第十八章高效液相色谱法
高效液相色谱法
高效液相色谱法1 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。
注人的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
色谱柱内径一般为3.9～4.6μm，填充剂粒径为3～10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。
1.1.1色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
中国药典版高效液相色谱法课件
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3.甲醇和乙睛的截止波长是多少， 应用 意义是什么
甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右，在流动相中，增大甲醇和 乙睛的比例，即增加有机相的比例，能 使出峰面积加快，但同时减少分离度。
中国药典版高效液相色谱法
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二原理
高效液相色谱法是用高压输液泵将 具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装 有固定相的色谱柱，经进样阀注入供 试品，由流动相带入柱内，在柱内各 成分被分离后，依次进入检测器，色 谱信号由记录仪或积分仪记录。
中国药典版高效液相色谱法
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三 1.对仪器的一般要求
中国药典版高效液相色谱法
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（3）加校正因子的主成份自身对照法 （4）不加校正因子的主成份自身对照法
中国药典版高效液相色谱法
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（5）面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大， 因此本法 只能通常用于粗略考察供試 品中的杂质含量，除另有规定外，一 般不宜用于微量杂质的检查，方法是 测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂 外的总色谱 峰面积，计算各峰面积及 其之和占总峰面积的百分率。
（11）紧固件或连接件泄漏-------------（11） 拧紧或更换紧固件
（12）进样装置部分堵塞----------------（12） 检修进样器并清洗
中国药典版高效液相色谱法
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现象5：峰重现性差
判断————————————--------------排除方法
（1）注射器针头太长，样品液部分漏掉 ------（1）选用合适的针头
高效液相色谱法
一概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用 极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的 理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率 高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方 面进行比较：
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
高效液相色谱法 定义
高效液相色谱法定义
高效液相色谱法是一种分离和分析混合物的方法。
它基于混合物在流动相和固定相之间的分配差异来实现分离。
高效液相色谱法使用高压输液系统将流动相泵入色谱柱中，待分析的混合物通过进样器注入流动相中，然后在色谱柱中进行分离。
色谱柱通常填充有特殊的固体吸附剂或化学键合相，混合物中的成分在流动相和固定相之间分配，根据其分配系数的差异而分离。
分离后的成分依次通过检测器进行检测，常见的检测器包括紫外-可见检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
检测到的信号被记录下来，通过对信号的分析和比较，可以确定混合物中各成分的含量和性质。
高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、适用范围广等优点，广泛应用于药物分析、环境监测、食品分析、生物化学等领域。
高效液相色谱法()ppt文档
（二）高压输液泵
对输液泵的基本要求： ①流量准确可调。 流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常 要求小于±0.5%。
②耐高压。 通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。 ③液流稳定。 输出的液流应无脉动
④泵的死体积小。 泵的死体积通常要求小于0.5mL。
⑤密封性能好，耐腐蚀
第2节 基本理论
高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同， 速率理论略有差异。 一、柱内展宽
H A B /u (C m C sm C s)u
1.涡流扩散项 涡流扩散项与气相色谱法相同， A＝2λdp
高效液相色谱多使用3～10um球形固定相颗粒 , 以均浆高压装填，A较小。
2.分子扩散项
二、进样系统
进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压
的六通阀进样装置，结构如图所示：
三、分离系统 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管
与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、 铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用 得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～ 5mm，
高效液相色谱法()
第1节 高效液相色谱仪
一、输液系统
（一）溶剂脱气与过滤 HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在 系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检 测器的正常响应。
①抽真空脱气 ②超声波振荡脱气 ③吹氦脱气
溶剂应经过0.45μm滤膜过滤，以除去溶剂中的固 体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵
使用色谱柱注意事项： 1 溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 2 加前置柱。 3 用完后要清洗
四、检测系统
要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、 重复性好、适用范围广等。
《高效液相色谱分析》课件
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱法
➢化学键合相色谱法
其他色谱类型
➢亲合色谱法（affinity chromatography； AC）
➢手性色谱法（chiral chromatography； CC）
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操 作严格，这是它的主要缺点。
第一节 高效液相色谱仪
➢组成
➢输液系统 ➢进样系统 ➢色谱柱系统 ➢检测系统 ➢数据记录处理系统
此外还配有辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。
其工作过程如下：首先高压泵将贮 液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱 柱，然后从控制器的出口流出。当注入 欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离， 然后依先后顺序进入检测器，记录仪将 检测器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。
➢ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速 度快；
➢ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外 检测器最小检测限可达109g，而荧光检测 器最小检测限可达1012g。
高效液相色谱法与气相色谱法相比
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20 ％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、 热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采 用高效液相色谱法进行分离和分析。
➢特殊用途的键合相
（二）、键合相的性质和特点
➢(1)键合反应
➢硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅 胶进行硅烷化反应
R1 Si OH + Cl Si C18H37
R2
第十八章高效液相色谱法
第十八章 高效液相色谱法15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为Zirchrom C8柱（20cm ×4.6mm ，5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28：18：54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为10.3～144.2ug/ml 的对照品溶液。
进样，测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=1.168×105c-1.574×103，r=0.9998.精密称取黄芩颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取1ml 于10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。
平行测定供试品溶液和对照品溶液（61.8ug/ml ），得峰面积分别为4250701，5997670. 解：标样标样A A c =c 599767042507018.6110/=样c %4.17%1001255.01050%6=⨯⨯=-样c w 16．校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量：ODS 色谱柱；甲醇-水（60：40）流动相；检测器UV280nm ；对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物）、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成10ml 溶液，进样10ul ，记录色谱图。
重复三次。
测得含0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照品溶液平均峰面积列于表18-6。
（2）试样测定：取本品20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。
研细后称取732.8mg （约相当于炔诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物0.0733mg/ml ）。
测得峰面积列于表18-6。
表18-6 复方炔诺酮片中各成分及内标物平均峰面积（u v ·s ）解：02.3)10587.6/(100733.0)10043.1/(10035.0A /m A /m f 55s s =⨯⨯⨯⨯==醇醇醇 试样含炔雌醇的量：)mg (449.010841.610387.1100733.002.3A A m f m 55s s =⨯⨯⨯⨯⨯=⋅⋅=醇醇醇 每片含炔雌醇的量：)/mg 0369.0(3.608.732449.0片=⨯ 17．测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品各0.2000g 配成混合溶液。
第十八章 高效液相色谱法 - 章节小结
一、主要内容1．基本概念（1）化学键合相：利用化学反应将有机基团键合在载体表面形成的固定相。
（2）化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法。
（3）正（反）相色谱法：流动相极性小（大）于固定相极性的液相色谱法。
（4）抑制型（双柱）离子色谱法：用抑制柱消除流动相的高电导本底，以电导为检测器的离子交换色谱法。
（5）手性色谱法：利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法。
（6）亲合色谱法：利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离和分析特殊物质的色谱方法，是基于组分与固定在载体上的配基之间的专一性亲和作用而实现分离的色谱法。
（7）梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。
（8）静态流动相传质阻抗Csm：由于组分的部分分子进入滞留在固定相微孔内的静态流动相中，因而相对晚回到流路中，引起的峰展宽。
（9）键合相的含碳量：键合相碳的百分数，可通过对键合硅胶进行元素分析测定。
（10）键合相的覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。
（11）封尾：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等对键合相进行钝化处理，减少残余硅醇基，即封尾。
（12）溶剂的极性参数P'：表示溶剂与三种极性物质乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子受体P'）和硝基甲烷（强偶极体）相互作用的强度。
用于度量分配色谱的溶剂强度。
P'越大，溶剂的极性越强，在正相分配色谱中的洗脱能力越强。
（13）溶剂的强度因子S：常为反相键合相色谱的溶剂洗脱能力的度量。
（14）三维光谱－色谱图：用DAD检测器检测，经过计算机处理，将每个组分的吸收光谱和试样的色谱图结合在一张三维坐标图上，即获得三维光谱-色谱图。
2．基本理论（1）速率理论在HPLC中表达式为：H=A+C m u+C s m u 用于指导实验条件的选择。
A、Cm和Csm均随固定相粒度dp变小而变小，因此保证HPLC高柱效的主要措施是使用小粒度的固定相。
高效液相色谱法PPT课件
13
开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
14
15
正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
23
进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
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仪器：手动进样器-六通阀/定量环
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手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
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手动进样器
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仪器：检测器
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仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
第十八章 高效液相色谱法
5 10 72.1
( P2' 8.7 ) / 2
P2' 8.7 1.16 2
6.38 5.1 (1 ) 10.2
= 0.75
即调整溶剂比例为 75%甲醇和25%水可使该组分的 k 值为5。
四、正相键合相色谱法
固定相：极性键合相
如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
）。
A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响
2．用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为 流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好 的办法是（ ）。 A 增加流动相中甲醇的比例 C 流动相中加人少量HAc B 增加流动相中的水的比例 D 流动相中加人少量的氨水
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶
流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等
应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
2. 保留机制：疏溶剂理论
溶质的保留主要是溶质分子与
极性溶剂分子间的排斥力，促
P
' mix
i Pi
i 1
n
'
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。 二元混合溶剂的则为
P P B P
' AB ' A A
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。 I 组的 xe值较大， 属质子受体溶剂； VII 组的 xd 值较大，属质子给于体溶剂； V 组
仪器分析课件第十八章色谱法导论
9
伸舌峰： 当As小于1时，色谱峰是前半部分信号增加慢，
后半部分信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给 溶质提供足够数量合适的作用位置，使一部分溶质超过 了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。
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色谱流出曲线的意义
色谱峰数=样品中单组份的最少个数； 色谱保留值——定性依据； 色谱峰高或面积——定量依据； 色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。
★应用范围广
(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析； (2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物 等方面得到了广泛的应用。 (3)色谱分离是一种有效的提纯物质技术，用于制备分离，得到高纯样品。 (4)色谱—质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。
8
色谱分离原理
色谱分离是基于样品中各组分在两相间平衡分配的差异。
（一）保留值的定义
1、保留时间 t R（retention time）
2、死时间 tM（dead time）
3、调整保留时间 t R（adjusted retention time）
4、保留体积 VR
5、死体积 VM
6、调整保留体积 VR
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1、保留时间 t R 2、死时间 t M
从进样开始到色谱峰最大值出现时所需要的时间，称为保留时间。
18章高效液相色谱法
六、反相离子对色谱法
把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分离 子在流动相中与离子对试剂的反离子（或是称对离子） 生成不带电荷的中性离子对，从而增加溶质与非极性固 定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果， 适用于分离可离子化或离子型的化合物。 1、离子对模型
试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子 生成不荷电的中性离子对，然后在非极性固定相上产生 保留。
第四节 高效液相色谱分析方法
一、定性和定量分析方法
1、定性方法分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法。 2、定量方法常用外标法和内标法进行。 3、主成分自身对照法：
不加校正因子主成分自身对照法： 加校正因子主成分自身对照法： 二、高效液相色谱分离方法的选择 分离模式选择主要依据试样的性质和各种模式的分离 机制。试样的性质包括相对分子量、化学结构、极性和溶 解度等。
（1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长;
（2）均一性和重现性好;
（3）柱效高,分离选择性好;
（4）适于梯度洗脱;
（5）载样量大. 3、使用注意事项： （1）使用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化 硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）；
（2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同 的色谱特性。
（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别 将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用 作正相色谱固定相。 氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好 的分离能力。 氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性 介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分 离带羰基的物质
2、键合相的特点
高效液相色谱法的检测器要求：灵敏度高、噪声 低、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1、紫外检测器简介： 灵敏度较高、噪声低、线性范围宽，对流速 和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。 工作原理：是朗伯比尔定律，即组分的浓度与吸 光度成正比。 2、紫外检测器分类：
高效液相色谱方法及应用课件
未来发展趋势与展望
超高效液相色谱（UPLC）的普及与发展
随着色谱填料制造技术的进步，UPLC将逐渐成为主流技术，进一步提高分离效率和检 测灵敏度。
联用技术的发展
HPLC将与其他分析技术（如质谱、红外光谱等）更紧密地结合，实现多维、多组分的 同时分析，提高分析速度和准确性。
微纳流控芯片的集成与应用
随着微纳加工技术的发展，HPLC将与微纳流控芯片集成，实现样品制备、分离和检测 的一体化，为便携式、即时分析提供可能。
PART 06
高效液相色谱法的挑战与 展望
技术挑战与解决方案
01 02
分离效率的提高
随着样品组分的日益复杂，分离效率的提高成为HPLC技术面临的重要 挑战。解决方案包括开发新型填料、优化色谱柱参数以及采用先进的色 谱分离技术。
检测灵敏度的提高
对于痕量组分的分析，提高检测灵敏度是关键。解决方案包括采用高灵 敏度检测器、优化检测条件以及发展超高效液相色谱技术。
实验操作流程
流动相制备
根据实验要求，制备适量的流动 相，确保其比例、纯度和稳定性 符合要求。
样品处理
对样品进行预处理，如溶解、过 滤、稀释等，以便进行后续的液 相色谱分析。
柱子安装与条件优化
根据实验需求，选择合适的色谱 柱，并进行安装和条件优化，以 提高分离效果和实验效率。
进样与检测
将处理好的样品注入进样器，按 照设定的条件进行分离和检测， 记录数据。
发展历程与趋势
发展历程
HPLC技术自20世纪60年代问世以来， 经历了不断改进和完善的过程，已成 为一种成熟且广泛应用的分析方法。
发展趋势
随着科技的进步，HPLC技术正朝着 高分离度、高灵敏度、自动化和智能 化的方向发展，同时与其他分析技术 的联用也成为了研究热点。
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第十八章高效液相色谱法
15.外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量：色谱柱为
Zirchrom C8柱（20cm X 4.6mn ,
5um ）；流动相为乙腈-甲醇-水（含0.5%三乙胺，磷酸调pH3.0）（28： 18： 54）;以黄芩苷 对照品配成浓度范围为10.3〜144.2ug/ml 的对照品溶液。
进样，测得黄芩苷峰面积，以峰 面积和对照品浓度求得回归方程为：
A=1.168 X 105C -1.574 X 103, r=0.9998.精密称取黄芩
颗粒0.1255g ，置于50ml 量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取
1ml 于
10ml 量瓶中，30%甲醇定容到刻度，摇匀即得供试品溶液。
平行测定供试品溶液和对照品溶 液（61.8ug/ml ），得峰面积分别为 4250701，5997670.
16 .校正因子法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量： ODS 色谱柱；甲醇-水（60:40）流动相；检测器UV280nm
对硝基甲苯为内标物。
（1）校正因子的测定：取对硝基甲苯（内标物） 、炔诺酮和炔雌醇对照品适量，用甲醇制成 10ml 溶液，进
样10ul ，记录色谱图。
重复三次。
测得含 0.0733mg/ml 内标物、0.600mg/ml 炔诺酮和0.035mg/ml 炔雌醇的对照 品溶液平均峰面积列于表
18-6。
（2）试样测定：取本品 20片，精密称定，求出平均片重（60.3mg/片）。
研细后称取732.8mg （约相当于炔 诺酮7.2mg ），用甲醇配制成10ml 供试品溶液（含内标物 0.0733mg/ml ）。
测得峰面积列于表 18-6。
炔诺酮
炔雌醇 内标物 对照品溶液 1.981 X 106 5
1.043 X 10 5
6.587 X 10 供试品溶液
6
2.442 X 10
1.387 X 10
6.841 X 10
m 醇 /A 醇
0.035 10/(1.043 105) 302
m s /A s 0.0733 10/(6.587 105)
试样含炔雌醇的量：
r
A 醇 c cc
" 1.387 105 c 八 c/ \
m 醇 f 醇 m s
3.02 0.0733 10 0.449(mg)
A s
6.841 105
每片含炔雌醇的量： 0 449 ,
0.449 60.3 (0.0369mg/ 片)
732.8
17.测定生物碱试样中黄连碱和小檗碱的含量，称取内标物、黄连碱和小檗碱对照品
解:
c 样 /10 4250701 61.8
5997670
w%
50c 样 10 6
100% 17.4%
0.1255
A 样
各0.2000g配成混合溶液。
测得峰面积分别为 3.60, 3.43 和4.04cm2。
称取0.2400g内标物和试样0.8560g同法配制成溶液后，在相同色谱条件下测得峰面积为 4.16, 3.71 和4.54cm2。
计算试样中黄连碱和小檗碱的含量。
18 .计算在反相色谱中甲醇—乙腈—水（60:10:30 ）的强度因子。
如果改用四氢呋喃—甲醇—水，水的含量不变，为了保持相同的洗脱强度，甲醇的比例是多少？
设改换溶剂后，甲醇的比例为x，则
x = 0.687 = 68.7%
19.用15cm长的ODS柱分离两个组分。
柱
效
n=2.84 x 104m-1;测得t°=1.31min ;组分
的t R1 4.10min; t R2=4.45min。
(1)求k、k?、
可否达1.5?
解:(1)k
1
t R/'t R1 t0 4.10 1.31
t0t0 1.31
⑵由R f
R2L1，则 1.02
R2
0.15
L20.30
a、R值。
（2）若增加柱长至30cm,分离度R
2.13
R 2 = 1.4（达不到1.5）
解：f黄m黄/A黄A s
m s/A s A黄
3.60
3.43
1.05
解：S混S甲甲+ S乙乙+ S水水 3.0 0.60+ 3.2 0.10+ 0 0.30 2.12。