分子光谱法
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第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
分子荧光光谱法剖析
达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的
最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出
的光线称为磷光。
由于激发三重态能量较激发单重态低，所以
磷光的波长比荧光的波长稍长。
磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测
到。因此磷光很少应用于分析。
内转换
振动弛豫 内转换 系间跨越
S2 T2
S1
能 量
T1
发
发
射
7
275~345
5
290~380
0
平面刚性构造效应
可降低分子振动，削减与溶剂的相互
作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相像
构造，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
〔2〕 荧光量子产率Φ
物质分子放射荧光的力量用荧光量子产率〔Φ〕 表示：
发射荧光的分 发子 射数 的光子数 Φ= 激发态的分=吸 子收 数的光子数
单重态： 一个分子中全部电子自旋都配对的电 子状态。
三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状 态。激发三重态能量较激发单重态低。
大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且 自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所 以大多数分子在基态时处于单重态。
当分子受光照射时，假设光子能量恰好等于分子的 某两个能级的能量之差，则分子吸取光子并从基态 跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能 级。但其自旋方向不会马上转变，分子仍处于单重 态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转， 生成三重态。
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
荧光是指一种光致发光 的冷发光现象。当某种 常温物质经某种波长的 入射光〔通常是紫外线〕 照射，吸取光能后进入 激发态，并且马上退激 发并发出比入射光的的 波长长的出射光〔通常
紫外—可见分子光谱法
<三> 有机化合物的紫外—可见光谱：
（分子键主要为σ键） 1.饱和有机化合物：
饱和烃分子：σ→σ*跃迁，λmax＜150nm 含N、O、S、X的饱和烃衍生物：n→σ*跃迁 λmax超出测量范 围，作溶剂使用
（分子键主要为π键） 2.单烯烃和共轭烯烃： π→π*跃迁 单烯烃：λmax在170～200nm以内
4.电荷迁移跃迁： 电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向 与接受体相联系的轨道上跃迁，产生的吸收 光谱称电荷迁移吸收光谱。
●实质：是一个内氧化还—原过程
●跃迁的谱带较宽，吸收强度大，ε＞104
<二> 几个术语： 在紫外、可见光谱区产生吸收的基 1.生色团： 团或结构系统。 2.助色团： 含有非键电子对的基团，称助色团。 在某些因素的影响下，化合物的 3.红移和紫移： 最大吸收波长λmax发生变化， 若λmax向长波方向移动，则称 为红移；若λmax向短波方向移 动，则称为紫移。 红移使吸收强度增强（增色效应）， 紫移使吸收强度减小（减色效应）。
H
C H
O
p
n
1．σ→σ*跃迁： 需高激发能，对应于真空紫外区的辐射 频率，波长一般低于200nm，实际应用很 少。 2．n→σ*跃迁： 所需能量较σ→σ*跃迁能量小，可以由 150～250nm区域内的辐射引起，但大多数 吸收都出现在200nm以下的真空紫外区。 3. p→p*和n→p*跃迁： 所需能量都较σ→σ*跃迁低。产生的紫 外—可见光谱，对有机物分析十分有用。 n→p*跃迁属于禁阻跃迁，吸收较弱， ε＝10～100。 p→p*跃迁为强吸收，一般εmax≥104。
一、组成： 辐 射 源
单 吸器
二、光度计类型： <一> 单光束分光光度计
分子荧光光谱法
（1）荧光与结构的关系
电子跃迁类型 * → 的荧光效率高，系间窜跃至三重态的 的速率常数较小，有利于荧光的产生。 共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最 常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的 脂肪族化合物也可能产生荧光 取代基效应： 苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而 给电子基会使荧光增强。
（2）环境因素 ①温度 温度对荧光的影响很大。 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率， 因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶 液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%， 当温度降低至-80 ℃时，荧光产率为100%。 ②pH值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧 光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷 状态，从而使其荧光发生变化。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素 自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光 谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在 通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。 荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐 射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光 度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：
F = K′（I0—I） I0 —入射光辐射强度； I —透射光辐射强度； K′—取决于荧光量子产率（Ф）。
Lambert-Beer 定律：
I I0 e
2.303bc
（3）跃迁的方式：
①无辐射跃迁： 振动弛豫、内转换、系间窜越、外转换 ②辐射跃迁： 荧光、磷光
原子光谱与分子光谱
原子光谱和分子光谱
原子光谱反映原子或离子的性质而与原 子或离子来源的分子状态无关。确定试 样物质的元素组成和含量。不能给出物 质分子结构的信息。
原子光谱为线状光谱
原子光谱和分子光谱
一、原子光谱
（一）核外电子运动状态
原子核外电子的运动状态可以用主量子数、角量子数、磁量 子数、自旋量子数来描述。
1、n决定电子的能量和电子离核的远近。
取值：K、L、M、N。。。。
2、L决定角动量的大小及电子轨道的形状。
符号: s, p, d, f
L=0,1,2,3…..,(n-1)
3、磁量子数m决定磁场中电子轨道在空间的伸展的方向。
4、自旋量子数ms决定电子自旋的方向，顺磁场和逆磁场
ms=1/2,-1/2
原子光谱和分子光谱
➢拉曼光谱法 (RS) Raman Spectroscopy
➢*核磁共振波谱法(NMR) Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy ➢*质谱法 (MS)
Mass Spectroscopy
联用技术发展很电子相对于原子核的运动--电子能级; （△E=1～２０ｅＶ,紫外、可见、近红外） 2.原子核在其平衡位置附近的相对振动--振动能级;
第二节 原子光谱和分子光谱
（二）光谱项 原子的能量状态需要用光谱项来表征。
N2s+1LJ 其中n为主量子数，L为总角量子数
L=∑Li S为总自旋量子数，S=Σms , I J内量子数，是由于轨道运动和自旋运动的相互作 用，即轨道磁距与自旋磁距的相互影响而得出的。
第二节 原子光谱和分子光谱
J=L+S
➢*红外吸收光谱法(IR) Infrared Spectroscopy
第八章 分子发光光谱法molecular_luminescence
• It is determined by the relative rate constants for the processes by which the lowest excited singlet state is deactivated.
kf
k f ki kec kic k pd kd
• Highly conjugated double-bond structures
FLUORESCENCE AND STRUCTURE (CONTD.)
Simple heterocycles do not exhibit fluorescence. The n- *singlet quickly converts to the n- * triplet and no fluorescence is observed.
Chemical Structure
• Fluorescence from singlet states of - * have more intensity than those from n- * transitions as the molar absorptivities for - * absorptions are much higher than those for n- * absorptions.
FLUORESCENCE AND STRUCTURE (CONTD)
Substitutions on benzene ring affect fluorescence maxima and fluorescence intensity as shown in the table.
Electron withdrawing groups decrease intensity
分子荧光光谱法的定量依据
分子荧光光谱法的定量依据
分子荧光光谱法是一种常用的分析方法，其定量依据主要是基于荧光强度与物质浓度之间的线性关系。
在实际应用中，我们可以通过测量样品的荧光强度，来推算出样品中所含物质的浓度。
在分子荧光光谱法中，我们通常会使用荧光素（Fluorescein）等荧光染料作为指示剂。
这些染料在受到激发后，会发出特定的荧光信号。
而这些信号的强度与染料所处环境中的物理化学性质以及染料自身的性质均有关系。
当我们将染料加入待测样品中时，染料的荧光信号会受到样品中其他分子的影响而发生变化。
通过测量这些变化，我们就可以推算出样品中其他分子的浓度。
这种方法通常被称为“内标法”或“标准曲线法”。
在使用分子荧光光谱法进行定量分析时，我们需要先制备一系列不同浓度的标准溶液。
然后，我们可以分别将这些标准溶液与染料混合，并测量它们的荧光强度。
通过将荧光强度与溶液浓度绘制成一条标准曲线，我们就可以得到一个浓度与荧光强度之间的线性关系。
当我们需要分析未知样品时，我们可以将该样品与染料混合，并测量它们的荧光强度。
然后，我们可以利用标准曲线来推算出该样品中所含物质的浓度。
需要注意的是，在使用分子荧光光谱法进行定量分析时，我们需要保证样品中其他分子对染料荧光信号的影响尽可能小。
因此，在实际应用中，我们通常会对样品进行预处理，以去除对荧光信号产生干扰的因素。
总之，分子荧光光谱法是一种简单、快速、灵敏的定量分析方法。
通过建立标准曲线和内标法等手段，我们可以在实际应用中对各种样品进行定量分析。
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
第四章 分子光谱法
紫外可见吸收光谱 分子荧光和磷光光谱 化学发光光谱
一、概述
分子和原子一样，也有它的特征分子能级， 分子和原子一样 ，也有它的特征分子能级 ， 分子内 部的运动可分为价电子运动、 部的运动可分为价电子运动、 分子内原子在平衡位置附 近的振动和分子绕其重心的转动。 近的振动和分子绕其重心的转动。因此分子具有电子能 振动能级和转动能级。 级、振动能级和转动能级。 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 即从基态跃迁到激发态， 即从基态跃迁到激发态，分子吸收能量同样具有量子化的 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： ⊿E＝E2－E1＝hν=hc/λ ＝ 由于三种能级跃迁所需能量不同， 由于三种能级跃迁所需能量不同，所以需要不同波长 的电磁辐射使它们跃迁， 的电磁辐射使它们跃迁，即在不同的光学区域出现吸收或 发射谱带。 发射谱带。
第一节
紫外－ 紫外－可见吸收光谱法
一、紫外可见吸收光谱
紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收190紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收 750nm波长范围内的吸收光谱 。 紫外可见吸收 波长范围内的吸收光谱。 波长范围内的吸收光谱 光谱主要产生于分子中价电子在电子能级间的跃 是研究物质电子光谱的分析方法， 迁，是研究物质电子光谱的分析方法，通过测定 分子对紫外可见光的吸收， 分子对紫外可见光的吸收，可以鉴定和测定大量 的无机化合物和有机化合物。 的无机化合物和有机化合物。
2. 分子磷光：处于最低单重激发态的分子以无辐 分子磷光： 射弛豫方式进入第一最低三重激发态， 射弛豫方式进入第一最低三重激发态，再由三重 激发态跃迁回到基态而发出的光。 激发态跃迁回到基态而发出的光。 分子荧光和磷光同属光致发光， 分子荧光和磷光同属光致发光，磷光发射则 在超过10-5s后发生，并且在激发的电磁辐射停止 后发生， 在超过 后发生 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 3. 化学发光：是化学反应物或反应产物受反应释 化学发光： 放的化学能激发而产生的光辐射。 放的化学能激发而产生的光辐射。
一、概述
分子和原子一样，也有它的特征分子能级， 分子和原子一样 ，也有它的特征分子能级 ， 分子内 部的运动可分为价电子运动、 部的运动可分为价电子运动、 分子内原子在平衡位置附 近的振动和分子绕其重心的转动。 近的振动和分子绕其重心的转动。因此分子具有电子能 振动能级和转动能级。 级、振动能级和转动能级。 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 即从基态跃迁到激发态， 即从基态跃迁到激发态，分子吸收能量同样具有量子化的 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： ⊿E＝E2－E1＝hν=hc/λ ＝ 由于三种能级跃迁所需能量不同， 由于三种能级跃迁所需能量不同，所以需要不同波长 的电磁辐射使它们跃迁， 的电磁辐射使它们跃迁，即在不同的光学区域出现吸收或 发射谱带。 发射谱带。
第一节
紫外－ 紫外－可见吸收光谱法
一、紫外可见吸收光谱
紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收190紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收 750nm波长范围内的吸收光谱 。 紫外可见吸收 波长范围内的吸收光谱。 波长范围内的吸收光谱 光谱主要产生于分子中价电子在电子能级间的跃 是研究物质电子光谱的分析方法， 迁，是研究物质电子光谱的分析方法，通过测定 分子对紫外可见光的吸收， 分子对紫外可见光的吸收，可以鉴定和测定大量 的无机化合物和有机化合物。 的无机化合物和有机化合物。
2. 分子磷光：处于最低单重激发态的分子以无辐 分子磷光： 射弛豫方式进入第一最低三重激发态， 射弛豫方式进入第一最低三重激发态，再由三重 激发态跃迁回到基态而发出的光。 激发态跃迁回到基态而发出的光。 分子荧光和磷光同属光致发光， 分子荧光和磷光同属光致发光，磷光发射则 在超过10-5s后发生，并且在激发的电磁辐射停止 后发生， 在超过 后发生 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 3. 化学发光：是化学反应物或反应产物受反应释 化学发光： 放的化学能激发而产生的光辐射。 放的化学能激发而产生的光辐射。
紫外-可见分子吸收光谱法
NN
溶剂与溶质之相互作用增强 C H
溶质分子的振动受到限制
水中 环己烷中
振动引起的精细结构消失
蒸汽中
500
555
对称四嗪的吸收光谱
/nm
b. 溶剂极性对π →π*跃迁谱带的影响
➢ 溶剂极性增大时，由π →π*跃迁产生的吸收 带发生红移。
c. 溶剂极性对n →π*跃迁谱带的影响
➢ 溶剂极性增大，由n →π*跃迁产生的吸收谱 带发生蓝移。
（4）多通道分光光度计
以光二极管阵列作检测器
光源
透镜
光二极管阵列
试样池
光栅
三、光吸收定律
1、朗伯-比尔定律
A lg T lg I0 bc 或 A lg T lg I0 abc
I
I
2、吸光度的加和性
当溶液中含有多种对光产生吸收的物质，且各组分之
间不存在相互作用时，则该溶液对波长λ光的总吸光度A总
➢ 根据分子轨道理论，这三种电子的能级高 低为： σ<π<n <π*<σ*
三种价电子可能产生六种形式电子跃迁：
σ→ σ*， σ→ π*， π→ σ*对应的吸收光谱处于 远紫外区，研究少。
（1） n → σ* 跃迁：
➢ 吸收光谱出现在远紫外光区和近紫外光区 ➢ 某些含有氧、氮、硫、卤素等杂原子的基 团（如—NH2、—OH、—SH、—X等）的 有机物可产生n → σ* 跃迁。 例如：CH3OH：λmax=183 nm 、CH3NH2：λmax=213 nm
② 吸收峰通常位于200~400nm之间。
（7） K带
➢ 由共轭体系的π →π*跃迁产生的吸收带。
特点：
ε ① 强度大，一般 ＞ 104 L ·mol-1 ·cm-1 ；
分子荧光光谱法(原理和方法)
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
测定分子结构的方法
测定分子结构的方法
测定分子结构的方法主要有以下几种：
1.光谱法：包括紫外光谱、红外光谱、核磁共振和质谱等。
其中，紫外和可见光谱（ultraviolet and visible
spectrum）简写为UV。
2.化学方法：根据价键规律，某些有机物只存在一种结构，可直接由分子式确定结构；通过官能团
的特征反应确定有机物中可能存在的官能团；通过定量实验确定有机物中的官能团及其数目。
3.质谱法：通过质谱仪实验得到质谱图，质谱图中最大质荷比即为有机物的相对分子质量。
4.核磁共振氢谱法：通过核磁共振仪处理化合物得到核磁共振氢谱图，图中不同峰的面积比代表不
同氢原子个数比。
此外，晶体衍射也是测定分子结构的一种方法。
以上方法各有特点，在实际应用中，应根据具体情况选择适合的方法。
分子光谱法
分子光谱法
分子光谱法是一种分析方法，主要用于研究分子结构和其与周围环境相互作用。
通过分析分子吸收、发射或散射的光谱，可以得到有关分子结构、分子间相互作用以及分子在各种环境下的动态行为等信息。
在分子光谱法中，常用的技术包括红外光谱法、拉曼光谱法、紫外-可见光谱法、荧光光谱法等。
这些技术利用不同波长的光与分子相互作用，测量透射光、反射光、散射光或发射光的强度，以获取分子结构和动力学信息。
通过分析这些光谱，可以推断分子的几何结构、振动模式、电子结构以及分子与其他物质的相互作用等信息。
因此，分子光谱法在化学、生物学、医学和环境科学等领域中具有广泛的应用。
分子荧光光谱法原理和仪器
样品池：方形石英池，四面透光。
单色器：荧光计采用滤光片，分光光度计采用光栅
第一单色器用于扫描激发光谱和选择激发光波长； 第二单色器用于扫描荧光辐射光谱和选择荧光发射波长。
检测器：光电倍增管，与激发光成直角
1为什么荧光分析法比紫外分析法具有较 高的灵敏度？
荧光分析法是在入射检测器光的直角方向测 定荧光强度，即在黑背景下进行检测，因此可通 过增加入社强度或增大荧光或磷光信号的放大倍 数来提高灵敏度。而紫外可见光光度法中测定的 参数是吸光度，该值与入射光强度和投射光强度 的比值有关，入射光强度大 投射光强度也随之增 大，增大检测器的放大倍数也同时影响入射光与 透射光的检测，因而限制了灵敏度的提高。
荧光发射时间：10-7～ 10 -9 s 。发射荧光的能 量比分子吸收的能量小。
分析荧光光谱法仪器：
｛荧光计
｝激发光源、样品池、双单色器系统、检 测器、记录仪。
荧光分光光度计
特殊点：有两个单色器 ，光源与检测器通常成 直角。
各部分的作用
光源： 选用激发光源，单色性好、强度大，使 密度和
重复性，以及灵敏度较好。 多采用氘灯和高压汞灯（200～700nm）
• 荧光分光光度计有几个单色器，各有什么 作用？
• 两个，第一个介于光源和试样池之间，用 于选择所需的激发波长，使之照设在被测 试样上。第二个单色器置于试样池与检测 器之间，用于分离出所需检测的荧光发• 分子的多重态：
• 1单重态：一个所有电子自旋都配对的分子的电子 状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基 态中一对电子中一个被激发到叫高能级，其自旋 方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。
• 2三重态：有两个电子自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低
单色器：荧光计采用滤光片，分光光度计采用光栅
第一单色器用于扫描激发光谱和选择激发光波长； 第二单色器用于扫描荧光辐射光谱和选择荧光发射波长。
检测器：光电倍增管，与激发光成直角
1为什么荧光分析法比紫外分析法具有较 高的灵敏度？
荧光分析法是在入射检测器光的直角方向测 定荧光强度，即在黑背景下进行检测，因此可通 过增加入社强度或增大荧光或磷光信号的放大倍 数来提高灵敏度。而紫外可见光光度法中测定的 参数是吸光度，该值与入射光强度和投射光强度 的比值有关，入射光强度大 投射光强度也随之增 大，增大检测器的放大倍数也同时影响入射光与 透射光的检测，因而限制了灵敏度的提高。
荧光发射时间：10-7～ 10 -9 s 。发射荧光的能 量比分子吸收的能量小。
分析荧光光谱法仪器：
｛荧光计
｝激发光源、样品池、双单色器系统、检 测器、记录仪。
荧光分光光度计
特殊点：有两个单色器 ，光源与检测器通常成 直角。
各部分的作用
光源： 选用激发光源，单色性好、强度大，使 密度和
重复性，以及灵敏度较好。 多采用氘灯和高压汞灯（200～700nm）
• 荧光分光光度计有几个单色器，各有什么 作用？
• 两个，第一个介于光源和试样池之间，用 于选择所需的激发波长，使之照设在被测 试样上。第二个单色器置于试样池与检测 器之间，用于分离出所需检测的荧光发• 分子的多重态：
• 1单重态：一个所有电子自旋都配对的分子的电子 状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基 态中一对电子中一个被激发到叫高能级，其自旋 方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。
• 2三重态：有两个电子自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低
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2、
跃迁
处于成键轨道上的 电子跃迁到 反键轨道上，称
为
跃迁。
跃迁吸收峰的波长在20nm附近，其特征是吸 收强度大（ ＞104）。
不饱和有机物，如具有
或
、
等基
团的有机化合物都会产生
跃迁。
第八章 分子光谱法
3、
跃迁
含有杂原子的不饱和基团，如C=O、C=S、N=N等化
合物，其未成键轨道中的n电子吸收能量后，向 反
第八章 分子光谱法
三、分子吸收光谱的基本原理 由光吸收定律及光与物质的相互作用可知，任何一种 物质对不同波长的光的吸收程度都是不相同的。
以溶液为例，将各种不同波长的单色光依次通过一定 浓度和液层厚度的某有色溶液，测量每一波长下该有 色溶液对光的吸收程度（即吸光度），然后以波长为 横坐标，以吸光度为纵坐标作图，即可得一曲线。该 曲线称为吸收曲线或吸收光谱。
分子光谱法分为吸收光谱法（如红外吸收光谱法、紫 外及可见吸收光谱法等）、发射光谱法（如荧光光谱 法）及散射光谱法（如拉曼光谱）三种基本类型。
在一般情况下，分子处于基态，当光与物质发生相互作用时，分子 吸收光能，从低能级跃迁到高能级产生吸收光谱。若分子从高能级 回复到低能级则释放出光能，形成发射光谱。散射光谱是光被物质 散射时，分子内能级的跃迁改变散射光频率而产生的。
第八章 分子光谱法
二、分子吸收光谱中的跃迁类型 化合物分子中主要还有三种类型的价电子，即形成单 键的 电子、形成双键或三键的 电子及未成键的n电子 （也称为p电子）。根据分子轨道理论，分子中这三 种电子的成键和反键分子轨道能级高低顺序为：
分子中不同轨道的价电子具有不同的能量，处于较低能级 的价电子吸收一定能量后，可跃迁到较高能级。在紫外可见光区，吸收光谱主要由 跃迁产生。
对一种分子来说，可以观察到相当于许多不同电子能级跃 迁的许多个光谱带。所以说电子光谱实际上是电子-振动转动光谱，是复杂的带状光谱。
第八章 分子光谱法
利用分子光谱对物质进行定性和定量分析的方法称为 分子光谱分析。 按照分子光谱的记录方式不同可分为两种方法：摄谱 法和分光光度法。
➢摄谱法：感光板记录物质的分子光谱，并利用此光 谱进行分析的方法，该方法的波段区间很窄，只有在 波长λ＜1.20μm时才用此法。 ➢分光光度法：称吸收光谱法或吸光光度法，是将各 复合光色散（分光），然后测定各波长下单色光的光 强的方法，即根据物质对光辐射的选择性吸收（也就 是说物质对光的选择性吸收）来研究物质的性质和含 量的一种方法。
第八章 分子光谱法
第八章 分子光谱法
主要内容： 分子吸收光谱的产生及其分子吸收 光谱法的基本原理 比色法
紫外—可见吸收光谱法 分子发光分析法
第八章 分子光谱法
分子光谱是由分子中电子能级、振动能级及转动能级 发生变化而形成的光谱。 分子光谱法是以分子光谱为基础进行分析的光谱分析 法，是测定和鉴别分子结构的重要手段，是仪器分析 的重要组成部分。
第八章 分子光谱法
3、电子光谱 分子电子能级的跃迁能量约为1~20eV，相应的波长范 围在紫外-可见光区，称为分子电子光谱或紫外-可见 光谱。 因为在同一电子能级上还有许多间隔较小的振动能级 和间隔更小的转动能级，当用紫外、可见光照射分子 时，则不但发生电子能级的跃迁，同时又有许多不同 振动能级间的跃迁和转动能级间的跃迁。
第八章 分子光谱法
8.1 分子吸收光谱的产生及分子吸收光谱法的 基本原理
一、分子吸收光谱的产生 分子从外界吸收能量后，就能引
起分子能级的跃迁，即从基态能 级跃迁到激发态能级。当分子从 一个状态（能级）向另一个状态 （能级）跃迁时，发生了能量变 化（ ），便产生分子吸收光 谱。由于三种能级跃迁所需要的 能量不同，所以需要不同波长的 电磁辐射使它们跃迁，从而在不 同的光谱区出现吸收谱带。
分子转动光谱位于电磁波谱的远红外及微波区，故在 化学上应用不广。
第八章 分子光谱法
2、振动光谱 分子振动能级的跃迁能量约为0.05~1eV，相应波长范 围在近红外区（在化学上常用的范围为2.5~25μm）， 称为分子振动光谱或近红外光谱。
由于分子中在同一振动能级上有许多间隔很小的转动 能级，因此在振动能级发生变化时，同时又有转动能 级改变。所以在一对振动能级发生跃迁时，不是产生 对应于该能级差的一条谱线，而是一组很密集的（其 间隔与转动能级间距相当）谱线组成的光谱带。 对于整个分子来说，就可以观察到相当于许多不同振动能 级跃迁的若干个谱带。所以振动光谱实际上是振动-转动 光谱。
键轨道跃迁，称为
跃迁。这种跃迁所需能量
最小，吸收峰通常都处于近紫外光区，甚至在可见光
区，其特征是吸收强度弱（ 在10~100之间）。
第八章 分子光谱法
4、
跃迁
如含-OH、-NH2、-X、-S等基团的化合物，其杂原子 中的n电子吸收能量后向 反键轨道跃迁，这种跃迁 所需的能量也较低，吸收峰一般在200nm附近，处于 末端吸收区。
第八章 分子光谱法
当分子吸收光子后，依据光子能量大小的不同而引起 转动能级、振动能级和电子能级的跃迁，产生三类吸 收光谱—转动光谱、振动光谱、电子光谱。 1、转动光谱 分子转动能级跃迁所需能量较小，约为0.005~0.050eV， 相应的波长范围在电磁波谱的远红外区及微波区。 分子的转动能主要取决于分子的几何形状、质量等。 它仅对气体分子才有意义。 分子的转动能仅对气体分子才有意义，对液体和固体 没有意义。
第八章 分子光谱法
第八章 分子光谱法
1、
跃迁
处于成键轨道上的 电子吸收光能后跃迁到 反键
轨道，称为
跃迁。
分子中 键较为牢固，跃迁所需的能量最大，因而所
吸收的辐射波长最短，吸收峰在远紫外区。饱和烃类
分子中只含有 键，因而只能产生
跃迁，吸
收峰一般都小于150nm，在常规仪器测定范围之外。
第八章 分子光谱法
第八章 分子光谱法
KMnO4 溶 液 对 波 长 525nm 附近的绿光有最大吸收， 而对紫色色和红色光吸收 很少。光吸收程度最大处 （即吸收峰处）的波长称 为最大吸收波长，常用 λmax或λ最大表示。 KMnO4 溶 液 的 浓 度 不 同 ， 但吸收曲线的形状完全相 似，最大吸收波长也不变。 在最大吸收波长处测定吸 光度，灵敏度最高。