植物根系酸性磷酸酶活性测定
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • (目的：选取合适的反应时间)
管号
1
磷酸苯二钠 0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
5
10 15
20
根据双倒数法计算出Km及Vmax
Vmax [S]
V=
Km + [S]
三、实验步骤：
• 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 • 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • 3、制作酚标准曲线 • 4、[S]与V0关系实验 • 5、双倒数作图法计算Vmax和Km
blank
buffer substrate enzyme
25
2
2
2
2
22
－
－
－
－
－
0.5
0.5 0.5
0.5 0.5 0.5 0.5
35℃保温10分钟 Folin－酚溶液已稀释好！
注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
• 3、制作酚标准曲线
• (目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相 当的酚含量,并计算出反应速度(用每分钟 产物生成量来表示)
1.5
2.5
1/[S]
A 680
phenol content (酚含量) V0 (μmole phenol per min) 1/ V
0
1、酚含量从酚标准曲线上查得 2、V0 反应初速率( μmol/min)为酚含量除以酶反应时间(15分钟)。 3、双倒数作图法计算Vmax和Km
植物根系酸性磷酸酶活性测定
植物根系酸性磷酸酶活性测定1.原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即p-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。
酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（μg·h-1·g-1鲜根或μg·h-1/株）。
2.测定方法1）称取（1.2±0.1）g鲜根，加入8 mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8），然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。
2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于37℃水浴30min。
3）水浴后加入2mL 0.5mol/L CaCl2及2mL 2mol/L NaOH以终止反应，摇匀。
4）2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。
5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值A410。
3.标准曲线的制作1）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表1加入试剂。
表1对硝基苯酚标准曲线配制表2）混匀后，在2500r/min 下离心5min ，再在4000r/min 下离心5min 以0号作为对照，在410nm 波长下测光吸收值，并记录光吸收值A 410。
3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx 及相关系数R ，即对硝基苯酚含量410)(A b a mol n ⨯+=μ。
4.计算方法根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP 生成的对硝基苯酚（p-NP ）的量来表示（μg·h -1·g -1鲜根或μg·h -1/株）。
植物紫色酸性磷酸酶的研究进展
植物紫色酸性磷酸酶的研究进展作者：刘攀道黄睿许文茸罗佳佳陈志坚刘国道来源：《热带作物学报》2019年第02期摘; 要; 酸性磷酸酶（APase）是酸性条件下（pH < 7.0）能催化磷酸单酯或酸酐裂解从而释放无机磷酸根离子的水解酶类。
紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase，PAP）是一类特殊的酸性磷酸酶，其具有鲜明的特征，如：酶的提取液呈紫色或粉色、酶活性不受酒石酸盐抑制、氨基酸序列具有5个保守结构域和双金属离子催化中心等。
已有的研究表明，紫色酸性磷酸酶在植物适应低磷胁迫过程中发挥着重要作用。
本文综述了紫色酸性磷酸酶的生化特性、亚细胞定位、生物学功能以及最新研究进展。
关键词; 紫色酸性磷酸酶;有机磷;低磷胁迫;生物学功能中图分类号; Q945.78; ; ;文献标识码; A磷（phosphorus，P）是植物生长发育的限制性营养元素之一，参与植物的多种新陈代谢过程，如光合作用、能量传输、酶活性调节、膜磷脂与核酸的合成等[1]。
无机可溶性磷酸盐（inorganic phosphate，Pi）是植物根系能从土壤中吸收的主要磷形式，但在大多数耕作土壤中，Pi的浓度只有0.1～10 μmol/L，远低于植物最优生长所需的Pi浓度（1 mmol/L）[2]。
全球近70%的耕地存在有效磷缺乏问题，特别在酸性土壤中低磷胁迫尤为严重[3]。
虽然土壤中Pi浓度低，但土壤中存在大量的有机磷，约占土壤全磷含量的30%～65%，主要以植酸磷（肌醇六磷酸）、DNA（脱氧核糖核酸）、ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）和糖磷酯等形式存在[4]。
有机磷难于被植物直接利用，只有被酸性磷酸酶降解后释放出的Pi才能被植物根系吸收[5]。
目前，已鉴定的参与植物适应低磷胁迫的酸性磷酸酶，主要属于紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase，PAP）家族[6]。
本文将从生化特征、亚细胞定位及生物学功能等方面，系统介绍植物PAP相关研究领域近年来取得的进展。
植物根系分泌有机酸的收集、分离及检测方法探析
植物根系分泌有机酸的收集、分离及检测方法探析摘要：根分泌物主要是以碳为基础的低分子化合物和高分子化合物。
植物分泌的有机酸主要有乙酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸等, 它们调节细胞代谢, 为根际和微生物提供营养。
植物根系分泌有机酸的研究对于了解植物的根际效应具有重要的学术意义。
简述了根系分泌物有机酸的收集、分离和检测方法。
关键词：根分泌物; 有机酸; 收集; 分离; 检测;Abstract：Root exudates include low molecular compounds, high molecular compounds, and primarily carbon-based compounds. The organic acids secreted by plants are mainly acetic acid, oxalic acid, citric acid, malic acid, tartaric acid and succinic acid, which regulate cell metabolism and provide nutrients for the rhizosphere and microorganisms. The study of plant root exudates of organic acids has important academic significance for understanding the rhizosphere effects of plants. This paper briefly described the methods of collection, separation and detection of organic acids in root exudates.Keyword：root exudates; organic acid; collection; separation; detection;0、引言根际作为植物、微生物和土壤之间的交互作用区域, 是根-土界面微生态系统的物质基础和核心内容。
【精品】土壤磷酸酶活性的测定
【关键字】精品土壤磷酸酶活性的测定【摘要】在植物的土壤磷素营养中，有机磷化合物占有一定的比例，而有机磷往往要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能转化成为植物可能利用的形态。
所以，土壤磷酸酶的活性直接影响土壤中磷的有效性。
研究土壤的磷酸酶活性，对于弄清土壤中磷的转化过程、方向及强度具有重要意义。
磷酸酶根据PH不同，分为酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和中性磷酸酶。
本文主要讲述磷酸酶的活性的测定。
【关键词】土壤磷酸酶活性碱性磷酸酶活性酸性磷酸酶活性中性磷酸酶活性pH5醋酸盐缓冲液pH7柠檬酸盐缓冲液pH9.4硼酸盐缓冲液标准曲线的测定酸性磷酸酶标准曲线的测定碱性磷酸酶标准曲线的测定中性磷酸酶标准曲线的测定【正文】在植物的土壤磷素营养中，有机磷化合物占有一定的比例，而有机磷往往要在土壤磷酸酶的酶促作用下，才能转化成为植物可能利用的形态。
所以，土壤磷酸酶的活性直接影响土壤中磷的有效性。
研究土壤的磷酸酶活性，对于弄清土壤中磷的转化过程、方向及强度具有重要意义。
1.酸性磷酸酶活性的测定（一）实验原理本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生色。
用比色法测定出游离的酚量，用以表示酸性磷酸酶活性。
（二）试剂配制（1）0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；（2）pH5醋酸盐缓冲液；（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前都可使用；（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液——取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；（5）甲苯；（6）0.3％硫酸铝溶液。
（三）实验步骤（1）标准曲线绘制取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mLpH5醋酸盐缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1浓度的酚标准溶液梯度。
磷胁迫下大豆叶片及根系酸性磷酸酯酶酶谱的研究
一
种复 杂 的化合 物 ， 具有 几种 同工 酶 ， 常形成 聚合 体
发挥 作 用 。许 多研 究 者都 试 图找 出 Ａ ａｅ 性 与 Ｐｓ 活
酶含量在低磷处理 第 ｌ 、０ｄ ３ 比对照 高， ０ｄ ２ 、０ｄ均 酶谱 染 色 加深 和谱 带条数 的增加 ， 明低磷 胁迫 增加该 酶活 性 ， 高 说 磷
维普资讯
摹 童
．
。 ．
■ 农业技市
磷 胁 迫 下 大 豆 叶 片 及根 系酸 性 磷 酸 酯 酶 酶 谱 的研 究 ＊
李 志刚 宋书宏 李瑞平 苏 辉
（． １辽宁省农业科 学院， 阳 １０６ ； ． 沈 １１１２ 内蒙古 民族 大学， 通辽 ０ ８４ ） ２０２
的生物 有 效性 。植 物 根 系分 泌 Ａ ａｅ 根际 土壤 中 Ｐｓ 是 Ａ ａｅ的主要 来 源 。在 低磷 胁 迫 下 ， 际 Ａ ａ Ｐｓ ３ 根 Ｐｓ ｅ的 活性 大大 增强 ， 磷 亏缺 量越 多 ， 际 Ａ ａｅ 活性 且 根 Ｐｓ 的
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｒ １ ａ ｔ ｅ ｈ ｎ ｅ ａ ｄ ｚ ｍｏ ｒ ｍ ｆ ａ ｉ ｈ ｓ ｈ ｔ ｅ ｓｒ ｃ ：Ｉ ｅ ｃｉ ｃ ａ ｇ ｎ ｙ ｇａ ｏ ｃｄ ｐ ｏｐ ａａ １ ｖ ｓ
Ｋ ｅ ｒ ： ｉ ｈ ｓ ｈ ｔｓ ｙ ｇｄｎ ｙ ｗｏ ｄｓ Ａｃｄ ｐ ｏ ｐ ａａｅ ｚ ｍｏ Ｆｌ ，Ｐｈ ｓ ｈ ｒ ｓｓｒｓ ，￣ ｙ ｅ ｏｐ ｏｕ ｔｅｓ ｂａｎ
植物酸性磷酸酶的研究进展
成各种 形态上 和生 理上 的适应 性来 获得 土壤 中的磷 叶片酸性 磷酸 酶 活性 进 行 玉 米磷 缺 乏 诊 断 时 发现 ，
素 。其 中高 效 利 用 磷 的生 理 方 面 的适 应 性 变 化 包 磷 缺乏 时 同一 部位 单位 面积 的叶 片酸性 磷酸 酶活性 括 ： 系分泌 有机酸 和质 子酸化 土壤 ｌ 、 泌酸性 磷 比磷 充 足时增 加 ２ 根 ４分 ］ ～３倍 。庞欣 等 ＿ 过分 根 处 理 】 通 酸酶水 解有 机磷 化 合 物 等 。酸 性 磷 酸 酶 是植 物 试 验研 究 了黄瓜部 分根 系供 磷对 根系 酸性磷 酸酶 活 结 分 体 和 土壤 中一 种 重要 的水 解 酶 ， 它不 仅 在 植 物碳 水 性 的影 响 ， 果表 明 ： 根处 理后 不供磷 根 系 的酸 性
小分 子 、 无机 到有机 的转化 过程 。在 这一 过程 中 ， 根
用 ［ 。因此 ， 入研 究 植 物及 土 壤 中的 酸性 磷 酸 酶 ３ ］ 深 世 界性 的缺磷 危机具 有重 要意 义 。
１ 植 物体 内的酸 性 磷 酸 酶
酸性 磷酸 酶是 一 种 诱 导 酶 ， 活性 受 植 物供 磷 其 植 物体 内的酸性磷 酸 酶 活 性 ， 活性 增加 是 植 物 对 其
实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
管号
1
磷酸苯二钠
0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
实验四 酸性磷酸酶Km及 Vmax值测定
一、概述
酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。
二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
植物根系活力测定
实验三植物根系活力测定植物根系的作用主要有:(1)对地上部分支持和固定(2)物质的贮藏(3)对水分和无机盐类的吸收(4)合成氨基酸、激素等物质。
因此，根系活力是植物生长的重要生理指标之一,其测定方法主要有a-萘胺氧化法和氯化三苯基四氮唑(TTC)法。
实验目的：了解根系活力的生理意义；掌握a-萘胺氧化法,测定根系活力的原理与方法;实验原理：植物的根系可通过过氧化物酶氧化吸附在根表面的a-萘胺，生成红色的α-羟基-1-萘胺，沉淀于有强氧化力的根表面，使这部分根染成红色，该反应如右图。
根对α-萘胺的氧化力与其呼吸强度有密切关系。
据认为α-萘胺氧化过程是在过氧化物酶的催化下进行的，该酶的活力愈强，对α-萘胺的氧化力就愈强，染色也就越深。
所以可根据染色深浅半定量地判断根系活力大小。
如需对根活力进行定量测定，可根据α-萘胺溶液与根系接触一定时间后，α-萘胺的减少量来确定。
Α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料,可用比色法测定α-萘胺含量，其反应如图。
在520nm波长处测定所生成的染料的吸光度值，即可求出a-萘胺的含量。
求出与根接触前后a-萘胺的含量，就可以求出根系对a-萘胺的氧化活力，从而测定出植物根系的氧化活力大小。
实验内容：1.定性观察（不做）从田间挖取水稻植株，用水冲洗根部所附着的泥土，洗净后再用滤纸吸去附在水稻根上的水分。
然后将植株根系浸人盛有25 μg/mL的a-萘胺溶液的容器中,容器外用黑纸包裹,静置24~36 h后观察水稻根系着色状况。
着色深者，其根系活力越大。
2.定量测定(1)a-萘胺的氧化挖出水稻植株，并用水洗净根系上的泥土，剪下它的根系，再用水洗，待洗净后用滤纸吸去根表面的水分，称2 g根放在100 ml三角烧瓶中。
然后加50 μg/ml的a-萘胺溶液与PBS(pH 7.0)等量混合液50 ml，轻轻振荡，并用玻璃棒将根全部浸入溶液中，静置10分钟，吸取2 ml溶液，测定α-萘胺含量[测定方法见下面(2)]，作为试验开始时的数值。
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法
2 土壤微生物量测定土壤微生物量（MB）是指土壤中体积小于5x103叩3的生物总量，但活的植物体如植物根系等不包括在内］。
它通过调控土壤中能量和养分循环以及有机物转化，来反映土壤同化和矿化能力。
土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的大小以土壤微生物生物量碳来表示。
2.1熏蒸浸提法2.1.1原理利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中有机C、N和P提取的可溶性有机碳含量和微生物量C之间存在较稳定的比例关系。
2.1.2则定步骤1.根据土壤样品含水量，调节土壤含水量为田间持水量的50%，25 ℃下密封培养10 d，以保持土壤均匀和不同地方所得结果的可比性。
2.氯仿熏蒸24 h后，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。
根据所测对象不同选择不同的提取剂浸提，振荡浸提30 min后，立即分析浸提液中所测对象的含量或放入-15 ℃下保存。
表1指出氯仿熏蒸浸提法测定不同土壤微生物量所选用的浸提剂及其条件。
表1姓熏薪髓喉土就生帽条件Table I F'E fcrdieneasuirm aitcondiocnsof soilm riobialbmass土情即鄢Detemiia血cfhdicaMr Eitatnt土觥生醯K(=D,3S 或D.45土觥物1小K国加士躺蜘M恻般注®拓牖腌雄魂航觥刎楠融脑机装痴螭定雕耐帕帆小麒眼3 土壤酶活性测定土壤酶活性均用风干土壤。
土壤转化酶活性和过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性依次用硫代硫酸钠滴定法、高锰酸钾滴定法、靛酚蓝比色法和磷酸苯二钠比色法测定（关松荫,1986）3.1脲酶一一靛酚蓝比色法脲酶的活性可以用来表示土壤供氮能力（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
植物根系活力的测定
2. Evans blue stranining（伊文思蓝）
是一种检测活细胞的染料。其原理在于Evans blue不能透 过健康细胞的完整细胞膜，但当细胞死亡时能够渗入破损 细胞膜染色
图2 不同伤根处理后根尖Evans blue 染色图 Fig2 The cell viability test determined by Evans blue staining in roots tips
定量测定：6ml 95％乙醇，盖上盖子，于热水浴中提 取5min。冷却定容至10ml，于600nm处测定吸光值。 计算根系相对活力（可不做）。
3. -萘胺法
A、B两组分别称取0.30g根段放入15ml试管（标号为A、 B），加入40ppm -萘胺和磷酸缓冲液的等量混合液
10ml，在25ºC反应1-2hr。
实验11 TTC、萘胺法及 Evans-blue染色法比较测
定植物的根系活力
【前言】
植物根系是水分和矿质营养的主要吸收器官，也 是多种物质（如氨基酸、植物激素、生物碱等） 的同化、转化或合成的重要器官，因此，根系的 生长发育状况和根系的活力强弱将直接影响植物 的生命活动，根系活力是植物生长的重要生理指 标之一。
A、B两组分别称取0.30g根段放入15ml试管（标号为 TA、TB），在试管中加入去离子水至10ml，再分别 加入3ml 0.6％TTC，混匀，在37ºC水浴中反应1hr。
加入0.5ml 2M H2SO4终止反应，然后排干试管中溶液， 用纯水充分冲洗，加入6ml 95％乙醇，盖上盖子，于 热水浴中提取5min。
对氨基苯磺酸+ 2H+ +NO2- + -萘胺 → 对-苯磺酸-
偶氮--萘胺
酸性磷酸酶活性测定方法
实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。
2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。
以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。
它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。
3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。
4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。
5．实验内容（1）酶液提取。
称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。
吸出上清液，即为酶粗提液。
可放在冰箱中储存备用。
（2）活力测定。
取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。
空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。
充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。
10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。
在400nm波长下测吸光度A。
（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。
酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的gWVVA⨯⨯⨯min1011.3019.0式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。
酸性磷酸酶的组织定位
酸性磷酸酶的组织定位学院：植物保护学号：2019050226 姓名：薛雨欣指导老师：曹翠玲时间：2019.10.151 引言植物根可向根际分泌许多有机化合物, 其中有许多物质都能促进植物对矿质养分的吸收.作为必需大量营养元素的P, 在土壤中以无机磷酸盐阴离子的形式被吸收, 而有机磷酸酯必须被水解成无机 P 后才能进入植物根, 在这一过程中有一非常重要的步骤, 就是由微生物、菌根外真菌和植物根分泌酸性磷酸酶。
诱导并分泌酸性磷酸酶是植物应对低磷环境的重要适应性反应之一。
酸性磷酸酶可以从不同的有机磷底物上水解磷酸基团，供植物吸收利用。
大多数的植物酸性磷酸酶没有明显的底物特异性，可以水解的底物包括 RNA、DNA、3-磷酸甘油酸、磷酸己糖等。
体外实验中，从拟南芥、番茄中纯化的酸性磷酸酶的酶活力都受到了缓冲液中高 Pi 浓度的抑制，进一步研究发现酸性磷酸酶水解产生的 Pi 可以负反馈抑制大多数酸性磷酸酶的活性。
磷饥饿条件下, 植物被诱导分泌酸性磷酸酶;另一方面, 植物根系分泌酸性磷酸酶活性的增加又能够水解释放土壤中的有机磷化合物供植物生长。
在植物体内, 酸性磷酸酶主要累积在液泡中, 大量研究表明, 酸性磷酸酶在调控植物磷营养方面有着非常重要的作用, 它在有机磷的代谢及再利用过程中也起着十分重要的作用, 其活性直接影响着有机磷有效性的高低。
在植物体内, 酸性磷酸酶对有机磷的再利用主要通过 2 个功能来实现:1)将植物体内的有机磷转化为无机磷;2)将植株中的磷从衰老组织转运到幼嫩组织。
梁宏玲的研究表明, 低磷胁迫下, 磷高效品种97081 体内酸性磷酸酶活性高于磷低效品种97009 , 低磷条件下97081 各部位酸性磷酸酶活性比97009 相应部位增加的幅度大, 植物体内磷素的分组结果也是97081 的相应部位的可溶性磷占总磷的比例高于97009 , 说明97081 在低磷条件下, 酸性磷酸酶受到强烈的诱导, 其活性大幅度增加。
植酸酶活力的测定方法及应注意问题(精)
科技信息植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称 [1]。
植酸酶是一种胞外酶 [2], 广泛存在于自然界中, 植物、动物、微生物均可产生植酸酶。
植酸酶的活性因来源不同而有差异。
植酸酶能将肌醇六磷酸 (植酸分解成为肌醇和磷酸。
植酸酶可以专一性地水解植酸中的磷酯键, 使磷酸游离出来, 植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下, 形成中间产物肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸、肌醇一磷酸、终产物为肌醇和磷酸 [3]。
植酸酶的作用机理见图 1。
图 1植酸酶的作用机理1. 植酸酶酶活力测定的意义酶活力也称酶活性, 是指酶催化一定化学反应的能力, 用在一定条件下, 酶所催化某一反应的速率表示。
酶活性是研究酶的特性, 分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。
酶活力单位是以酶活力为根据而定义的。
国际生化协会酶委员会规定, 1min 内将1μmol 的底物转化为产物的酶量定为 1个单位,称为标准单位, 同时规定了酶作用的条件。
因标准单位在实际应用时不够方便, 故在生产上往往根据不同的酶, 制定各自不同的酶活力单位。
在测定酶活力时, 对反应温度、 pH 、底物浓度、作用时间都有统一规定, 以便同类产品互相比较。
但是酶活力单位并不能直接反映酶的绝对数量, 只不过是一种相对比较的依据 [4]。
植酸酶活性的定义为:在最适宜条件下, 每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1μmol 的无机磷所需要的酶量为一个酶活力单位。
确定植酸酶的酶活, 可以提高实验的标准性和效率。
2. 植酸酶活力测定的原理及方法酶活力测定的原理都是利用酶水解植酸钠形成无机磷,然后测定无机磷的释放量。
植酸酶活性的测定方法较多 , 但至今尚没有被世界普遍公认的植酸酶的定量分析方法。
方法包括:钒 -钼酸铵法、硫酸亚铁 -钼蓝法、 Vc-钼蓝法、丙酮 -磷钼酸铵法、微板法和微量比色法等 [5]。
可根据实验需要选择不同的方法。
2.1钒 -钼酸铵法该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机磷的原理。
酸性磷酸酶检测试剂盒（PNP比色法）
酸性磷酸酶检测试剂盒（PNP比色法）酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(PNP 比色法)简介：酸性磷酸酶(acid phosphatase ，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。
溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH 为4.5～5.5。
酸性磷酸酶是一个蛋白家族，哺乳动物中其分子量从18kD 到100kD 不等，该酶分为两类，一类为酒石酸盐敏感型，一类为氟离子敏感型。
溶酶体中的酸性磷酸酶为酒石酸盐敏感型，而红细胞和巨噬细胞中的酸性磷酸酶为氟离子敏感型。
Leagene 酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒(PNP 比色法)(Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p -nitrophenol 。
在碱性条件下p -nitrophenol 呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法(分光光度计)测定处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。
该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的酸性磷酸酯酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、比色杯2、水浴锅或恒温箱3、分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，编号名称TE0034 60T Storage试剂(A): ACP Assay buffer 50ml 4℃ 试剂(B): pNPP2支 -20℃ 避光试剂(C): p -nitrophenol(10mM) 0.2ml-20℃ 避光使用说明书1份尿液通常也可以直接用于测定，冻存，用于酸性磷酸酶的检测。
酸性磷酸酯酶的提取实验报告
酸性磷酸酯酶的提取实验报告酸性磷酸酯酶基础实验实验一酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
图酶反应进程曲线[试剂和器材]1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。
植物根系酸性磷酸酶活性测定
植物根系酸性磷酸酶活性测定1.原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即p-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。
酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（μg·h-1·g-1鲜根或μg·h-1/株）。
2.测定方法1）称取（1.2±0.1）g鲜根，加入8 mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8），然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。
2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于37℃水浴30min。
3）水浴后加入2mL 0.5mol/L CaCl2及2mL 2mol/L NaOH以终止反应，摇匀。
4）2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。
5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值A410。
3.标准曲线的制作1）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表1加入试剂。
表1对硝基苯酚标准曲线配制表2）混匀后，在2500r/min 下离心5min ，再在4000r/min 下离心5min 以0号作为对照，在410nm 波长下测光吸收值，并记录光吸收值A 410。
3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx 及相关系数R ，即对硝基苯酚含量410)(A b a mol n ⨯+=μ。
4.计算方法根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP 生成的对硝基苯酚（p-NP ）的量来表示（μg·h -1·g -1鲜根或μg·h -1/株）。
根系活力测定方法精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版实验一根系活性的测定1．原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的α-萘胺，生成红色的α-羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。
根对α-萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系，日本人相见、松中等人认为α-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对α-萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。
所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。
α-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定α-奈胺含量。
2.药品：（1）40ppm（ug/ml）α-萘胺溶液：精确称取0.10g分析纯α-萘胺，先用2ml95%酒精溶解，加约50ml蒸馏水移入100ml容量瓶中，然后稀释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。
用前稀释25倍（40ml稀释至1000ml）即为40ppm溶液。
（2）１％对氨基苯磺酸溶液：称1ｇ对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸（醋酸）中。
（3）100ppm亚硝酸钠溶液：称0.10g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。
（4）0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液分子量0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）Ｎa2HPO4.2H2O 178.057.1184gＮa2HPO4.12H2O 358.22 14.4004gKH2PO4136.09 3.6292gＮa2HPO4.2H2O 7.1184g (或Ｎa2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中。
3.方法与步骤：(1)α-萘胺标准曲线的绘制：用40ppmα-萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ppm各浓度α-萘胺的配制：用40ppm溶液配制混匀，置室温（20~25度）下５分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml, 摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为０，读取光密度，以α-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。
根系表面组织酸性磷酸酶活性的测定
根系表面组织酸性磷酸酶活性测定一、实验目的掌握根表面和跟组织酸性磷酸酶活性测定的原理和方法二、实验原理以对硝基苯酚磷酸盐为底物，对硝基苯酚磷酸盐在酸性磷酸酶作用下生成对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下水解生成黄色的酚黄，酚黄在波长405nm处具有最大光吸收。
因此，可以利用分光光度计法，通过测量吸光值的确定溶液中酚黄的含量，再换算成酸性磷酸酶活性。
三、材料大蒜根系、芹菜根系四、方法步骤1、标准曲线溶液配制1 2 3 4 5 6 7 0.05mg/mL PNP (ml)0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 50mM柠檬酸缓冲溶液 4.5 4.4 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5 1M NaOH0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 PNP(μg/管）0 5 10 20 30 40 50 A4050 0.097 0.176 0.375 0.569 0.727 0.941标曲方程：y =0.0187x - 0.0012 R² = 0.99912、样品测定2.1根系表面酸性磷酸酶活性测定称取大蒜根尖2cm，共0.2g，芹菜根尖0.5g，分别加入5ml反应液（反应液由0.25mg/mlPNP及柠檬酸缓冲液配制），28℃暗培养10min，然后加0.5ml NaOH 终止反应，然后在405nm处测吸光值。
2.2根组织酸性磷酸酶活性测定取0.2g大蒜根尖，芹菜根尖0.5g，分别加入50mM缓冲溶液4℃研磨成匀浆，定容至10ml，然后4000rmp离心10min，取上清液备用。
量取上清液0.5ml，加入4.5ml柠檬酸缓冲液，在28℃下放置10min,加入0.5mlNaOH液，在405nm处测量其吸光度值。
五、结果计算1.根系表面酸性磷酸酶活性测定：蒜苗根尖m=0.196g，A405=0.862，PNP浓度=46.16μg/5ml蒜苗根系表面酸性磷酸酶活性=1413.06(μg·h-1·g-1Fw)芹菜根系m=0.499g，A405=0.901，PNP浓度=48.25μg/5ml芹菜根系表面酸性磷酸酶活性=580.16(μg·h-1·g-1Fw)2.根组织酸性磷酸酶活性测定：蒜苗根尖m=0.218g ，A405=0.015，PNP浓度=0.866μg/5ml蒜苗根系组织酸性磷酸酶活性=23.84（μg·h-1·g-1Fw）芹菜根系m=0.480g ，A405=0.106，PNP浓度=5.73μg/5ml芹菜根系组织酸性磷酸酶活性=71.66（μg·h-1·g-1Fw）六、讨论。
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植物根系酸性磷酸酶活性测定
1原理
该方法以对硝基苯磷酸二钠（即P-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化
下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根_
据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤
酸性磷酸酶的活性。
酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的
对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（⑷h-1 g-1鲜根或口 g -1/i株）。
2•测定方法
1）称取（1.2 ±.1） g鲜根，加入8mL 0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.8）,然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000 r/min离心15min，静置。
2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入 2mL 0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于 37C水浴30min。
3）水浴后加入 2mL 0.5mol/L CaCI 2及2mL 2mol/L NaOH 以终止反应，摇匀。
4） 2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。
5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值 A410。
3•标准曲线的制作
1 ）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表 1加入试剂
表1对硝基苯酚标准曲线配制表
2）混匀后，在2500r/min下离心5min ,再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，
在410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R,即对硝基苯酚含量n（ mol） a b A410。
4•计算方法
根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对
硝基苯酚（p-NP）的量来表示（° h-1 g-1鲜根或口 g心株）。
即根系酸性磷酸酶活性（g h 1 g 1鲜根）n M 稀释倍数/（W t）
式中：n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度（卩mo）;
M —对硝基苯酚的相对分子质量（139.11g/mol）;
t —反应时间（h）;
W—样品鲜重（g）。
稀释倍数一8
a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0 ）
A: 0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL ）
B: 0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C z H s O z Na 或27.2g C z H s O z Na - 3出0 定容至1000mL ）
14.8ml A + 35.2ml B 混合即得。