。
//TB还可保持高光合速率Zhou et al., 2006b)和充足的光能利用率武立权等，2007)。
该黄叶表型己相继被引入黄玉A(Zhou etal.，2006a；沈圣泉等，2007)和嘉浙91A (富昊伟等，私人通讯）等CMS系中。
植物基因分离的图位克隆技术
植物基因分离的图位克隆技术毛健民 李俐俐(周口师范高等专科学院生物系河南周口466000) DN A是遗传的物质基础。
遗传的基本单元是以基因的形式包含在DN A序列内。
要想从分子基础上来理解遗传的本质,基因的分离是最基本的前提。
现在分离和克隆植物基因的方法很多,如传统的功能克隆及近年来发展十分迅速的表型克隆。
但大多数情况下,我们并不知道基因的表达产物,在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,最常用的基因克隆技术有转座子示踪法、随机实变体筛选法和图位克隆法。
其中,转座子示踪法中的转座子受其种类、活性和数量的制约,随机突变体筛选法随机性较大且不能控制其失活基因的种类和数量,也限制了其应用。
比较而言,图位克隆技术随着相关配套技术的日渐成熟,已成为分离基因的常规方法,并在分离不同的植物发育基因中得到了广泛的应用。
本文对图位克隆技术的原理、基本技术环节及应用作一介绍。
1 图位克隆技术的原理图位克隆技术又称为定位克隆技术,是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的1种新的基因克隆技术。
它是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的1种方法,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DN A文库,从而构建目的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。
2 图位克隆的技术环节2.1 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记 筛选与目的基因连锁的分子标记是图位克隆技术的关键,常用的分子标记有RF L P标记、R APD标记、微卫星标记和A FL P标记等。
现在已有几十种技术可用于分子标记的筛选,随着分子标记技术的发展,一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也为分子标记的筛选提供了有益的借鉴。
利用这些分子标记技术结合使用近等基因系(N ILs)或分离群体分组分析法(BSA)就可以快速地从数量繁多的分子标记中筛选出与目的基因紧密连锁的分子标记。
植物新基因克隆策略和技术进展
因克 隆 已取 得较 好 结果 并 部 分商 品 化 ， 涉及 植 物 发 育遗 传
调控与信号转导如导致合子形成和胚胎发育 、 调控花粉管
生 长 、 制叶 片发育 和根 发育 、 控 营养 细胞 和生 殖 器官 细 胞分 化 等相 关基 因 的克隆 也取 得 巨大进 展 。模 式植 物结 构 基 因 组 的相继 阐明 ， 多种 植物 高密 度 分子 标记 连锁 图 谱 的构 建 、 大片段 Ｄ Ａ克 隆系 统 的建立 ， Ｎ 序列 测定 技 术 和基 因遗 传转 化技术 的发 展 ，使得 更 多未 知基 因 的克 隆成 为可 能 。随着 ｇｎ ｎ ｅｅ ａｋ中数 据 的急 剧增 加 ， ｂ 分子 操 作技 术 的 日渐 完 备 以 及 研究 基 因差异 性表 达 的重 大意 义 ， 达序 列标 签技 术 、 表 同 源序列 技术 、图位克 隆和 差异 表 达基 因分 离等 技 术将 越来 越 受重 视 。 为此 ， 者对植 物新 克 隆策 略和技 术发 展进 行 了 笔
谱 、 图谱 、 基 因组测 序 以及 功能 基 因组 学等 将全 面 展 物理Ｎ ｍ Ｎ （ Ｄ ＴＰ Ｒ） Ｄ Ｒ ＿ｃ 、代 表性 差 示 分 析 （ Ｄ Ｒ Ａ）和抑 制 差 减 杂 交 （Ｓ ） Ｓ Ｈ 等方 法 获得 的 Ｅ Ｔ数据 也必 将呈 加速度 增 长 。因此 ， Ｓ
基 序 与公 共 数 据库 的基 因进 行 “ 电子 杂交 ”进 而 可 以从 理 ， 论 上 推测 其所 代 表 的基 因 的功能 。 电子 杂交基 因筛选 后 经 的 Ｅ Ｔ 其 延伸 基序 可 作为 某一 基 因标 签 ， 合 Ｐ Ｒ技 术 Ｓ及 结 Ｃ 克隆新 基 因 ， 其过 程如 下 ： 首先 以该标 签 序列 提供 的信 息设 计 合 成 基 因特 异 引物 （ Ｓ ）再 用 Ｏｉ （Ｔ 对 ｍ Ｎ ＧＰ， ｌｏｄ ） Ｒ Ａ进 行 ｇ 反转 录 的同时 加上 锚定 引物 ， 后在 总 Ｒ Ａ 中 ， 用 ｃ Ｎ 然 Ｎ 采 ＤＡ
植物抗病基因的克隆与功能分析
植物抗病基因的克隆与功能分析在农业生产中，植物病害一直是影响农作物产量和质量的重要因素之一。
为了有效地防治植物病害，科学家们致力于研究植物的抗病机制，并对植物抗病基因进行克隆和功能分析。
这一研究领域的不断深入，为开发新的抗病品种和制定更有效的病害防治策略提供了重要的理论基础和技术支持。
植物抗病基因的克隆是研究其功能的前提。
克隆植物抗病基因的方法多种多样，其中最常用的是图位克隆法。
这种方法首先需要构建一个包含大量个体的遗传群体，然后通过对这些个体的抗病性表现和遗传标记进行分析，逐步将抗病基因定位在染色体的特定区域。
接着，通过精细定位和测序，最终确定抗病基因的序列。
除了图位克隆法，还有基于同源序列的克隆法。
许多抗病基因在结构和功能上具有一定的相似性，因此可以根据已知抗病基因的序列设计引物，从待研究的植物中扩增出同源序列，再通过进一步的分析和验证来确定是否为真正的抗病基因。
还有一种比较新的方法是基于转录组测序的克隆法。
通过对植物受到病原菌侵染前后的转录组进行测序和分析，可以筛选出在侵染过程中表达量显著变化的基因，这些基因很可能与抗病反应有关，进而从中鉴定出抗病基因。
成功克隆出植物抗病基因后，接下来的关键任务就是对其功能进行分析。
这通常包括对基因的表达模式、编码蛋白的结构和功能以及在抗病反应中的作用机制等方面的研究。
在研究基因表达模式时，常用的技术有实时荧光定量 PCR 和 RNA 原位杂交等。
通过这些技术，可以了解抗病基因在不同组织、不同发育阶段以及在受到病原菌侵染后的表达情况。
比如，有些抗病基因在叶片中高表达，而有些则在根部特异性表达；有些抗病基因在病原菌侵染早期就迅速被激活，而有些则在后期发挥作用。
对于编码蛋白的结构和功能分析，通常会采用生物信息学的方法对其氨基酸序列进行预测和分析，确定其可能的结构域和功能位点。
同时，还可以通过体外表达和纯化蛋白，进行酶活性测定、蛋白质互作等实验，进一步明确其功能。
植物分子生物学植物基因的同源克隆PowerPoint 演示文稿
植物总RNA提取的难点 1.内外源RNase的污染。 2.多酚类物质的干扰 3.蛋白质的干扰 4.多糖的干扰
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创造一个无RNase的环境
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1.器械的消毒：用0.1%DEPC—二乙基焦碳酸盐 （Diethyl Pyrocarbonate )浸泡处理2hr以上， 然后高压灭菌去除DEPC；或高温（250℃） 干热消毒4hr以上或200℃干热消毒过夜。
9
植物DNA提取的难点
1.多酚类物质的干扰:多酚类物质被氧化后，与DNA 分子发生不可逆的结合，使提取的DNA样品呈棕 褐色。
2.多糖类物质的干扰：多糖与DNA形成粘稠的胶状 复合物，DNA被包埋在这种复合物中难于溶解。
3.其它次生物质的干扰：乳胶、树脂等，与DNA共 沉淀。 这种褐色、粘稠的DNA不易被限制性内切酶和Taq DNA聚合酶所识别，从而导致PCR扩增和酶切的 失败 。
29
植物RNA提取过程中蛋白质污染的排除
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1.在冷冻条件下研磨植物材料，以抑制 RNase的活性。 2.在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂（苯 酚、胍、SDS、CTAB等）。 3.利用蛋白酶K降解蛋白质。 4.利用苯酚、氯仿抽提。 5.用70%高氯酸钠溶液沉淀蛋白质。
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植物DNA和RNA的检测
5.研磨时加入大分子聚合物或吸附剂除多酚： PVP、PVPP：2-6.0%（W/V）；活性炭： 0.1-0.3%（W/V）。
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6.高盐去多糖法：在氯仿/异戊醇的抽提后的水相 中加入0.5V的5MNaCl混匀，然后加入2V的无 水乙醇沉淀DNA，大部分多糖留在上清液中； 在DNA的水溶液中，加入5MNaCl使其终浓度 为0.5-3.0M，以2.0M除糖效果最好。
植物基因的同源克隆
转录因子CBF4基因的克隆及其植物表达载体的构建
２ Ｃ ｌ ｇ ｆＥ ｏｏ ｙ ａ ｄ Ｅ ｖｒｎ ｎ ，ｎ ｅ ｎ ｏｉ ｒ ｕｔｒｌＵ ｉｅｓｔ Ｈｕ ｈ ｔ ０ ０ １ ， ｈｎ ） ． ｏｌ ｅｏ ｃ ｌｇ ｎ ｎ ｉ ｍｅ ｔ Ｉｎ ｒＭｏ ｇ ｌ Ａｇ ｃ ｌ ａ ｎｖ ｒｉ ｅ ｏ ａ ｉ ｕ ｙ， ｈ ｏ １ ０ ８ Ｃ ｉａ
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苜蓿 新 品种 奠 定 了基 础 。
关键 词 ： Ｂ ４ 拟 南 芥 ； 隆 ； 达 载 体 构 建 ＣＦ ； 克 表
中 图分 类 号 ： ７ ；６ ７ Ｑ ８ ￥３ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ０— ０ １ ２ １ ） ４— ０ ３— ４ １０ ７ ９ （ ０ ０ ０ ０ ５ ０
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植物抗病基因的克隆与鉴定
植物抗病基因的克隆与鉴定植物病害是世界各地农民和园艺爱好者所面临的一个普遍问题。
为了保护农作物和花卉的健康，植物学家和遗传学家们一直在致力于研究植物抗病基因的克隆和鉴定。
抗病基因的发现与研究为了确定植物中的抗病基因，研究人员首先需要从这些植物中分离出基因。
基于现代分子生物学技术，研究人员能够对基因进行克隆和鉴定。
最近，科学家们在研究拟南芥的抗黑线病基因时取得了一定的进展。
研究表明，该抗病基因能够依靠其基因编码产物来刺激植物的免疫反应，从而保护植物不受病原体的伤害。
抗病基因的克隆与鉴定抗病基因的克隆过程通常包括两个步骤：DNA文库构建和筛选。
DNA文库是指植物细胞中所有基因序列的集合。
文库中的DNA通常是通过群体DNA提取方法或单细胞PCR方法获得的。
研究人员将DNA文库插入DNA载体中，构建出含有全部植物基因序列的基因文库。
接下来，研究人员需要验证一些基因是否为抗病基因。
通常这种工作是通过功能鉴定进行的。
功能鉴定的方法有很多种，包括转基因技术、基因敲除技术、基因启动子分析和蛋白质互作鉴定等。
利用这些技术，研究人员可以确定哪些基因与植物的免疫反应有关联。
抗病基因的功能分析与利用基因鉴定后，研究人员通常会进行功能分析和利用。
其中一种方法是通过转移、喷雾或浸泡等方式利用基因工程技术将抗病基因转接到植物中去。
这个过程通常称为转基因。
转基因作物被引入后，它们就能够抵御一系列的病原体，从而提高农民的产量和收益。
此外，研究人员还在寻找其他类型的抗病基因。
研究表明，一些植物物种的抗病基因和人类免疫系统中的基因有些相似之处。
这可能意味着这些植物基因能够为人类的免疫系统研究提供思路。
未来，研究人员将继续利用分子生物学和基因工程技术去寻找新型抗病基因，从而保护我们的农业和花卉生产。
动植物克隆技术的原理应用
动植物克隆技术的原理应用1. 简介克隆技术是指通过无性生殖方式获得与个体基因完全相同的生物体的方法。
动植物克隆技术在近年来取得了巨大的突破，在农业、医学、生物学等领域具有广泛的应用前景。
本文将介绍动植物克隆技术的原理及其在不同领域的应用。
2. 动物克隆技术的原理动物克隆技术主要有基因植入、生化合成和胚胎分裂三种方式。
2.1 基因植入基因植入是指将需要克隆的动物的细胞核提取出来，然后将细胞核注入一个没有细胞核的卵细胞中。
经过适当的处理后，这个卵细胞就能发育成为与原动物基因完全一样的个体。
2.2 生化合成生化合成是指通过化学合成的方法，在实验室中制造出与目标动物基因完全一样的生物体。
这种方法可以直接合成DNA，并用该DNA合成新的细胞。
2.3 胚胎分裂胚胎分裂是指将早期胚胎进行分裂，然后将分裂后的细胞重新培养成一个个新的胚胎。
这些新的胚胎继续发育下去，最终形成与原动物基因完全一样的个体。
3. 动物克隆技术的应用动物克隆技术在农业、医学、生物学等领域有着丰富的应用。
3.1 农业领域动物克隆技术在农业领域可以通过复制优质畜禽个体来提高种畜禽的质量和产量。
此外，还可以用于保存濒临灭绝物种的基因，保护生物多样性。
•提高种畜禽的质量和产量•保护濒临灭绝物种的基因3.2 医学领域动物克隆技术在医学领域有着重要的应用，包括组织工程、疾病模型的建立、药物筛选等。
•组织工程：利用克隆技术可以培养出与患者自身组织相匹配的器官，用于器官移植。
•疾病模型的建立：通过克隆技术可以制造出与患者基因相同的动物模型，用于疾病的研究。
•药物筛选：利用克隆技术可以制造出与患者基因相同的动物模型，用于药物的筛选，加速药物研发过程。
3.3 生物学研究领域动物克隆技术在生物学研究方面的应用更加广泛，可以用于基因功能的研究、胚胎发育的研究等。
•基因功能的研究：通过克隆技术可以制造出与目标基因有关的动物模型，用于研究基因的功能。
•胚胎发育的研究：通过克隆技术可以制造出各个发育阶段的胚胎，用于研究胚胎发育的过程和机制。
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4植物基因克隆的策略与方法基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。
基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。
通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。
我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。
1功能克隆(functional Cloning)功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。
其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。
功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。
Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。
Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。
周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。
植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。
胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,1989)。
王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(potato virus X, pvx),克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因,并将外壳蛋白基因转入马铃薯中,以期获得抗pvx病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991)。
病毒外壳蛋白(Coat protein cp)基因的成功克隆,可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Protein Med iated Resistance CPMR)或病毒CP-RNA介导的抗性。
Van kan 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9,可直截了当利用此基因介导广谱高效的基因工程植物(Van Kan等,1991)。
我们1995年构建了天麻cDNA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997)。
功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、尽管某一性状的编码基因是未知的。
如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清晰,就能够分离和纯化操纵该性状的蛋白质。
因此功能克隆的关键是分离出一个纯度专门高的蛋白质。
只要有一个纯的蛋白质,得到十分特异的探针,这一策略是行之有效的。
采纳功能克隆方法尽管差不多克隆了专门多基因,但由于绝大多数基因的产物目前还不明白。
因此大多数基因难以用这一经典的方法来克隆。
随着分子生物学技术的进展,一条新的基因克隆策略逐步形成,这确实是定位克隆。
2定位克隆(Positional cloning)按照遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后持续缩小选择区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗性的生化机制,如此一种策略叫定位克隆(Monaco,1994)。
连锁分析即通过基因与DNA 标记之间的重组系数来估量这两者之间的距离,若某种性状的基因与DNA标记在子代不分离,即有连锁在一起的趋势。
按照这一原理可将与已知的某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。
由于连锁分析需要依靠特定的基因作为连锁标记,即标记基因与待研基因之间存在连锁关系,而满足与待研基因相连锁的基因实在太少,因此连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。
RFLP的显现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克服的困难。
1980年Wyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性RFLP (r estriction fragment length polymorphism),使对任何一种表型有关的基因的定位成为可能。
限制酶切片段长度多态性是用限制性内切酶切割后产生的D NA片段长度的多态性呈孟德尔式遗传,是存在于全基因组的专门的多态标记,RFLP使基因定位变得易行(Wyman等,1980)。
目前定位克隆一样是用RF LP等分子标记制作遗传图谱,查找与待测基因连锁的RFLP标记,获得基因在染色体上的定位然后克隆基因。
因此RFLP和后来进展起来的RAPD技术的建立,可将待测基因相对准确地定位,利用已知的基因可分离与之连锁的未知基因。
其差不多程序是构建一个基因组文库、用已知的A基因为探针,从基因组文库中选择出与其有同源序列的a克隆,再用a克隆为探针从基因组文库中选择出与a克隆有同源序列的b克隆,然后以此类推最后选择出未知基因并把它分离出来。
目前已在番茄、烟草、大麦、水稻、大豆、玉米等植物中发觉了与抗病基因紧密连锁的RFLP标记并构建了遗传图谱(Fi gdore等,1988;Heun等,1991;Smith,1991;Diers等,1992)。
用这种方法已分不克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因(Martin等,1993;Ben t等,1994;Mindrinos等,1994;Wenyuan等,1995) 。
Martin等1993年最早用定位克隆技术克隆出番茄pto基因,pto基因负责对带有无毒基因Avrpto的细菌,丁香假单胞菌(pseudomonas syringae pv)菌株的抗性,Pto基因导入感病番茄后转基因植株增强了对病原菌的抗性(Martin等,1993)。
Wenyuan等199 5年用这一技术克隆了水稻Xa21基因,Xa21基因对真菌Xanthomonas oryza e pv oryzae (Xoo)具有抗性(Wenyuan等,1995)。
3转座子标记法(transposon tagging)转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段。
在转座过程中原先位置的DNA片段(转座子)并未消逝,发生转移的只是转座子的拷贝、基因发生转座可引起插入突变使插入位置的基因失活并诱导产生突变型或在插入位置上显现新的编码基因。
通过转座子上的标记基因(如抗药性等)就可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。
转座子标记法是把转座子作为基因定位的标记和通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因(Fedoroff等,1984;Jones等,1994)。
利用转座子克隆植物基因的操作步骤要紧应是以下几方面:(1) 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体。
(2) 把转座子导入目标植物。
(3) 利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中,这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的。
(4)转座子插入突变的鉴定及其分离(Ellis等,1992)。
通常用于克隆植物基因的转座子有玉米的Ac. Mu, Smp和Ds等。
Ac含有编码转座酶的基因,能够自主的转座,Ds不含转座酶因此不能自主的转座,但Ds-Ac系统因Ac为Ds提供了转座酶就能够自主的转座了。
用转座子标记法进行植物基因的分离,首要的是把Ac等转座子转化到要进行基因克隆的植物中,目前多数是利用土壤农杆菌介导的转化系统把转座子导入目标植物中(Keller等,1993;Bancroft 等,1993)。
目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因(Joh al和Briggs,1992;Whitham等,1994;Jones等,1994;Gregory等,1995)。
Johal和Brigge分离出抗灰色长蠕孢(Helminth osporium carbonum)1号小种玉米的HMI特异真菌抗性基因。
该基因存在于玉米的抗性品种中,能够分解长蠕孢1号小种产生的对玉米具特异致病性的HC毒素,该基因编码HC毒素脱毒酶可使植物具有抗病性(Johal和Briggs,1992)。
和转座子标记法的原理相似的还有T-DNA标记法,两者差不多上由于一段基因的插入导致染色体结构发生变化产生突变体,而T-DNA标记法产生的突变是由于T-DNA插入导致的。
Kenneth等利用T-DNA插入标记培养出拟南芥矮化突变体(Kenneth等,198 9)。
4人工合成并克隆基因蜘蛛毒素是一种小肽,它只有37个氨基酸,体外实验表明它能杀死多种对农作物有害的昆虫,蒋红等1995年按照蜘蛛毒素的氨基酸序列,采纳植物偏爱密码子、人工合成并克隆了此肽的基因(蒋红等,1995)。
Adang 1995年人工合成了苏云金杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis insecticidal crystal pro tein)基因(Adang等,1995)。
5表型克隆(phenotype cloning)1995年Jonsson和Weissman提出表型克隆概念(Jonsson和Weissman,1 995),有些植物目前即不了解它的基因产物,也没有对它们进行基因定位,但已知植物在表型上存在差异,利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因确实是表型克隆。
San等用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因(Sun等,1992)。
表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特点联系起来,从而分离特定表型有关基因,力求不必事先明白基因的生化功能或图谱定位，按照基因的表达效应就直截了当分离该基因(Br own,1994)。
6mRNA差异显示(mRNA differential display)1993年Liang和Averboukh等科学家提出了mRNA差异显示(mRNA DD, mRNA differential display)的方案(Liang等,1993)。