第8章 疏水层析

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8.2.1 基本结构
配基与连接
•C8以下的烷基、苯基；
•用于HIC 介质的疏水配基很多,如羟丙基、丙基 、苄基、异丙基、苯基、戊基、辛基。
•配基通过稳定的非离子键(如醚键)与基质结合， 见图P201。
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吸附而彼此结合”），混合组分中不同的蛋白质分子 与介质间的疏水作用强弱不同。
• 改变蛋白质分子的疏水性，从而改变其余介质的结合 能力，混合组分中的各部分按其与介质结合能力的差 异而被先后洗脱下来。
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.1 固定相 疏水配基的种类
疏水配基的种类直接决定着目标分子在层析时的选择 性，是疏水作用介质选择时首先要考虑的问题；
•烷基：与溶质间显示出单纯的疏水作用，其链长决 定疏水性的强弱（随链长的增加而增加），同时影 响着介质的结合容量（随链长的增加而增加）；
水溶液中的水分子就有被迫避让的效应。这种效应的即
疏水作用，其强弱取决于疏水基团的数量（越多），疏
水区域的面积（越大），则疏水作用越强。
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.2 流动相
盐种类
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8.2.2 常见疏水作用介质的种类
烷基链配基
芳基配基
高分子配基
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.3 层析条件 流速
• 针对蛋白质以外的分子与其他层析过程的影响类似；
• 针对蛋白质大分子的疏水层析过程，对流速的敏感度 相对较低。
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其他添加剂
• 主要指能够减弱疏水作用的醇类、促溶盐类、去污剂
等。
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•芳香基：π-π作用的存在而呈现出混合模式的分离
行为。
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
• 这些暴露在外的疏水基团与介质上的疏水性配基发生
疏水性作用，被固定相吸附.
• 高盐下吸附，逐渐降低洗脱液盐浓度时，疏水性不同
的组分被先后洗脱下来。
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第二节 疏水作用层析介质
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极性侧链和疏水性的非极性侧链.水介质中球状蛋白质
的折叠总是倾向于把多肽链的疏水性侧链或疏水性基
团埋藏在分子的内部。这一现象被称之为生物分子的
疏水作用。疏水作用的本质是疏水基团或疏水侧链出
自避开水的需要而被迫相互靠近的缘故。
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8.1.1.2 生物分子（蛋白质）疏水作用
但是，对球状蛋白质分子来说，真正能被包裹在内部的
氨基酸侧链仅占总氨基酸侧链的20%左右，其余80%的
侧链部分或完全暴露在分子表面，其中的疏水残基对于
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8.2.1 基本结构
基质 硅胶
•良好的机械稳定性，适用于HP-HIC；
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8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.2 流动相 流动相Ph
• 行为复杂；
• 多数情况下pH升高会减弱疏水作用，反之则增加；
• 洗脱时可不断提高Ph。
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盐类的存在对蛋白质的疏水作用起道非常重要的作用。 • 高盐时，盐离子夺取疏水分子周围的水分子，疏 水区域受到水分子的挤压力减弱，疏水区域的面 积增大，促进蛋白质疏水区域与介质间的疏水作 用（更有效地与介质上的疏水基团结合）；
疏水作用层析过程 Pr表面的疏水残基；或Pr局部变性，暴露疏水残基 （高盐）；
高盐浓度下Pr疏水表面与固定相结合；
洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出；盐浓度低 ，疏水强的Pr后流出。
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第八章 疏水层析
赵世光 生物化学工程系·生物技术教研室
第一节 基本原理
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8.1.1.2 生物分子（蛋白质）疏水作用
多肽链的侧链（也就是氨基酸的侧链）分为亲水性的
•表面可供衍生的基团少，pH稳定性较差（2~8 ）；
•聚合物包裹克服上述缺点，得以广发应用。
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8.1.1.1 什么是疏水性、疏水作用？
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常小 ，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)，这些非极性的分子在水相环境中具有 避开水而相互聚集的倾向，称为疏水作用。
8.1.2 影响疏水作用层析过程的参数
8.1.2.3 层析条件 温度
•影响复杂：疏水作用随温度的升高而增强；但温度升 高对蛋白质构象和溶解性产生影响；
•执行特定的层析任务时，维持一个恒定的温度。
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盐浓度
•增加疏水作用盐类 •高盐：起始阶段，蛋白质结
•促溶盐类 •常用盐类，Na2SO4、
NaCl和(NH4)2SO4
合量线形增加，达到特定盐 浓度后，指数增加，部分沉 淀，不利于选择性；
•既要大的结合量，又要避免
极高盐浓度导致的沉淀。
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8.1.1.3 生物分子与疏水作用层析介质间的相互作用 • 二者在水溶液中均被水分子挤迫而可以彼此聚集（“
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第三节 疏水作用层析实验技术
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8.2.1 基本结构 作为骨架的基质+参与疏水作用的配基
基质 琼脂糖类凝胶
• 亲水性强，表面羟基密度大，衍生化后可产生取代程 度和结合容量较大的介质；
• 大孔结构可容纳体积很大的分子，适合蛋白质大分子 的分离。
• 降低盐浓度，减弱了蛋白质—介质疏水基团的疏 水作用，发生解吸。
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8.1.1基本概念
疏水层析(hydrophobic interaction chromatography,HIC),是
采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水
溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质的差异而
与固定相间疏水相互作用的强弱不同而实现的层析方
法。
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8.1.2.1 固定相 取代程度的高低决定着介质的结合容量和疏水强度
•取代度较低时，介质对蛋白质的结合容量小；取代 度提高，结合容量大；
•原因：配基的数量增加使得蛋白质在介质表面的结 合位点增多。
•达到表面饱和结合容量后，取代度的进一步上升会 使每个蛋白质发生作用的配基数量增加，结合力太牢 固，难以洗脱。
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8.1.1.3 生物分子与疏水作用层析介质间的相互作用
• 疏水介质：基质（琼脂糖等）上连接上疏水性基团 （ 烷基、芳香基团）。其疏水性质固定不变的（ 基团数量、种类在制备介质时就固定了的）。
• 生物大分子：表面也有疏水性基团。（不同的蛋白 质分子，其疏水性大小不同，见上文）
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• 组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，
如苯丙氨酸，酪氨酸；
• 这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水基团
暴露于蛋白质表面；
• 在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏
，更多的疏水部分暴露在外