实验五

毒理学实验五

小鼠精子畸形实验

一、实验目的

1、学习观察小鼠精子畸形的实验方法。

2、检测受试物对雄性生殖细胞的遗传毒性。

二、实验原理

小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。

在正常情况下，人与其它哺乳动物的精液中也有少量畸形精子，毒物影响下，数量大大提高。

三、试剂材料

1、健康成年雄性小鼠，体重25 g ~30g

2、器材

剪子、镊子、玻璃小平皿、滴管、载玻片、擦镜纸、染色缸、显微镜

3、试剂

生理盐水、甲醇、2％伊红水溶液、受试物及阳性对照物环磷酰胺

四、实验内容

1、解剖小鼠、摘取附睾、涂片、固定。

2、镜下观察精子形态，记录畸形精子。

3、计算精子畸形率。

4、结果分析与评价。

五、操作步骤

1、染毒：染毒5天，途径（一般经口）

2、处死：35天后颈椎脱臼处死

3、取材：附睾

4、涂片：将附睾所有内容物直接涂片（一滴生理盐水）

5、晾干：

6、固定：甲醇固定5分钟

7、冲洗和干燥

8、镜检：低倍镜----油镜，镜检1000个精子，记录座标。阴性对照组精子畸变率一般为1-3%

精子畸形主要表现：

(1)头部：无钩、香蕉形、胖头、无定形、双头

(2)尾部：卷尾、双尾

六、实验设计

剂量和分组方法:

受试物至少设3个剂量组，同时设阳性和阴性对照组。

最高剂量组应能使部分动物死亡，然后以高剂量组的1/2～1/4递减作为中、低剂量组。

阳性对照组给予环磷酰胺(20mg/kgBW～40mg/kgBW)，腹腔注射，连续5d，每天一次。阴性对照组给予等体积的溶剂。

七、实验结果及分析

1、正常小鼠精子涂片：由于是正常小鼠的精子涂片，因其畸形精子比例较低，没有观察到畸形精子，观察到一些正常精子，但由于没有进行固定染色，所以不是非常清晰。

在观察图片过程中，看到了一些条纹状的结构，阻碍了精子的观察，考虑可能是浓度太浓或者除精子外的其他组织被涂在载玻片上所致。

2、通过小鼠染毒的畸形精子样片，在镜下观察到了正常精子及畸形精子。畸形精子包括香蕉型，以及双头双尾等。（在附件图1中可以见到正常小鼠精子及香蕉型畸形的小鼠精子）

八、注意事项

1、涂片时生理盐水不要多，精子密度太稀不易观察。

2、涂片时需将附睾剪碎将所有内容物（精子）都点到整个片子上，然后再推片。

3、阅片时，注意区分人为剪碎的精子与精子畸形。