实验五小鼠初级精母细胞染色体畸变试验
实验五小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠骨髓细胞的采集与处理
小鼠麻醉
将小鼠麻醉，并固定在 操作台上。
暴露骨髓
用消毒手术刀切开小鼠 的腿骨，暴露骨髓腔。
采集骨髓细胞
用注射器吸取生理盐水， 冲洗骨髓腔，收集骨髓
细胞。
细胞处理
将采集的骨髓细胞进行 洗涤、离心、分离等处 理，得到所需的细胞样
本。
骨髓细胞的培养与观察
细胞培养
将处理后的骨髓细胞接种在细胞 培养皿中，加入适量的细胞培养 基，在适宜的温度和湿度条件下 进行培养。
率之间存在正相关关系。
本实验为进一步研究致突变物的 致突变作用提供了有力证据，有 助于深入了解致突变物的致癌机
制。
对实验结果的理解与讨论
本实验结果表明，致突变物能够诱导小 鼠骨髓细胞微核的形成，这可能是致突 变物导致基因突变和细胞恶性转化的重 要机制之一。
实验结果还提示，致突变物的致突变作用可 能与其在体内的代谢活化有关，因此需要进 一步研究致突变物的代谢活化过程及其与微 核形成之间的关系。
实验五小鼠骨髓细胞 微核试验
目录
CONTENTS
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 结论与讨论
01 实验目的
了解微核试验的原理
微核试验是一种用于检测染色体畸变和DNA损伤的细胞遗传 学方法。它通过观察细胞中微核（微小的细胞核）的数量， 来评估细胞受到的遗传损伤程度。
染色体结构畸变
分析实验组和对照组的染色体结构畸变类型，如断裂、倒位、重 复等。
染色体数目畸变
观察染色体数目畸变情况，包括非整倍体、多倍体等。
畸变类型与实验条件关系
探讨不同实验条件下染色体畸变类型的差异及其与实验条件的关系。
实验结果与预期结果的比较
兽药临床前毒理学评价试验指导原则
兽药临床前毒理学评价试验指导原则一、概述（一）定义与目的为保障新兽药对使用对象动物（靶动物）的安全，特别是人的食品消费安全，必须对临床前兽药的毒理学（或安全性）进行评价。
目前，对兽药的安全性进行评价一般采取毒理学评价方法，包括三性（急性、亚慢性、慢性毒性）试验和三致（致突变、致畸、致癌）试验，以预测新兽药的安全性。
临床前药物毒理学评价的目的是预测临床用药的安全性，为临床试验提供可靠的参考。
毒理学评价结果不但为最后确定该化合物是否可以作为新兽药使用提供科学依据，还是制订动物性食品中最高残留限量（MRL）的重要依据。
（二）适用范围本指导原则适用于评价兽用化学药品（化学合成药、抗生素、药物饲料添加剂）及消毒剂临床前的安全性。
二、毒理学评价程序及内容兽药毒理学评价试验一般分为五个阶段，具体研究内容如下：（一）第一阶段：急性毒理学试验阶段的测定：所有用途的原料药必做；1.经口LD50的测定：注射用原料药必做，肌注、皮下注射或腹腔注射2.注射途径LD50途径任选一种；3.经皮LD的测定：供皮肤给药的原料药必做；504.皮肤刺激试验：供注射和透皮吸收的制剂必做；5.肌肉刺激试验：供肌内注射的制剂必做；6.眼结膜刺激试验：眼科用、喷雾和易挥发的制剂必做；7.粘膜刺激试验：子宫注入剂、喷雾和易挥发的制剂必做；8.溶血性试验：静脉注射用制剂必做。
（二）第二阶段：亚慢性毒性试验阶段研究内容有：30～90天亚慢性毒性试验：所有原料药必做；（三）第三阶段：致突变试验阶段原料药必做此阶段试验，各种制剂可不做此阶段试验。
1.Ames试验，必做；2.小鼠骨髓细胞微核试验，必做；3.小鼠精子畸形试验或睾丸精原细胞染色体畸变分析试验任选一项，必做；4.小鼠骨髓细胞染色体畸变分析试验，必要时选做；5.显性致死试验，必要时选做；以上致突变试验的组合必须考虑原核细胞和真核细胞、生殖细胞与体细胞、体内和体外试验相结合的原则，任何原料药不能低于三项，必要时做四至五项；如果在1～3项试验有阳性结果或可疑时，可选做第4、5项试验。
实验一 小鼠精子畸形试验
实验目的
通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形 实验的原理和步骤
实验原理
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子
数量增多。
生殖系统对化学毒物的敏感性
用检测雄性动物接触化学毒物后精子畸
形率的高低，来反应该化学毒物的生殖 毒性和对生殖细胞潜在的致突变性。
实验动物和材料
精子形态
实验操作步骤
二、制片
实验操作步骤 三、阅片
低倍镜 找到背景清晰、精子重叠较少的
部位高倍镜 按顺序检查精子的形态。 每只动物检查完整的精子1000个。
实验结果分析与评价
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型
可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、 双头以及双尾等。 精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形 的精子，进行精子畸形类型构成比分析， 并计算每组动物精子畸形百分率。
实验动物：雄性小鼠 （6-8周）24只 实验材料：
1.器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜
纸、吸管
2.试剂：生理盐水、甲醇（分析纯）、 2%伊红水溶液
环磷酰胺（ 50mg/kg ）
实验操作步骤
一、动物分组及处理
动物选择 分组及处理：
阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次 空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
生理学畸胎实验报告模板
生理学畸胎实验报告模板【实验报告模板】实验名称：生理学畸胎实验一、实验目的探究畸胎的生理学特征及相关机制。
二、实验器材1. 畸胎模型动物（如小鸡、小鼠等）2. 实验仪器：手术刀、显微镜、成像设备、温度计等三、实验步骤1. 准备实验器材，确保其处于良好的工作状态。
2. 选取适宜的畸胎模型动物。
3. 对畸胎模型动物进行外科手术，制作畸胎模型。
4. 观察畸胎模型动物的生理学特征，如器官发育异常，身体畸形等。
5. 进行显微镜观察，以进一步了解畸胎的细胞结构及组织构成。
6. 借助成像设备记录和保存观察到的畸胎图像。
7. 分析和讨论实验结果，总结畸胎的生理学特征及可能的发生机制。
四、实验结果与讨论1. 生理学特征：根据实验观察，畸胎模型动物的器官发育异常，身体存在明显的畸形，如肢体缺失、器官变形等。
2. 细胞结构与组织构成：显微镜下观察到畸胎的细胞结构异常，如细胞增生失控、细胞排列紊乱等，组织结构也出现异常，如组织分化不完全、组织结构紊乱等。
3. 可能的发生机制：畸胎的形成通常与基因突变、环境因素、营养不良等多种因素有关。
细胞分裂和发育过程中的基因变异或突变可能导致畸胎的发生。
此外，某些环境因素，如母体患疾病、接触有害物质等，也可能对胚胎的发育产生负面影响。
五、实验总结通过本实验，我们对畸胎的生理学特征及相关机制有了初步的了解。
畸胎的形成可能与基因突变、环境因素以及胚胎发育过程中的异常发育有关。
然而，由于实验中的局限性和复杂性，对于畸胎的具体发生机制仍需进一步的研究和探索。
六、参考文献[1] 张晓丽, 杨小杰, 刘小姣, 等. 畸胎发生机制的研究进展[J]. 中医世界最新医学信息, 2019, 19(38): 101-103.[2] Smith A B C, Jones J K. Abnormal development and pregnancy failure. Postgraduate Medical Journal, 2019, 101(1194): 51-53.[3] Li W, Li H B. Understanding of embryonic malformation: insights from non-model organisms. Development, Growth & Differentiation, 2016, 58(1): 49-60.。
染色体畸变实验
实验十染色体畸变试验可用末梢血淋巴细胞，或人和哺乳动物体细胞系作为材料，常用的体细胞系有中国地鼠卵巢细胞（CHO），中国地鼠肺成纤维细胞（V79和CHL），人胚肺2倍体成纤维细胞等。
这里介绍外周血淋巴细胞为对象的染色体畸变的试验方法。
1．实验原理外周血中小淋巴细胞几乎都处在细胞增殖周期的G1期或G0期（不同于体外培养的体细胞），一般条件下是不会再分裂的。
当在培养物中加入适量的PHA，在37℃下，经52～72h 的培养，淋巴细胞开始转化，进入细胞增殖周期，此时可获得大量的有丝分裂的细胞。
再经过秋水仙素处理，低渗、固定，即可在显微镜下观察到良好的中期染色体分裂相。
电离辐射，化学有害物质作用于机体或体外细胞，均可引起细胞染色体的损伤，且与剂量（浓度）呈良好的线性关系。
因此，染色体畸变已用于电力辐射事故的生物计量估算。
2．方法与步骤（1）试剂①RPMI-1640培养液，含20%小牛血清。
②肝素：每支含肝素12500U，使用时用生理盐水配成500U/ml，4℃冰箱内保存备用。
③秋水仙素：配成40ug/ml浓度。
称取秋水仙素4mg，溶解于100ml 0.85%Nacl 溶液中，经6号细菌漏斗过滤，4℃冰箱内保存。
使用时吸取0.05或0.1ml加入到5ml细胞培养物中，其终浓度为0.4～0.8ug/ml。
④双抗：青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。
⑤PHA:PHA为冰干注射剂（广州生产）每支10mg，使用时用2ml生理盐水溶解。
⑥KCl低渗液：KCl 1.88g，双蒸水1000ml使之溶解，其浓度为0.025M.⑦冰醋酸甲醇固定液：冰醋酸1份，甲醇3份，混合而成。
（2）细胞培养常规细胞培养。
（3）受试物的处理实验分组：至少设立五个组，即阳性对照、阴性（溶剂）对照及三个剂量组。
最高剂量和最低剂量之间相差10倍，中间再设一个剂量，阳性对照物为已知的染色体断裂剂，如丝裂霉素C(MMC)，剂量为0.02μg/ml；黄曲霉素毒素B1，浓度为10-6M等。
实验五小鼠初级精母细胞染色体畸变试验
剂量分组 阴性对照组 溶剂 阳性对照组 丝裂霉素C 1.5～2mg/kg 腹腔注射一次；或环磷酰胺40mg/kg，腹腔注射，1次/d，连续5天。
01
02
试验设计
高剂量 根据急性LD50，选用使动物轻
微中毒，体重略有下降，不引
实验五 小鼠初级精母细胞染色体畸变试验
单击添加副标题
Mammalian Spermatocyte Chromosome Aberration Test
目的
本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可能性。 学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方法的基本操作步骤。
固定液: 甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用时现配, 400ml;
试剂
试剂
磷酸盐缓冲液（pH 6.8） 12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81 g （磷酸氢二钠：4.74g） 磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g 加蒸馏水至 1000 ml Giemsa应用液: 取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成，临用时配制。
仪器和器械
生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻璃染色缸、擦镜纸等。
试剂
04% 秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存;
60%冰乙酸: 临用时现配, 100ml
低渗液：1 %柠檬酸三钠溶液; 1 %枸橼酸三钠溶液；0.4％KCL, 300ml
01
滴片
预冷的玻片
染色 将制备好的标本片放入Giemsa应用液中染色20～30min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓冲液冲洗。晾干。
化学品毒理学评价程序和试验方法 第13部分：哺乳动物精原细胞∕初级精母细胞染色体畸变试验
将制备好的标本片放入Ｇｉｅｍｓａ应用液中染色１０ ｍｉｎ～２０ ｒａｉｎ，用蒸馏水冲洗、晾干。 ６．７阅片
６．７．１标本片编号 所有玻片，包括阳性对照和阴性对照，在镜检前要分别编号。
３．７
多倍体ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ 哺乳动物染色体数目正常是二倍体，在化学诱变剂的作用下，染色体数目成倍地增加成三倍体、四
ＧＢＺ／Ｔ ２４０．１３—２０１ １
倍体等。
３．８
染色体结构的畸变ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ 通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和 断片，染色体互换和内交换等。
６．５．３限量试验
如果试验在不低于２ ０００ ｍｇ／ｋｇ体重剂量水平，用同～日内进行一次或两次染毒时没有产生可观 察到的毒性效应，并且根据结构相似物质的资料也不能推断受试样品有遗传毒性，则可不必考虑在整个 试验中设置三个剂量水平。若受试样品毒性很低，应以５ ０００ ｍｇ／ｋｇ体重剂量水平进行限度试验，外推 到人群暴露的阈剂量试验可能需要采用更高的剂量水平。
６．１．７ Ｇｉｅｍｓａ应用液：取１份Ｇｉｅｍｓａ染液与９份１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲渡混合而成。临用时配制。
全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。
６．２受试样品处理
受试样品一般应新鲜配制。如溶液贮存稳定，可以不必新鲜配制。固体受试样品应溶于或悬于适
２
ＧＢＺ／Ｔ ２４０．１３—２０１１
——环磷酰胺（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＡＳ号５０—１８—０）； ——单水环磷酰胺（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ，ＣＡＳ号６０５５—１９－２）； ——丝裂霉素ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ，ＣＡＳ号５０一０７—７）； ——丙烯酰胺单体（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ，ＣＡＳ号７９—０６—１）； ——三亚乙基嘧胺（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ，ＣＡＳ号５１—１８ ３）。 由于本试验中动物个体之间可能出现反应的变异较大，提倡试验时阳性对照组不应只设一个剂量 水平。
小鼠精子畸形实验
观察与计数
首先，在低倍镜下选择背景清 晰、精子分布均匀、重叠较少的区 域，然后，在高倍镜下观察结构完 整的1000个精子，计数其中畸形的 精子。
精子畸形主要表现在头部。按Wyrobeks 的分类标准，主要类型有：无钩、香蕉形、 无定形、胖头、尾折叠、双头及双尾。
无尾精子、头部重叠的或整个与另一个 重叠的精子均不计数。
缺血、感染、发热等可产生假阳性结果；
各组小鼠精子畸形检测结果
组别
正常组 损伤对照组
高剂量组 中剂量组 低剂量组
动物数 / 受检精子数/ 畸形精子总数/
只
个
个
5
5000
51
5
5000
187
5
5000
259
5
5000
153
5
5000
69
精子畸形率 /％
1.02 3.74* 5.18*
3.06*
1.38
•遗传学终点（genetic endpoint）：遗传学实验观察到的
现象所反应的各种事件。
•遗传学终点分类：共4类
1）基因突变；
2）染色体畸变；
3）染色体组畸变； 4）DNA损伤
1、基因突变检测 Ames试验、果蝇伴性隐性致死试验、正向基 因突变试验 2、染色体损伤检测 染色体畸变分析、微核试验、显性致死试验 3、DNA损伤检测 SCE试验、UDS试验、SCGE试验
器材与试剂
器材：显微镜；镊子；剪刀；平皿 试剂：生理盐水；无水乙醇；2%伊红水
溶液
试验设计
1、试验动物：采用6～8周龄性成熟雄性小鼠
2、接毒剂量及分组：受试物设高、中、低三 个剂量组，同时设阴性和阳性对照组。
微核实验
原理
染色体畸变的产生和微核的形成原理相 同，观察终点不同，染色体畸变只能在细 胞分裂的中期进行观察和分析。为收集足 够的中期相细胞，在收获细胞前，用秋水 仙碱或乙酰甲基秋水仙碱处理，以阻断微 管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的 形成，使分裂间期和前期的细胞停在中期 相。细胞通过低渗，使染色体均匀散开， 然后固定，染色，可在油镜下观察。
结果分析与评价
结果： 以每只动物为观察单位，每只动物观察100个
中期分裂相，计算其畸变细胞率 分析与评价：
1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物 的种属及有关资料相符
2 试验结果可以用多种统计方法处理，所得 结果应该是相同的
3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较， 应该有显著性差异，还应有剂量反应关系
细胞有丝分裂示意图
第一部分：微核试验
• 学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE） 微核测定方法
什么是微核？
微核与染色体损伤有关，是染色体或 染色单体的无着丝点断片或纺锤丝损伤而 丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留 在细胞质中，末期之后单独形成一个或几 个规则的次核，包含在子细胞的细胞质内， 因比主核小，故称微核。各种类型的骨髓 细胞都可形成微核。
实验内容
• 知识点回顾 • 微核试验 • 染色体畸变分析
发生过程长， 频率低
自发突变：物种进化
突变 诱发突变
新品种培育、选择、改良
人类健康危害
发生过程短，频率高； 可为人类利用，也可
能对人有害
突变的类型
遗传损伤
基因突变 染色体结构改变 染色体数目改变
机理 以DNA为靶的损伤：
基因突变 染色体畸变 不以DNA为靶的损伤 染色体数目改变
打散沉淀物，加入37 ℃ 预温的0.075mol/L的 KCl 6ml混匀，于37℃
小鼠骨髓细胞微核及精子畸形实验5
（三）PCE及其微核形态
MN
NCE
MN
MN
MN
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二、正常精子及畸形形态
精子畸形
• 精子畸形如圆锥形头､双头､双尾､尾卷曲等
• 精子畸形率的增高,往往间接反映了睾丸生精功能的障 碍,也必然影响到精子的活力和受精能力｡
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无
香
钩
蕉
头
当前16页，共22页，星期二。
胖 头
当前17页，共22页，星期二。
双头
双尾
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尾折叠
无定型
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双头双尾
当前20页，共22页，星期二。
无定型
当前21页，共22页，星期二。
无钩
当前22页，共22页，星期二。
一、小鼠骨髓细胞形态及微核形态
（一）基本概念
• 微核（Micronucleus，MN）：是在细胞的有丝分裂
后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍 然滞留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝点 断片，或因纺锤体受损而丢失的整条染色体。它在 末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包 含在子细胞的胞质内而形成，因比主核小，故称为 微核。
成熟红细胞，因其核糖体已消失，可通过选择性的染 色而与未成熟红细胞区别开来。
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PCE与NCE在光镜下的区别
胞
名称
胞体
核
PCE 椭圆或圆盘状 无
NCE 圆盘状
无
胞 着色 灰蓝色 桔黄色
质 分布 不均匀 均匀来自当前3页，共22页，星期二。
染色体畸变实验步骤
染色体畸变实验步骤
染色体畸变实验步骤主要包括以下几个阶段：
1.筛选实验材料：选择稳定的、易于培养的细胞株或实验动物，以进行后续实验。
2.构建染色体畸变模型：
化学物质处理：选择合适的染色体分离剂，按照适宜浓度和处理时间进行处理，观察染色体在各个处理条件下的变化。
基因突变：选择目标基因进行突变，可以通过CRISPR-Cas9等技术实现基因的特定编辑。
3.染色体畸变的检测与分析：
染色体核型分析：采集细胞进行染色体制片并染色，通过显微镜观察染色体的形态和数量的变化。
FISH技术：通过探针与靶DNA结合后的荧光信号观察，检测染色体上的具体变化情况。
PCR技术：通过PCR扩增和鉴定、测序等方法，检测染色体上特定基因的变异或突变。
请注意，这些步骤可能会根据具体的实验设计和研究目标有所不同。
在进行染色体畸变实验时，需要严格遵守实验室安全规定，采取必要的防护措施，确保实验人员的安全。
此外，实验过程中需要注意实验条件的控制和数据的记录与分析，以获得准确的实验结果。
消毒产品毒理学实验基本要求
消毒产品毒理学实验基本要求为了确保消毒剂的安全性，消毒剂除在配方组分或杂质（污染物）含量方面必须达到国家有关部门颁发的相关技术法规或强制性标准对它们的禁用或限用的要求外，消毒剂还需进行相应的安全性毒理学评价。
1消毒产品毒理学实验评价程序消毒剂安全性毒理学评价，可分为4个阶段。
（1）第一阶段（急性毒性试验、皮肤刺激试验和黏膜刺激试验）1）急性经口毒性试验2）急性吸入毒性试验3）皮肤刺激试验4）急性眼刺激试验5）阴道黏膜刺激试验6）皮肤变态反应试验（2）第二阶段（亚急性毒性试验和致突变试验）1）亚急性毒性试验2）致突变试验①体外哺乳动物细胞基因突变试验（体细胞基因水平，体外试验）1.5178Y细胞基因突变试验V79细胞基因突变试验②体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（体细胞染色体水平，体外试验）③小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验（体细胞染色体水平，体内试验）④哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验（体细胞染色体水平，体内试验）⑤程序外DNA修复合成试验（DNA水平，体外试验）⑥小鼠精子畸形试验（性细胞基因和染色体水平，体内试验）⑦睾丸生殖细胞染色体畸变试验（性细胞染色体水平，体内试验）小鼠精原细胞染色体畸变试验小鼠精母细胞染色体畸变试验（3）第三阶段（亚慢性毒性试验和致畸胎试验）1）亚慢性毒性试验2）致畸胎试验（4）第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验）1）慢性毒性试验2）致癌试验2各种消毒产品毒理学试验的规定为便于对消毒剂进行毒理学评价，将消毒剂分为三类。
（1）第一类消毒剂：指我国首创或根据国内外文献报道首次生产的消毒剂。
原则上需进行上述4个阶段的毒理学试验。
首先必须做急性经□毒性试验（包括小鼠和大鼠）、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验和三项致突变试验（包括反映体细胞基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平三种类型试验）。
根据试验结果，判断是否需继续做其它试验项目。
（2）第二类消毒剂：指国外已批准生产、现由我国首次生产或首次进口的消毒剂。
专题一兽药的毒理学试验和安全性评价
含底层 培养基 的平皿
8.结果评价
受试组的菌落数大于2倍自发回变数，并有剂 量反应关系和重现性，判为诱变阳性。
二、微核试验
原理： 骨髓细胞染色体经诱变物作用，发生突变后出现断裂，并有部分断片在有丝分裂 后期不移向两极，在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而存留于细胞浆中，形 成一个或几个圆形至杏仁状的结构，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核 小，故称微核（micronucleus）。
37 ℃水浴 增菌培振养荡液培养
增菌培养液
增菌培养液
活菌数不得少于1～2 x 109/ml
增菌培养液
试验步骤
受检物 + 菌液 + S9混合液 或磷酸盐缓 （0.1-0.2ml） （0.1ml） （0.5ml）
加入45 ℃顶层 培养基2ml 混匀
37 ℃水浴 振荡培养20imns
无菌小试管 37 ℃培养48h
组别
剂量
(mg/kg)
1
300
对数剂量 (Xi)
2.4771
2
360
2.5563
3
432
2.6355
4
518
2.7143
5
622
2.7938
合计
-
-
实验动 物数(ni)
10 10 10 10 10 -
死亡动物 数(ri) 0 2 5 7 10 ∑ ri24
死亡率 (pi) 0 0.2 0.5 0.7 1.0
原理：
图示
嗜多染红细胞
诱变物
微核直径相当于红细胞直径的1/20～1/5。
1.动物 成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。 10只/组，雌雄各半。
猪血酶解产物的小鼠初级精母细胞染色体畸变试验
猪血酶解产物的小鼠初级精母细胞染色体畸变试验通过小鼠初级精母细胞染色体畸变试验评价猪血酶解产物的遗传毒性。
方法采用经口灌胃给药，制备小鼠精母细胞染色体标本，观察染色体畸变类型和畸变率。
结果受试物各剂量组总畸变细胞率、常染色体单价体率和性染色体单价体率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；阴性对照组与阳性对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论猪血酶解产物在本试验剂量范围内未见遗传毒性，小鼠初级精母细胞染色体畸变试验为阴性。
猪血酶解产物是由胰酶酶解猪血后得到的产物。
猪血是一种高蛋白、低脂肪、低糖、富含微量元素的营养价值很高的肉类工业副产品，其蛋白质含量为18.9%左右[1]，素有“液体肉”的美称。
我国虽然猪血资源丰富，但利用度极低，利用率不超过10％，并且利用猪血资源开发的产品还比较单调，除了小部分被加工成血粉或发酵血粉作为饲料添加剂，以及用于生化制药生产血红素、超氧化物歧化酶、蛋白胨外，大部分都作为废弃物排出，既浪费了宝贵的蛋白质资源，又严重污染了周围的环境[2~3]。
采用酶水解技术可以将猪血中的蛋白质降解为多肽、小肽及氨基酸等，更利于人体消化吸收。
但猪血酶解产物应用于人体之前，应对其进行食品毒理学安全性评价。
目前，国内主要应用小鼠精子畸变试验来评价受试物遗传毒性，但由于该试验结果精度不好且实验周期长等原因，国外已普遍采取哺乳动物染色体畸变试验，我国也有趋势主要采取此试验与国际毒理学安全性评价接轨。
小鼠初级精母细胞染色体畸变试验已应用于食品毒理学安全性评价中，随着卫生监管部门工作的加强，越来越多的健康相关产品进行此项测试。
对小鼠初级精母细胞染色体畸变试验的方法进行了探讨并应用于猪血酶解产物遗传毒性的研究。
1 对象与方法1.1 受试物猪血酶解产物干燥物，由四川农业大学食品系提供。
1.2 实验动物由四川大学医学实验动物中心提供的健康昆明种雄性小鼠，体重为25～30g，医学实验动物合格证号：SCXK（川）2009-09。
肠卫士植物胶囊安全性毒理学评价
肠卫士植物胶囊安全性毒理学评价高明菊;崔秀明;赵爱;柯金虎;马妮【期刊名称】《现代中药研究与实践》【年(卷),期】2010(024)004【摘要】目的研究肠卫士植物胶囊作为保健食品的安全性.方法采用小鼠急性经口毒性试验,Ames试验,小鼠骨髓微核试验,小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变试验,30 d喂养试验,观察肠卫士植物胶囊的毒理作用.结果雌雄小鼠急性经口毒性试验,属无毒级;Ames试验、小鼠骨髓微核试验和小鼠睾丸初级精母细胞染色体畸变试验均未检出诱变活性;样品30 d喂养试验的最大未观察到最大无作用剂量(NOAEL)为2 000 mg/kg b.w..结论肠卫士植物胶囊无明显毒性,符合保健食品的安全性要求.【总页数】3页(P34-36)【作者】高明菊;崔秀明;赵爱;柯金虎;马妮【作者单位】文山三七研究院新产品开发研究所,云南,文山,663000;文山七丹药业股份有限公司,云南,文山,663000;文山三七研究院新产品开发研究所,云南,文山,663000;文山七丹药业股份有限公司,云南,文山,663000;文山三七研究院新产品开发研究所,云南,文山,663000;文山七丹药业股份有限公司,云南,文山,663000;文山三七研究院新产品开发研究所,云南,文山,663000;文山三七研究院新产品开发研究所,云南,文山,663000;文山七丹药业股份有限公司,云南,文山,663000【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.大豆肽胶囊的安全性毒理学评价 [J], 杨晓;王畋;刘畅;黄莹2.肠卫士植物胶囊通便功能研究 [J], 马妮;崔秀明;赵爱;柯金虎;高明菊3.雨生红球藻软胶囊安全性毒理学评价 [J], 王彦武;覃光球;何励;彭亮;高玉秋;王绍龙4.藏悠游胶囊安全性毒理学评价及提高缺氧耐受力功能研究 [J], 张娟; 李水仙; 王春芳; 赵岩; 祝清芬5.圣极^(■)益青胶囊的毒理学安全性评价 [J], 马文俊;刘有菊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
体外哺乳动物细胞染⾊体畸变试验九、体外哺乳动物细胞染⾊体畸变试验In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test1 范围本规范规定了体外哺乳动物细胞染⾊体畸变试验的基本原则、要求和⽅法。
本规范适⽤于检测化妆品原料及其产品的致突变性。
2 规范性引⽤⽂件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)3试验⽬的本试验是⽤于检测培养的哺乳动物细胞染⾊体畸变，以评价受试物致突变的可能性。
4 定义染⾊体型畸变(Chromosome-type aberration)：染⾊体结构损伤，表现为在两个染⾊单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。
染⾊单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染⾊体结构损伤，表现为染⾊单体断裂或染⾊单体断裂重组的损伤。
染⾊体数⽬改变(Numerical aberration)：所⽤细胞株的正常染⾊体数⽬的变化。
结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，⽤显微镜检出的染⾊体结构改变，表现为缺失、断⽚、互换等。
有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之⽐值；是⼀项反映细胞增殖程度的指标。
5 试验基本原则在加⼊和不加⼊代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。
⽤中期分裂相阻断剂（如秋⽔仙素或秋⽔仙胺）处理，使细胞停⽌在中期分裂相，随后收获细胞，制⽚，染⾊，分析染⾊体畸变。
6 试验⽅法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。
当外源性活化系统不存在时，可使⽤甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸⼄酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、⼄基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。
小鼠骨髓细胞染色体畸变实验ppt课件
1
一、实验目的
1.学习骨髓细胞制片技术 2.学习和掌握骨髓细胞染色体畸变测定方法
二、实验原理 同微核 ຫໍສະໝຸດ 核在有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质 染色体畸变只能在细胞分裂中期相进行观察
三、实验步骤
1.染毒：CP腹腔注射（100mg/kg）一次
2.细胞周期同步化：处死前2-3小时腹腔注射秋水仙碱 400mg/L，4mg/kg
6.制片：试管内余下约0.5ml，冰冻玻片滴片，干燥。
7.染色：Giemsa染液染色3分钟。
8.阅片：油镜下计数100个中期相细胞，畸变细胞率
四.注意事项
1.骨骺端
2.滴片：距玻片5-8cm。过低染色体分散不开，过高细胞 破裂
3.低渗：时间过长染色体短胖，不清楚；时间过短染色体 不分开。
Thank You for Your Attention
3.取样：双侧股骨→PBS（pH6.8）5ml冲洗骨髓腔→离心 1500rpm/min→弃上清
4.低渗：0.075M KCl6ml,37°c孵育15分钟→加入固定液 1ml预固定1分钟→离心1000rpm/min十分钟，弃上清
5.固定：固定液4ml，37°c孵育20分钟→离心十分钟 （1000rpm/min），弃上清。重复一次步骤5.
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7、染色 将制备好的标本片放入Giemsa应用液 中染色20～30min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓 冲液冲洗。晾干。
8、读片 在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、
分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细
胞，再在油镜下选取邻近无游离染色体或中
期相的细胞进行观察。
9．观察 每只动物分析100个中期分裂相
细胞。 （1） 裂隙、断片、缺失、微小体、环状
实验五 小鼠初级精母细胞染色体畸变试验
Mammalian Spermatocyte Chromosome Aberration Test
目的
本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效 应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体 哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评 价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可 能性。 学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方 法的基本操作步骤。
滴管吹打至不透光，立即加入4mL固定液，
用滴管打匀，移入离心管，以1 000r/ min离
心10min。 6、制片 弃去大部分上清液，留下约0.5～ 1mL，充分打匀制成细胞悬液。将细胞悬液 均匀地滴于冰水玻片上，轻吹细胞悬液扩散 平铺于玻片上。每个睾丸制片2～3张。空气 干燥或微热烘干。
滴片
预冷的玻片
天的方法。 取样时间 各组均于第一次接触后第12～14
天将动物处死采样。
操作步骤
1、注射秋水仙碱 动物处死前6h腹腔注射 秋水仙碱4mg/kg（0.04％，0.1ml/10g） 2、动物处死 颈椎脱臼处死小鼠，取两侧 睾丸，去净周围组织和脂肪，放入盛有 转入另一小平皿中 。
适量低渗液的小平皿中，洗去毛和血污，
仪器和器械
生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊 子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心
管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻
璃染色缸、擦a）染液
Giemsa染料
甲醇
3.8 g
375 ml
甘油
125 ml
配制：将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔 细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后， 再加入125ml甘油，混合均匀。置37℃恒温箱 中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的 充分溶解。取出过滤，两周后使用。
染色体、整倍体和非整倍体改变等。
（2）相互易位 涉及非同源染色体间末
端断片的交换，需要两次断裂和修复。
（3）X-Y和常染色体的单价体
结果评价
统计学方法：受试样品组与对照组的断片、易位、畸
变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别
按X2检验或Kastenbaum 和Bowman所述方法进行统计 分析。 阳性：受试样品组染色体畸变率与阴性对照组相比， 统计学意义上有显著性差异，并有明显的剂量—反应
原 理
不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性 不同，初级精母细胞对化学诱变剂较敏感。多数情 况下，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复 制期。哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初 级精母细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后 孵育的细胞不再进行DNA合成，故受试物需在前细 线期给予。于小鼠第一次接触受试物后的第 12～14 天采样制片，可观察到前细线期接触引起的精母细 胞染色体畸变效应。
1.5 ～ 2mg/kg
腹腔注射一次；或环磷酰胺 40mg/kg ， 腹腔注射，1次/d，连续5天。
试验设计
－剂量组 高剂量 根据急性LD50，选用使动物轻
微中毒，体重略有下降，不引
起动物死亡的剂量 按等比级数2向下设置中、低剂量组
接触途经
与实际接触途经一致或接近，
可一次接触，也可每天接触一次，连续5
关系或在一个受试样品组出现染色体细胞畸变数明显
增高。
若统计学上差异有显著性，但无剂量—反应关系，则
须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。
小白鼠的染色体分裂相（2n＝40）
小白鼠的染色体
3、低渗 用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻
分离曲细精管，加低渗液10mL，用滴
管吹打混悬曲细精管，室温下低渗20～
40min（低渗时间依室温条件而定）。 4、固定 仔细吸净低渗液，加固定液 10mL，固定20min。必要时可存放在冰 箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉，
再加入新鲜固定液，固定10min。
5、软化 吸净固定液，加60％冰醋酸2mL，
钠：4.74g）
磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g
加蒸馏水至 1000 ml
Giemsa应用液:
取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L 磷酸盐缓冲
液混合而成，临用时配制。
试验设计
实验动物 7～12周龄健康雄性小鼠，每组保
证至少5只存活
剂量分组
– 阴性对照组 溶剂 – 阳性对照组
丝裂霉素 C
试剂
0.04% 秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱
保存;
低渗液：1 %柠檬酸三钠溶液; 1 %枸橼
酸三钠溶液；0.4％KCL, 300ml
60%冰乙酸: 临用时现配, 100ml 固定液: 甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用
时现配, 400ml;
试剂
磷酸盐缓冲液（pH 6.8）
12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81 g （磷酸氢二