(完整版)木质素酶活力的测定方法

1前言

草菇是一种著名的食用菌，营养丰富，味鲜美，深受人们的喜爱。草菇子实体含有人体必需的8种氨基酸，占其他氨基酸总量得38.2%，还含有14种维生素[1]，不愧为一种比较理想的天然保健食品。草菇喜高温高湿，生长速度快，生长周期短，一糙只需25天左右，在广西每年4月至9月均可以种植，是一种很有发展前途的食用菌，生产和市

场前景广阔。

栽培草菇的生物学效率比较低（鲜菇与栽培料的比值），用稻草栽培草菇的生物学效率大都在10—15%左右。过去研究认为草菇主要利用纤维素、淀粉，不大利用半纤维素以及木质素。因为草菇的半纤维素酶活性低，又缺乏降解木质素的酶类，但是农作物秸杆中一般含有半纤维素15—30%，木质素占10—30%。为此，本试验用透明圈法、氧化圈法观

测V

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、V

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、V

6

、V

广

、V

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六个菌株所产的胞外酶利用分解半纤维素，木质素的能

力，看是否能够从其中初步筛选出利用半纤维素、木质素较强的菌株来。探讨更合理地配制栽培料的途径对提高草菇的生物转化率有重要意义。

2 实验原理

半纤维素是由五个碳原子为主的木糖聚合的高分子化合物，经木聚糖酶降解利用之后，基质生成透明圈[2]。木质素是以苯环为基本结构的复杂大分子的有机化合物，含碳60—66%，在多酚氧化酶、过氧化酶降解后，能与愈创木酚进行反应生成棕红色或棕褐色轮环[3]。亮兰试剂与蛋白质结合兰青色、在与过氧化酶作用则呈黄色透明圈[4]。通过相应的平板基质培养，草菇菌丝分泌的酶类降解利用后，形成的透明圈迟早、直径大小、色泽深度等初步判断是否存在半纤维素酶和木质素酶降解酶类及其活性。

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 菌株

V 9购至广西大学微生物研究所，V

广、

V

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购至广西农业科学院生物技术研究所，V

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、

V

展2

、V

展3

采至广西现代农业展示中心经组织培养所得。

3.1.2 试剂

可溶性淀粉、亮兰溶液自配、半纤维素自已提制、愈创木酚为国产分析纯、木聚糖为进

口。

3.2 试验方法

3.2.1 试剂配制

3.2.1.1 亮兰溶液配制

25 ml亮兰溶于25ml浓度为90%乙醇中，加入85%的H3PO4，最后定溶至500ml，灭

菌。

3.2.1.2 愈创木酚试剂配制：

0.4ml愈创木酚药品，用100ml水酒精溶解。

3.2.2 半纤维素提取

3.2.2.1 稀酸高温提取法[5]

50g玉米芯装入500 ml三角瓶加入0.1%的硫酸0.5ml,加无菌水至500ml,60℃下浸泡12h,去渣取液→按原料干重加水至500ml→浴煮10min(120℃高压) →冷却,加酒精,

用离心机离心分离→取沉淀物。

3.2.2.2 浓碱液提取法[6]

玉米芯切碎→烘干→粉碎→过40目→取6个500ml三角瓶，每瓶装25g玉米芯粉→每瓶加水300ml→置入高压锅126℃煎40 min→过滤取渣→每瓶加入10%NaOH300 ml→移入水浴锅内90℃水温提取半纤维素2h→过滤取滤液，用1：1HCL中和到PH6.0～7.0→离心15～20min（3500r/min）→取沉淀粉加入95%乙醇浸过液（或移入40℃温箱）→24h

后离心取沉淀物。

3.3 平板培养基制作

3.3.1 淀粉酶测定培养基

4.0g可溶性淀粉、4.5g琼脂、1.0g蛋白胨、1.3g NaH2PO4加水220ml→调PH=6.5

→倒入12付培养皿,每皿15ml→0.1Mpa下灭菌30 min。

3.3.2亮兰培养基

20g木薯根、20g木薯叶、4.5g琼脂、1.0gKH2PO4、2.0g葡萄糖，加220 ml水煮至

200 ml→0.1Mpa下灭菌40min.

3.3.3 半纤维素培养基制备

烘干的半纤维素2.5，磨碎倒入烧杯中,加220ml水解，再加琼脂3.0，酵母膏0.6，1.0gNa2HPO4，0.1gMgSO4，1.0gNH4NO3煮至200 ml倒12付培养皿→0.1 Mpa下灭菌40 min。

3.3.4 木质素酶测定培养基制备

20g木薯块根，20g木薯茎叶，加水220 ml煮至200 ml双层沙布过滤→加入

1.0gKH2PO4，糖

2.0g，酵母膏2.0g→PH=7.0，加入0.04%的愈创木酚2ml[7]，摇匀倒12

付平板→0.1 Mpa下灭菌40 min。

3.3.5 半纤维素测定培养基双层平板制备

下层平板—水琼脂培养基：琼脂2.5加水130 ml煮至120 ml,倒12付培养皿→灭

菌。

上层平板—水解圈制作：配方同上述半纤维素培养基配方一样→装入300 ml的三角瓶灭菌→待下层培养基冷却后，用灭菌过的量筒均匀倒入12付培养皿中。

3.3.6 对照实验