基因检测技术在肺癌精准治疗中的应用-靶向捕获测序与ddPCR比较
【肺癌篇】精准医疗到底精准了啥看看在肺癌治疗中的进展
【肺癌篇】精准医疗到底精准了啥？看看在肺癌治疗中的进展肺癌是临床精准医疗研究较为成熟的一种疾病，目前已找到一系列相关的疾病驱动基因，如EGFR、ALK、ROS1等，并开发出了相应的靶向药物，如吉非替尼、西妥昔单抗等。
虽然靶向药物治疗比传统化疗效果更好，但只有携带特定透分子遗传标记的人群才可从中受益，且在使用过程中容易产生耐药性，这些都极大影响了靶向药物的临床应用。
下文主要探讨精准医疗在肺癌研究中的进展。
肺癌分子特异性差异显著测序技术的发展为肿瘤发生机制的探索带来了新的契机，研究发现肺癌患者体内可以改变正常蛋白表达的基因突变高达150种，比其他的恶性肿瘤高出30-60倍，这可能是肺癌发生率偏高的原因之一。
目前临床已经完成对肺腺癌、肺鳞癌及小细胞肺癌（SCLS）样本的全基因组测序，结果收录在美国癌症和肿瘤基因组数据库（TCGA）中。
这些测序结果揭示了肺癌患者中的基因突变（突变或拷贝数变化）模式，如图1所示。
图1 不同组织类型肺癌基因突变分子模式测序结果显示无论哪种类型的肺癌患者，TP53都是突变频率最高的基因（肺腺癌中为46%，小细胞肺癌中为86%），但3种组织类型的基因突变图谱差异显著：肺腺癌中除了TP53以透外的另4种突变频率最高的基因为KRAS、CDKN2A、MLL3和STK11，鳞癌则为PIK3CA、SOX2、CDKN2A和TP63，而小细胞肺癌则是RB1、EP300、MLL2和SMO。
虽然这些突变都可能改变关键蛋白的表达水平或蛋白构象，导致正常生理功能发生改变，从而促进癌症的发生发展（如KARS基因突变后其产物构象发生变化，激活了下游信号通路，诱导癌变发生），但目前临床开发的靶向药物还非常少，只有有限的几种靶向药物，如靶向EGFR的药物如吉非替尼、埃罗替尼及阿法替尼及靶向ALK、ROS1和MET的克里唑替尼等。
肺癌治疗之EGFR靶向治疗表皮生长因子受体（EGFR）是肺癌的主要驱动基因，也是目前临床应用比较成熟的靶向治疗基因，该突变在3种肺癌中都能检测到，肺腺癌患者中最高，常见于女性或非吸烟患者。
DDPCR技术单细胞级别健康基因常态分布研究的新里程碑
DDPCR技术单细胞级别健康基因常态分布研究的新里程碑在过去的几十年中，基因研究领域取得了巨大的突破，从而使我们对基因如何影响健康和疾病的理解更加深入。
其中，单细胞级别的研究对于揭示人类基因表达的整体模式以及疾病发展的分子机制至关重要。
最近，一个名为数字式PCR（Digital Droplet PCR，简称DDPCR）的新技术在单细胞级别健康基因常态分布研究方面取得了重要进展，这标志着这一领域的一个新的里程碑。
DDPCR技术是PCR技术的一种改进型，它具有高度分辨率和灵敏度的特点，可以在单细胞水平上精确测量基因表达。
与传统PCR技术相比，DDPCR技术通过将样本分成大量的微小液滴，每个液滴中仅含有一个细胞和一份DNA模板，从而避免了PCR反应中的扩增偏差。
通过实时监测每个液滴中的反应结果，DDPCR技术可以准确测量出单个细胞中每个基因的表达水平。
最近，科学家们利用DDPCR技术在单细胞级别对健康基因的常态分布进行了详细研究，并取得了一系列有意义的发现。
首先，在健康人群中，研究人员发现了大量基因表达的变异性，这些变异性反映了不同个体之间的基因表达模式的差异。
通过对多个器官和组织的单细胞样本进行分析，科学家们可以绘制出健康人群中基因表达的整体模式图，从而深入了解基因在不同细胞类型和组织中的表达差异。
更重要的是，这项研究还揭示了许多基因的表达在细胞之间存在明显的异质性。
在单细胞级别，同一种细胞类型中的不同个体之间存在着基因表达的差异，这提示了基因在细胞分化和分裂过程中的动态变化。
此外，研究人员还发现了一些基因的表达在特定细胞类型中呈现出明显的“噪声”特征，这可能与基因调控网络的复杂性以及个体差异有关。
通过DDPCR技术的应用，研究人员还得以对健康基因表达的异常情况进行深入研究。
他们在癌症患者的单细胞样本中发现了许多异常基因表达的模式，这些模式可能与癌细胞的发展和转移有关。
此外，研究人员还发现了一些潜在的健康基因变异，这些变异可能会增加患者患上某些疾病的风险。
基因检测技术在肺癌精准治疗中的应用靶向捕获测序与ddpcr比较
EGFR L858
通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内 部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异 质性有帮助。
NGS和ddPCR都可分辨分子顺式/分子反式
基因检测技术在肺癌精准治疗中的 应用靶向捕获测序与ddpcr比较
测序技术的发展带来靶向治疗的纵深研究
Li TH, et al. J Clin Oncol 31:1039-1049
PCR技术也经历了3代的进化
对NSCLC驱动基因的认知随着分子检测技术 的进步在不断深入
Ashley J. Vargas et al，Nature Reviews Cancer 16, 525–537 (2016)
NGS与ddPCR在肺癌8基因检测对比
NGS组织
NGS血液
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
可以
难
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
ddPCR组织 已知 已知 已知 已知 很好 已知 已知 已知
约3/4 ALK融合为经典的EML4-ALK融合， 但有1/4为与其他基因的融合，包括：
• STRN-ALK • CATSPERB-ALK • ACVR1-ALK • CLIP1-ALK • DPH6-AS1-ALK • KIF5B-ALK • RP11-320M2.1-ALK • UGP2-ALK
基因检测+ 靶向药物:一把钥匙打开一把锁
基因检测+ 靶向药物:一把钥匙打开一把锁作者：史美琪、赵怡卓来源：《祝您健康》 2019年第5期【受访专家】史美祺江苏省肿瘤医院肿瘤内科主任医师赵怡卓上海交通大学医学院附属胸科医院呼吸内科主任医师〇肿瘤患者的希望:靶向药物2019 年4 月1 日,陈先生(化名)为患肺癌的母亲取靶向药吉非替尼。
拿到收费单,陈先生的脸上露出了惊喜的笑容,药价从每盒1580 元降到了498 元,每个月的经济负担减少了2/3。
自今天起,治疗晚期肺癌的国产靶向药伊瑞可(吉非替尼片)的药品价格大幅下降,江苏率先实施新价格,陈先生的母亲幸运地成为首批受惠患者。
据江苏省肿瘤医院肿瘤内科史美祺主任介绍,肺癌的发病率和死亡率在我国都是第一位。
我国每年近80 万的肺癌新发患者,至少20 余万人有EGFR 基因突变,加上很多已经在接受EGFR TKI 治疗的老患者,总计百万以上的患者目前都在使用这类靶向药物。
吉非替尼药物价格调整后,这些家庭都将可能从中受益。
何为靶向药物?靶向药物是随着当代分子生物学、细胞生物学的发展产生的高科技药物,它通过与癌症发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用来阻止癌细胞的生长。
史主任介绍,我国肺癌大多为中晚期,在没有靶向药的时代,晚期患者的中位生存期能有一年就很不容易了。
而靶向药物的出现给有基因突变的晚期肺癌患者带来了生机。
早年美国的《自然》杂志曾这样报道,“神奇的小药丸,每日一粒,就可把病控制住”。
吉非替尼片对亚裔患者疗效尤为显著,因此被誉为“上帝送给亚裔患者的礼物”,成为肺癌患者心中的明星抗癌药。
国内很多晚期肺癌患者的生存期从不到1 年,到现在超过2 年,甚至8 年、10 年或更长时间都有可能,他们的命运就此改变。
尽管靶向药物疗效很好,但对绝大多数癌症患者来说,却是可望而不可即。
2018 年7 月,一部火爆全国,名为《我不是药神》的电影,就讲述了肿瘤患者因无法承受抗癌药物的高昂价格,想尽办法、历尽艰辛求药的故事。
靶向PCRCTC检测技术帮助临床医生更全面地评估肺癌
Lung Cancer in Solid Tumor in China
？
=
液态活检
通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基 因组信息来评估肿瘤
病理活检
通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤
CTC ctDNA
mircoRNA LNC RNA
Others
传统的组织细胞学检测
W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007
CTC富集技术
CTC检测技术
CTC 检测方法
=
✓ 密度与大小
✓ 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集)
+
✓ 靶向PCR ✓ 免疫荧光
✓ 普通PCR
✓ 微流体
负向富集
优势：回收率100% 劣势：纯度略低
正向富集
优势：纯度高 劣势：回收率低（漏掉CTC）
检测原理
FR阳性靶标
负向富集
靶向PCR
•肺癌细胞FR(叶酸受体）高 度表达 •CTC：FR=1:50万 •EMT转化不影响FR丰度 •其他血细胞不表达FR
•CTC回收率接近100% •磁珠富集易操作和自动化
•灵敏度超高，负向富集可满足 检测要求 •信号二次放大，1个CTC信号 放大10^12倍 •无需人工经验判读，结果客观 准确 •可实现CTC的定量
称之为DTC（disseminated Tumor Cell）， 只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微 转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿 瘤远处转移2
肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少， 可间接反应肿瘤发生发展的功能状态
1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015
ngs肺癌临床应用PPT课件
4
测序成本迅速下降，超过了摩尔定律 Cost is Decreasing Exponentially, Beating Moore’s Law
单人全基因组测序成本（美金）：
HGP: $3 Billion
2004: $30,000,000
2008: $100,000
2010: $10,000
2011: $4,000 2014: $1,000
Sequencing Gets Cheaper and Faster
???:
$100
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目前高通量测序大量应用于国内外临床癌症研究
2013年NEJM发表的临床文献，43%运用高通量技术
6
21世纪的癌症分型需要病理和分子联合进行
– ASCO 2014, Chicago, Dr. M Stratton ( 英国首相医学顾问）
结论：
• •OIVS多期因PI素3K分异析常：肺考鳞虑癌到患年者龄的、生性存别较、差KPS因素后，仍然显示PI3K与生存期短相关
• 脑转移在PI3K异常的患者中更常见，且仅出现在PI3K异常的患者中 - • HPRI3K=通3.路3，活(9化5具%C有I:1不.5同-7的, p生=物0.0学3特) 点，以该通路为靶点的治疗方法可能是伴脑转移的肺鳞
VHL1 1.4% PTPN11 GNAS
0.7% 0.7%
MLH1 4.9%
PIK3CA 14.1%
EGFR 43%
KRAS 17.6%
140例日本肺腺癌
与欧美人群不同，EGFR依然是亚裔腺癌最常见的驱动基因
Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7572. Wu YL, et al. 2011.
微滴度PCR(ddPCR)的原理和最新应用
+
Throughput Cost
++++ + + +
+++
Low High Very High High Moderate
Abs. Quant
+ NA NA ++ ++++
ddPCR尤其适合：
基因相对表达变化差异较小（<2倍）的研究
低丰度基因或单细胞的表达分析，以及RNA编辑、等位基因差异 表达等研究
（by 澳大利亚国家计量院）
（DNA定量分析、绝对定量）
ddPCR的技术特征（二） ：优秀的准确度、精密度和重复性
（肿瘤相关microRNA定量分析、方法学对比）
ddPCR的技术特征（三）：对PCR抑制剂的容忍度更高
背景：验证抑制剂对ddPCR反应结果的影响 方法：采用经验证的CMV qPCR体系对UL123 和UL55进行扩增，并加入SDS、EDTA和肝素 作为抑制剂
案例2：单细胞基因表达分析
热休克蛋白在环境胁迫响应中的作用，及其与神经紊乱的关联
来自精神分裂症（SZ）患者 的神经前体细胞（NPC）， 在面对环境刺激（酒精、甲 基汞）时，HSP70的表达量 会上升
单细胞ddPCR 定量HSP70 mRNA
( Yale University School of Medicine)
案例2：肝癌患者体内乙肝病毒HBV 的拷贝数检测
实验结论： 1、ddPCR的灵敏度和准确度比real-time PCR更高——131个待测样
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用发布时间:2014-07-19 来源:毕业论文网随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。
与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。
从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。
其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。
2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因 PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。
同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。
此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。
2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。
近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。
同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。
目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
一文读懂基因检测和靶向治疗
一文读懂基因检测和靶向治疗在我们面临的所有疾病中，癌症是最令人恐惧的疾病之一。
简单来说，癌症是由于一组或多组基因突变导致的细胞功能异常，形成了快速、无限制生长的恶性肿瘤。
也就是说，癌症本质上是一种基因病——原本在正常细胞中发挥重要生理作用的基因，在某些条件下，如病毒感染、化学致癌物或辐射作用等，被异常激活，转变为致癌基因，诱导细胞发生癌变。
既然是基因病，那么我们能不能通过一些手段来监测突变的基因，进行基因修改，从而治愈癌症呢？基于这个思路，基因检测应运而生！基因检测就是针对肿瘤的基因图谱进行测试，从而确定到底是发生了哪些突变的过程。
随着基因分子水平研究的不断深入，越来越多的肿瘤细胞信号通路被发现，大量临床研究表明，通路中的特定基因的扩增/突变/表达状态与靶向、化疗药物的有效性密切相关。
因此，临床上检测这些通路中特定基因情况，能针对性地为每位患者制定一套最适合的治疗方案，从而最大程度地提高治疗的有效率，减少药物的毒副作用，避免用药不当贻误治疗机会。
目前，化疗总体有效率在30%到40%，而通过基因检测筛选出获益病人，有效率可以提高到80%。
分子检测为癌症治疗模式带来了翻天覆地的变化，癌症治疗开始迈入个性化治疗的新天地。
那么，哪类患者需要做基因检测?广义上讲，所有肿瘤患者均可以接受基因检测。
狭义上讲，根据指南推荐，不同的病种、不同的分期、出于不同的目的，不同的患者，适合做不同的基因检测。
比如，一个晚期肺腺癌患者，尚未接受任何治疗，家庭经济情况一般，只是为了看看，是否有合适的靶向药可用，那么只要测一下最常见的那几个基因就可以了。
如果经济条件挺好，想要全面检测癌症相关的基因，可以做全基因检测。
说完基因检测，就不得不说说靶向治疗了！靶向治疗是指通过检测肿瘤中是否存在导致肿瘤生长的基因突变或基因谱变化，以此确定针对特异性驱动基因突变的治疗方法。
肿瘤的基因突变类型很多，不同基因突变类型使用不同的靶向药物，只有明确了基因突变类型，正确选择靶向药物治疗，才能使患者获益。
基因检测技术在肺癌精准治疗中的应用 靶向捕获测序与ddPCR比较PPT幻灯片
EGFR L858
通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内 部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异 质性有帮助。
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NGS和ddPCR都可分辨分子顺式/分子反式
与EGFR不同ALK-TKI的耐药机制更加复杂
• NGS检测EGFR和ALK的 耐药位点都没有问题。
• ddPCR只能做T790M这 种比较集中出现的耐药位 点检测。
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随着建库技术和生物信息分析策略的进步NGS液体 活检敏感性已经远超ddPCR
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NGS检测能够帮助分析肿瘤克隆的进化
评论：相比反复活检 在临床面临的巨大挑 战，ctDNA动态随访 是对肿瘤克隆进化监 控的最佳方式
• 1987年，KRAS基因突变在当时50%的肺腺癌患者中被发现。 • 2004年，EGFR突变作为新的肺腺癌驱动基因被发现。 • 2014年，随着TCGA计划的完成，肺腺癌的基因突变图谱被进一步完善。
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NGS在肿瘤临床领域的应用
组织
遗传易感性 伴随诊断用药指导
良恶性判断 复发与疾病进展监控
早期筛查
ddPCR血液 已知
难（已知） 已知 已知 好 已知
难（已知） 已知
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NGS能够覆盖传统方法和ddPCR无法检测的突变种类
• MET 14 exon skipping，HER2 20 exon insertion等情况复杂的突变 • EGFR等热点基因的非热点突变位点 • ALK等热点基因的非常见融合方式 • 罕见的EGFR-19Del 可能会造成PCR方法假阴性
肺癌靶向治疗的基因检测PPT课件
23%
22% 10% 3%-21% 8%-20% 6% 5%
非常罕见
1% 2% 3%-21% 8%-20% 21% 非常罕见
肺鳞癌与腺癌基因异常发生对比
基因异常 基因定位 鳞癌 腺癌
DDR2突变 Her2过表达 PI3KCA突变 BRAF突变 EGFR突变 AKT1突变 MET突变 Her2突变 EML4-ALK突变
1q23.3 17q11.2-q12, 17q21 3q26.3 7p34 7p12 14q32.32 7q31.1 17q11.2-q12, 17q21 2p21， 2p23
4% 3%-5% 3% 2% <5% 1% 1% 1% 1%
1% 5%-9% 3% 1-3% 10%-15% 非常罕见 2% 2% 2-7%
NSCLC单一突变驱动基因的发生率
肺鳞癌与腺癌基因异常发生率对比
基因异常 基因定位 鳞癌 腺癌
P53 PI3KCA扩增
17p13.1 3q26.3
51% 33%
36% 6%
SOX2扩增
FGFR1扩增 PTEN突变 MET扩增 PTEN缺失 KRAS突变 EGFR v Ⅲ突变
3q26.3- q27
可见SOX2扩增
Cancer Discovery.2011
小细胞肺癌的靶向治疗
信号转导抑制剂 血管生成 Bcl-2反义核苷酸
间变性淋巴瘤激酶 基因融合 最常见的ALK基因重拍的融合为棘皮动物微管 相关蛋白4 EML4-ALK 3～7% 的非小细胞肺癌患者有EML4-ALK 的 基因融合 主要见于腺癌 (与EGFR突变相互排斥)
ALK检测方法
癌症基因检测与靶向治疗进展
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------癌症基因检测与靶向治疗进展癌症基因检测与靶向治疗进展 10 年来，有超过 60 项抗肿瘤药物获得了 FDA 的批准，科学家已经开发出一系列新型分子靶向药物，它们的问世改变了成千上万例难以治疗的癌症病患的现状。
通过癌症基因检测，寻找癌症患者基因改变，并寻找有效药物已经成为治疗常规。
最近的十年间，大约有 40 种新型靶向药物得到批准，其中许多都改变了传统的治疗模式，极大地改善了许多癌症患者的预后。
抗血管生成抑制剂，这是一类旨在减少肿瘤新血管生成的药物，已成为许多晚期和侵袭性癌症的成功疗法。
FDA 批准的此类首款药物是贝伐单抗，它在 2004 年被批准用于晚期结直肠癌，此后被用于某些肺癌、肾癌、卵巢癌和脑肿瘤。
随后，其他血管生成抑制剂药物如阿西替尼、卡博替尼、帕唑帕尼、瑞格非尼、索拉非尼、舒尼替尼、凡德他尼及阿柏西普相继被批准用于晚期肾癌、胰腺癌、结直肠癌、甲状腺癌及胃肠间质瘤和肉瘤的治疗。
另一类主要的靶向药物旨在破坏细胞关键的信号通路，尤其是控制癌细胞生长的信号网络。
其中一个通路被 EGFR 蛋白所控制。
首款 EGFR 药物是吉非替尼，两年后，FDA 批准了第二款EGFR 药物西妥昔单抗用于治疗晚期结直肠癌。
1 / 3在 2019 年，美国 FDA 批准了阿法替尼用于携带 EGFR 基因特异突变的晚期 NSCLC 患者的治疗。
其他 EGFR 靶向药物正在进行临床试验研究。
首款HER2药物曲妥珠单抗与化疗联合使用时可极大改善晚期HER2阳性乳腺癌女性患者的生存，曲妥珠单抗-emtansine (T-DM1)（曲妥珠单抗与一种化疗药物相偶联）也得到批准。
这种联合治疗方案不仅比单一药物治疗更有效。
基因靶向治疗和免疫治疗的结合疗效评估
基因靶向治疗和免疫治疗的结合疗效评估随着人类基因组计划的完成，基因治疗成为治疗疾病的一个新的领域。
在基因治疗中，基因靶向治疗和免疫治疗被认为是最有效的治疗方法之一。
然而，这两种治疗方法的结合是否可以提高治疗的疗效仍然是一个未被完全解决的问题。
基因靶向治疗基因靶向治疗是一种利用基因工程技术研究和治疗疾病，通过对患者基因组研究，指导个体化的精确治疗。
该方法主要针对疾病的原因，通过对目标基因的干扰或修复来治疗疾病。
例如，在癌症治疗中，基因靶向治疗使用的主要是靶向蛋白激酶抑制剂，这些药物可以通过靶向突变的蛋白激酶来抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
然而，基因靶向治疗仍然面临一些限制，例如在某些类型的癌症中，基因靶向治疗所针对的靶点可能不存在，或者靶点变异太多，导致治疗效果不佳。
免疫治疗免疫治疗是一种利用患者自身免疫系统来对抗癌症的治疗方法。
该方法主要通过增强患者的免疫反应，使其免疫系统可以识别和攻击肿瘤细胞。
当前，免疫治疗主要分为两种类型：一种是通过基因工程制造的免疫药物，例如T细胞抗原受体（CAR）T细胞疗法；另一种是通过改变肿瘤微环境来增强免疫反应，例如PD-1肿瘤免疫检查点抑制剂。
与传统的化疗和放疗相比，免疫治疗具有更少的副作用和更长的持久性的反应，但其疗效仍然存在一些限制。
例如，某些患者对免疫治疗不敏感，或者癌症细胞可以通过改变免疫逃逸机制来逃避免疫攻击。
基因靶向治疗和免疫治疗的结合基因靶向治疗和免疫治疗各自具有优点和限制，因而它们经常被用于治疗不同类型的癌症。
然而，这两种治疗方法的结合仍然是一个有待研究的领域。
一些研究表明，通过结合基因靶向治疗和免疫治疗，可以增强肿瘤细胞的敏感性和免疫响应，并且提高治疗的疗效。
例如，靶向PI3K和mTOR的抑制剂可减少癌细胞内的免疫逃逸机制，从而增强免疫治疗的疗效。
此外，靶向HER2的治疗药物和抗PD-1剂的结合治疗已被证明对治疗HER2阳性的转移性乳腺癌患者具有良好的疗效。
分子生物学技术在肺癌早期诊断中的应用
分子生物学技术在肺癌早期诊断中的应用肺癌是一种常见的癌症，占据全球恶性肿瘤患病率的四分之一左右。
肺癌的五年生存率一般较低，因此早期的诊断非常重要。
分子生物学技术的发展为肺癌早期诊断带来了新的希望。
本文将介绍分子生物学技术在肺癌早期诊断中的应用。
1. DNA甲基化检测技术DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制。
在肺癌的发生和发展过程中，许多癌基因以及肿瘤抑制基因的表达会发生异常的DNA甲基化。
因此，可以通过针对一些特定基因的DNA甲基化检测来进行肺癌早期诊断。
例如，肺癌细胞中经常出现一个叫做P16INK4a的肿瘤抑制基因的失活，其原因可能是基因区域的DNA甲基化增加。
临床上可以通过对患者的痰液、血液或尿液进行分子生物学测试，检测P16INK4a的DNA甲基化水平，从而判断是否存在肺癌细胞。
2. 转录组学分析技术转录组是指所有基因表达的RNA分子总和，可以反映细胞在不同生理状态下的转录活性。
在肺癌患者中，不同的基因会表达出不同的转录本，这些转录本的表达水平也会发生变化。
因此，通过对肺癌组织中的转录组数据进行分析，可以发现与肺癌相关的特定的基因和信号通路。
例如，一些肺癌患者的肿瘤细胞中可能存在EGFR（表皮生长因子受体）基因的突变，在转录组数据中这种突变会导致EGFR mRNA水平的增加。
临床上可以进行肺活组织检查，对不同患者的EGFR mRNA水平进行测定，并根据肺癌特定的转录组特征进行分析，进行肺癌诊断。
3. 微小RNA检测技术微小RNA (miRNA)是一类长度约为20–24个核苷酸的非编码RNA分子，可以参与调控基因表达。
miRNA在肺癌早期诊断中被广泛应用。
在肺癌患者中，存在一些特定的miRNA可以作为诊断标志物，且不同肺癌类型具有不同的miRNA表达谱。
例如，已经证实在不同种类的肺癌中miR-21的表达显著增加。
临床上可以通过对患者的痰液、血液或尿液进行分子生物学测试，检测miR-21水平，从而进行肺癌的早期诊断。
直接测序法与荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变对比分析
直接测序法与荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变对比分析闵生萍【摘要】目的：比较直接测序和荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌（ NSCLC）EGFR基因突变状态结果的差异。
方法：分别采用荧光定量PCR（蝎形探针扩增阻滞突变系统ARMS）和直接测序法检测155例石蜡包埋NSCLC样本中EGFR基因18，19，20，21号外显子突变状态，比较检测结果的差异。
结果：80例手术切除样本中，直接测序检测EGFR突变阳性者25例（31．25％）， ARMS法为28例（35％），差异无统计学意义（P＞0．05）；75例活检样本中，直接测序检测EGFR突变阳性者19例（25．33％）， ARMS法为26例（34．67％），差异具有统计学意义（P＜0．05）。
结论：对于手术切除样本，直接测序和ARMS法均可有效检测出EGFR基因突变状态；但对于活检组织样本，ARMS较直接测序灵敏性更高。
%Objective:To compare the differences between fluorescence quantitative PCR and direct sequencing of detecting EGFR mutations in non-small cell lung cancer.Methods:Both direct sequencing and fluorescence quantitative PCR ( amplification refractory mutation system, ARMS) were used to detect EGFR mutations in exon 18, 19, 20, and 21 in 155 formalin-fixed and parrffin-embeded ( FFPE) NSCLC specimens,and the differences between the two methods were analyzed.Results:In 80 surgical excision samples, EG-FR mutations were identified in 25 cases with a mutation rate of 31.5%by direct sequencing, and in 28 cases with a mutation rate of 35%by ARMS, showing no statistical differences in the two detections(P>0.05).In 75 biopsy specimens,EGFR mutations were i-dentified in 19 cases with a mutation rate of 25.33% by direct sequencing, while in 26 cases with a mutation rate of 34.67% by ARMS.There were significant differences of EGFR mutation rate betweenthe two methods(P<0.05).Conclusion:Both direct se-quencing and ARMS can effectively identify EGFR mutation in surgical excision samples, but in biopsy specimens, ARMS gains a higher sensitivity than direct sequencingin detection of EGFR mutation.【期刊名称】《淮海医药》【年(卷),期】2016(034)006【总页数】3页(P633-635)【关键词】癌,非小细胞肺;表皮生长因子受体;基因突变;直接测序;荧光光定量PCR 【作者】闵生萍【作者单位】蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科，安徽蚌埠 233040【正文语种】中文【中图分类】R734.2随着癌症基因组学计划的实施和药物基因组学的发展,人们对癌症发病机制的认识逐步上升到了分子水平。
肺癌基因检测与靶向用药介绍
ALK抑制剂药物及其靶点
ALK抑制剂药物 靶点（适应症）
耐药位点
备注
Crizotinib （克唑替尼）
ALK融合，L1198F
L1196M, G1269A/S, C1156Y/T, G1202R, L1152P/R, 1151 Tins, F1174C/L/V, S1206C/Y, I1171T/N, V1180L, F1245C, G1123S
ALK
crizotinib（克唑替尼）
EML4-ALK融合
ROS1 KRAS
crizotinib（克唑替尼） EGFR TKI 耐药
CD74-ROS1等融合 12、13密码子突变
MET
crizotinib（克唑替尼）
扩增，Exon14跳跃突变
BRAF
HER2 （ERBB2）
vemurafenib（维罗非尼） dabrafenib（达拉菲尼）
进展后二线治疗
Osimertinib ( 奥希替 尼)
T790M
L1196M/G1269A/F1174 Alectinib（阿雷替尼） L等 Ceritinib（色瑞替尼） L1196M/I1171T/C1156
Y等
蓝色药物：CFDA批准上市靶向药物
肺癌靶向治疗思路
EGFR药敏位点与靶向药物 易瑞沙 19 del 特罗凯/凯美纳 L858R 阿法替尼 18突变阿法替尼
10.PIK3CA点突变
研究表明PIK3CA点突变（E545KE、H104R等）可 能与EGFR-TKIs耐药相关。
肺癌基因检测方案
靶基因
EGFR
erlotinib（厄罗替尼） gefitinib（吉非替尼） afatinib（阿法替尼）
靶向治疗，让肺癌变成慢性病
50靶向治疗，让肺癌变成慢性病⊙南部县人民医院 李 涛目前，已经上市的靶向药主要是针对EGFR、ALK、ROS1、MET、HER2等突变基因的，其他如BRAF、KRAS或者TP53等基因，还没有研发出有效的靶向药。
看到这有人会问，是不是没有检测到突变基因，反而是件“坏事”？因为不能使用靶向治疗，肺癌就无法治疗了？其实这么说过于绝对了，除了靶向治疗，目前治疗癌症的方法还有很多，比如手术、化疗、免疫治疗，而且靶向治疗并不能代替早期肺癌的手术治疗。
归根结底，无论何种类型的肺癌，还是早发现早治疗效果才理想，也能节省治疗费用。
靶向治疗也存在耐药问题需要注意的是，目前不管是一代、二代还是三代靶向药，都存在耐药问题，这主要和肿瘤细胞驱动基因发生发展的复杂性有关。
一个肺癌瘤体中，并非清一色的同一种基因突变类型，有时检测出来有对应靶向药的基因类型只占瘤体中所有肿瘤细胞的一小部分，当这一小部分肿瘤细胞被靶向药消灭后，肿瘤瘤体就会重新开始长大，此时就会出现耐药。
所以，接受靶向治疗期间，要每2个月做1次CT 检查，以观察肿瘤变化。
如果发现病情进展，需要再次做基因检测，以调整治疗方。
总之，在晚期肺癌治疗方面，虽然近年来出现许多让人兴奋的治疗方法，患者生存时间也在逐渐延长，但仍然没有达到尽善尽美的程度，还需要更多的努力才能达到人们期望的疗效。
近日，世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，肺癌全球发病率位居第二位，全球死亡率第一。
由于早期症状不明显，我国65%的肺癌患者就诊时已经是中晚期。
在没有手术机会的情况下，靶向治疗的应用可让部分肺癌患者看到长期生存的希望。
驱动基因成为治疗的靶点癌症从本质上来说是一种基因病，几乎所有癌症均来自于基因突变。
基因作为生物细胞里遗传信息的基本单位，是一个含有遗传信息的D N A 片段，而基因的代代相传需要靠DNA复制来实现。
但DNA在复制过程中很容易发生基因突变问题。
基因检测技术的创新和应用场景
基因检测技术的创新和应用场景近年来，随着人们对基因的认知逐渐加深，基因检测作为一项重要的技术逐渐被人们所熟知。
基因检测技术可以通过分析个体DNA序列，了解个体的遗传信息，从而为医学、生物科学研究以及个人健康管理等领域提供帮助。
本文将从创新和应用两方面讨论基因检测技术的发展。
一、创新1.高通量测序技术的出现高通量测序技术是一项革命性的基因检测技术，通过同时对数百万个DNA分子进行测序，可以大大提高数据的获取速度和准确度，有效降低基因检测成本。
如今，高通量测序技术已广泛应用于医学、基因组学研究和生物科学领域。
2.CRISPR基因编辑技术的崛起CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，可以用于修改单个或多个基因。
这项技术的出现，让基因编辑变得更快、更准确、更便宜。
CRISPR技术可以用于研究遗传疾病、克隆动物和植物、制药等领域，具有非常广阔的应用前景。
二、应用场景1.医学领域基因检测技术可以用于预防一些遗传性疾病，如乳腺癌、肺癌等。
通过基因检测，可以确定个人是否患有这些疾病的风险，有助于采取针对性的预防和治疗措施。
此外，基因检测还可以用于肿瘤的分子分型和靶向治疗，提高了治疗的精准性和有效性。
2.个人健康管理领域基因检测可以了解个体患病风险，定制针对性的健康管理计划，提高个体健康水平。
例如，通过基因检测，可以了解个体是否存在遗传性高血压等疾病的风险，制定个性化的健康管理计划，有效预防慢性病的发生和发展。
3.生物科学研究领域基因检测技术可以应用于生物科学研究领域，如基因组学、遗传病学等领域，可以帮助深入了解人类遗传基因信息，探索更多未知的科学问题。
总之，基因检测技术的创新和应用，带来了医学、生物科学研究和个人健康管理等领域的巨大转变。
随着技术的不断发展，相信基因检测技术将会在更多领域发挥其重要作用。
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EGFR L858
通过等位基因突变频率在结合样本病理评估中的肿瘤细胞占比，我们能够对肿瘤内 部带有不同驱动基因的肿瘤细胞亚克隆有一个大致的比例上的了解。对了解肿瘤异 质性有帮助。
NGS和ddPCR都可分辨分子顺式/分子反式
约3/4 ALK融合为经典的EML4-ALK融合， 但有1/4为与其他基因的融合，包括：
• STRN-ALK • CATSPERB-ALK • ACVR1-ALK • CLIP1-ALK • DPH6-AS1-ALK • KIF5B-ALK • RP11-320M2.1-ALK • UGP2-ALK
• 1987年，KRAS基因突变在当时50%的肺腺癌患者中被发现。 • 2004年，EGFR突变作为新的肺腺癌驱动基因被发现。 • 2014年，随着TCGA计划的完成，肺腺癌的基因突变图谱被进一步完善。
NGS在肿瘤临床领域的应用
组织
遗传易感性 伴随诊断用药指导
良恶性判断 复发与疾病进展监控
早期筛查
ddPCR血液 已知
难（已知） 已知 已知 好 已知
难（已知） 已知
NGS能够覆盖传统方法和ddPCR无法检测的突变种类
• MET 14 exon skipping，HER2 20 exon insertion等情况复杂的突变 • EGFR等热点基因的非热点突变位点 • ALK等热点基因的非常见融合方式 • 罕见的EGFR-19Del 可能会造成PCR方法假阴性
NGS与ddPCR在肺癌8基因检测对比
NGS组织
NGS血液
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
可以
难
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
检测已知+未知 检测已知+未知
ddPCR组织 已知 已知 已知 已知 很好 已知 已知 已知
NGS能够发现新的耐药机制
发现AZD9291获得性耐药机制---C797S突变
15例患者一代TKI进展， T790M+，应用
AZD9291后耐药，经检 测发现三种类型：
6例出现C797S 5例仍保持T790M，无 C797S T790M消失
Thress KS et al, Nat Med.2015 Jun;21
有研究发现T790M和C797S突变分子顺式/分子反式信息影响EGFR TKI治疗疗效； NGS和ddPCR都能够提供EGFR突变的in cis/in tran信息，具有重要的临床意义， 传统PCR检测则会遗漏这一信息；
K.S. Thress, et al. Nat Med, 2015. 21(6): p. 560-562.
与EGFR不同ALK-TKI的耐药机制更加复杂
• NGS检测EGFR和ALK的 耐药位点都没有问题。
• ddPCR只能做T790M这 种比较集中出现的耐药位 点检测。
随着建库技术和生物信息分析策略的进步NGS液体 活检敏感性已经远超ddPCR
NGS检测能够帮助分析肿瘤克隆的进化
评论：相比反复活检 在临床面临的巨大挑 战，ctDNA动态随访 是对肿瘤克隆进化监 控的最佳方式
血液
NGS在肺癌临床领域的应用
非小细胞肺癌
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ遗传易感性
伴随诊断用药指导 良恶性或分子分型
NG + ddPC
S
R
复发与疾病进展监控 早期筛查
NG + ddPC
S
R
NG S
肿瘤的异质性对传统分子组织诊断提出了挑战
NGS和ddPCR都能够报告等位基因突变频率， 反映不同亚克隆的比例关系
NGS和ddPCR都是通过计算，看检测出多少带有突变的DNA（突变型），和 检测到的所有的DNA（野生型+突变型）的比值来确定等位基因突变频率 （AF）。
测序技术的发展带来靶向治疗的纵深研究
Li TH, et al. J Clin Oncol 31:1039-1049
PCR技术也经历了3代的进化
对NSCLC驱动基因的认知随着分子检测技术 的进步在不断深入
Ashley J. Vargas et al，Nature Reviews Cancer 16, 525–537 (2016)
N. Rizvi et al, Science, vol 348, 2015
基于NGS的血液DNA甲基化检测能够满足肺癌 早诊的需求
Delpu et al. Int. J. Mol. Sci. (2013) PNAS
感谢聆听
基于靶向捕获的NGS能够同时检测已知突变 和未知突变
ddPCR
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Capture NGS
检测基因
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NCCN指南建议初诊患者进行多靶点平行检测
针对非小细胞肺癌的8个基因NGS可以完全覆盖
检测基因型 EGFR突变 ALK融合 HER2突变 BRAF突变 MET扩增 MET14外显子跳读 ROS1融合 KRAS突变
在肿瘤克隆进化的过程 中，劳拉替尼耐药相关 亚克隆L1198F重拾对克 唑替尼的敏感性
Shaw AT et al, N Engl J Med. 2016;374(1):54-61. Bordi P et al, N Engl J Med. 2016;374(18):1790.
全外显子测序结果有助于评估接受免疫治疗的患者预后