4细胞化学染色检验

前者 后两者正常或
(4) 慢粒病情观察：
(5) 再障与阵发性睡眠性血红蛋白尿：
前者
后者
(6) 恶组与反应性组织细胞增多症：
前者
后者常
(7) 急性白血病类型：
AML
急淋
细菌感染NAP染色 细菌感染NAP染色
CML NAP阴性
－
±
＋
＋＋ ＋＋＋
＋＋＋＋
－ ＋＋
＋ ＋＋＋
＋＋＋＋
五、应用评价
neutrophilic alkaline phosphatase （NAP）
一、原 理
Kaplow偶氮偶联法：
α-磷酸萘酚钠 NAP α-萘酚+磷酸钠
PH9.6
α-萘酚+重氮盐
不溶性沉淀定位 于胞质
二、正常血细胞染色反应
NAP主要存在于成熟的中性粒细胞胞 质中。严重的化脓性感染时，晚幼阶 段粒细胞也可见有阳性反应。
单核细胞呈阳性反应，阳性反应物为 细颗粒弥散状、中粗颗粒往往位于胞 浆边缘。
浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒。 组织细胞为阳性或阴性反应。 巨噬细胞可呈细颗粒的阳性反应。
三、临床意义
1. 帮助鉴别红细胞系统疾病
阴性：正常红细胞、AA； 弱阳性：MA、 IDA、 HA； 强阳性：红白血病及各类急性白
胞质边缘颗粒较粗大。
3.其他细胞：
淋巴瘤细胞多呈强阳性 戈谢细胞呈强阳性 尼曼-皮克细胞多呈阴性
戈雪细胞呈强阳性
尼曼-匹克细胞为 阴性或弱阳性，空 泡中心为阴性。
骨髓转移癌细 胞PAS强阳性
组织嗜碱细胞 PAS强阳性
酯酶染色
酯酶属于水解酶，是一组在不同pH 条件下，水解各种脂肪族或芳香族酯类的 酶，根据酯酶存在的细胞类型、催化底物 和pH不同等，分为特异性酯酶和非特异性 酯酶两大类。水解短链脂肪酸酯为非特异 性酯酶，萘酚AS-D氯乙酸盐作底物称为特 异性酯酶。酯酶染色在急性白血病的诊断 和分型方面有重要意义。
形态学分型：进行初步的诊断
免疫学分型：明确细胞种类
细胞遗传学分型：与疾病预后有关
分子生物学分型：提高到分子水平
四、基本步骤
1. 固定 （1）物理法：干燥、火焰 （2）化学法：
A、蒸气固定： B、液体固定：甲醛、乙醇、甲醇。
2. 显示：有色沉淀反应
（1）偶氮偶联法：酯酶染色 （2）联苯胺法：POX （3）普鲁士蓝反应：Fe （4）雪夫反应：PAS （5）金属沉淀法：NAP （6）物理显色法：SBB
NAP染色有多种检测方法，国际标准化委员会推荐 Kaplow萘酚AS-BI磷酸钠法和Tomonaga萘酚AS-MX 磷酸钠法。钙-钴法试剂成本低廉，操作繁琐，反应 时间长，临床上逐步被偶氮偶联法取代，阳性产物色 泽鲜明、定位精确，尤其以萘酚AS-BI磷酸钠法最为 广泛使用，利于评定NAP活性强度的分级。常用重氮 盐有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等，不同偶联 有不同的灵敏度。
1. 粒细胞系统：
原始粒细胞（－）或（+） 除嗜碱性粒细胞以外，早幼粒以下阶段细胞 均为阳性且随着细胞的成熟阳性逐渐增强， 嗜酸粒细胞阳性最强。
2. 单核细胞系统：
（－）或弱（+），阳性颗粒少而细小。
3. 其它系统细胞：
淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核 细胞系统、浆细胞、组织细胞（－）。
六、临床意义
铁粒幼红细胞(sideroblast)： 胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。
铁粒红细胞(siderocyte)： 胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。
环形铁粒幼红细胞(ringed sideroblast) 幼红细胞胞质内铁颗粒≥5个，紧密排 列或围绕核周1/3以上者。
三、参考范围
1. 细胞外铁： （ + ） ~（ ++ ） 2. 细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率大约
二氨基联苯胺法（DAB染色法） 过氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法 二盐酸联苯胺法
三、ICSH规定POX方法选择条件
酶反应基质是否容易获得 是否有致癌倾向危险 反应产物的显示观察是否满意
四、结果判断
在细胞胞质内出现金黄色颗 粒为阳性反应。
复方联苯胺法
二氨基联苯胺法 二盐酸联苯胺法
五、正常血细胞POX染色反应
主要用于鉴别急性白血病的细胞类型
（1）急淋和急性髓系白血病的鉴别： 急淋：（－），阳性率<3%； 急单：弱阳性； 急粒：阳性（ + ～ + + + ）。
急性白血病POX反应强弱的顺序 M3>M2b>M2a>M6(粒)>M4 >M1>M5>HAL>ALL
Auer小体POX 呈阳性
原始/幼稚巨核细胞/浆细胞POX阴性
戈雪氏细胞阴性 尼曼-匹克细胞阴性 组织嗜碱细胞阴性 海蓝细胞阴性或阳性
（2）鉴别诊断： a. 小原粒（+）与原淋（－） b. 急性早幼粒白血病(+++)与急单（+） c. 急单（+）与组织细胞白血病、 恶性组织细胞病（－）
苏丹黑染色 （Sudan black B，SBB）
一、原理
苏丹黑B是一种脂溶性重氮染料， 可溶解细胞内含脂结构(中性脂肪、磷 脂、糖脂和类固醇)，而使脂类物质显 示出来，呈棕黑色或深黑色(粒细胞： 丰富；单核细胞：少量)。
二、必要性
从形态学观察，存在较多的主观性。 有些原始细胞形态较相似，难以鉴别。 结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。
三、临床应用
1. 辅助判断急性白血病的细胞类型 2. 辅助血液系统疾病的诊断和鉴别
诊断 3. 观察疾病的疗效和预后 4. 探讨疾病的发病机制
白血病的诊断：MICM分型
M：morphology I：immunology C：cytogenitics M：molecular biology
其他细胞基本呈阴性反应。
三、结果判断及参考范围
1. 结果判断：出现深褐色颗粒的量及密度
ห้องสมุดไป่ตู้
NAP染色反应强度：
（－）：胞质中无颗粒； （＋）：胞质含少量颗粒，约占1/4； （＋＋）：胞质含中等量颗粒，约占1/2； （＋＋＋）：胞质含较多颗粒，约占3/4； （＋＋＋＋）：胞质充满颗粒，无空隙。
钙钴法
2.淋巴细胞系统
大多数淋巴细胞呈阴性反应，少数胞 质内有少量红色颗粒。
B淋巴细胞PAS正常值为 阳性率：20% 阳性指数：30
3.红细胞系
幼红细胞和成熟红细胞均呈阴性反应。
成熟淋巴细胞PAS细、中粗或粗颗粒。
4.巨核细胞系统和血小板
阴性或阳性，阳性物呈珠状或块状。 成熟巨核细胞阳性指数 正常值：107.4±13.8
和少数铁小块。 (＋＋＋＋)：有极多铁颗粒、小珠和很多
铁小块，密集成堆。
2. 细胞内铁(油镜观察中晚幼红细胞)
阳性率 观察100个中晚幼红细胞，计算
出铁粒幼红细胞的百分比。
细胞内铁(油镜观察幼红细胞)
Ⅰ型：1～2个小铁颗粒。 Ⅱ型： 3～5个小铁颗粒。 Ⅲ型： 6～10个小铁颗粒或1～4个大颗粒。 Ⅳ型： 10个以上小铁颗粒或5个以上大颗粒。
一、分类
1. 特异性酯酶（specific esterase）
第二节 细胞化学染色检验
本节主要内容： 一、铁染色 二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色 三、过氧化物酶染色 四、糖原染色 五、酯酶染色 六、酸性磷酸酶染色
要求：
掌握细胞化学染色的原理及临床应用 熟悉正常血细胞的染色反应 了解细胞化学染色的基本步骤
第一部分 概 述
一、概念
细胞化学染色是细胞学和化学相结合 而形成的一门科学。它以细胞形态学为 基础，结合运用化学反应的原理对血细 胞内的各种化学物质(酶类/脂类/糖类/铁 /蛋白质/核酸等)作定性、定位、半定量 分析的方法。
3. 参考范围：
中性粒细胞NAP阳性率：＜40% NAP积分为： 30~130分
四、临床意义
1.生理性变化：应激状态、妊娠、新生儿等。 2.病理性变化： (1)NAP：细菌感染、慢粒(加速期/急变期)、
急淋/慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、 骨纤、真红、再障、原发性血小 板增多症、使用糖皮质激素等。
(2)NAP：慢粒(慢性期)、PNH、MDS等。 3. 疾病的鉴别： (1) 类白与慢粒: 前者 后者 (2) 慢粒慢性期与慢性中性粒细胞白血病： 前者 后者 (3) 细菌性感染与病毒性感染/寄生虫感染：
糖原是人体一种重要的贮存糖， 它是产生能量的重要物质，在化学上 糖原是D-葡萄糖分子组成的聚合体， 对AL的分型及MDS、AA、脂质代谢 性疾病等的诊断有着重要意义。
一、原理
过碘酸是一种氧化剂，可使含有乙二醇 基的多糖类物质(糖原、糖蛋白、糖脂、粘 多糖等)氧化，形成双醛基。醛基与Schiff ’s 液中的无色品红结合，使无色品红变成紫 红色化合物，定位于含多糖类的细胞内， 其阳性强弱与乙二醇基含量有关。
3. 复染：使各种细胞能显示出来
铁染色----中性红、伊红 PAS-------甲基绿 核：中性红、甲基绿、沙黄等。 浆：伊红、刚果红、光绿等。
第二部分 具体细胞化学染色方法
铁染色(Ferric stain)
一、原 理
骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小 粒(外铁)和幼稚红细胞(内铁)中；在酸性 环境中与亚铁氰化钾作用，形成亚铁氰 化铁沉淀。
二、SBB与POX区别：
1. POX操作简单，背景干净，酶无扩 散，易于辨认，特异性强，但敏感 性低于SBB；
2. SBB比POX出现早且反应强，但染 色步骤较繁琐且染液渣子多。
ALL-POX染色 ALL-SBB染色
过碘酸--雪夫反应(糖原染色)
periodic acid-Schiff reaction(PAS)
二、PAS染色结果
阳性结果为胞质内出现紫红色物质， 细胞核为蓝色。
颗粒状 片状 珠状 块状
阳性物分布为 细颗粒弥散状
阳性物分布为 粗颗粒/珠状/块状
PAS 珠状、块状
三、正常血细胞的染色反应
1. 粒细胞系统：（阳性逐渐增强）
原始粒C（－）或（+） 早幼粒C~成熟中性粒C（+）：
细颗粒均匀红色 嗜酸粒C：颗粒不着色，胞质呈红色。 嗜碱粒C：颗粒阳性，胞质不着色。
4Fe3+ + 3K4[Fe(CN)6] 酸性 Fe4[Fe(CN)6]3 + 12K+
含铁物质 亚铁氰化钾
亚铁氰化铁
二、结果判断
1. 细胞外铁(骨髓小粒－含铁血黄素) 铁颗粒、铁小珠、铁团块
细胞外铁(低倍镜下观察骨髓小粒)
（－）： 无铁颗粒 （＋）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠 (＋＋)：有较多的铁颗粒或铁小珠 (＋＋＋)：有很多的铁颗粒、铁小珠
血病的幼红细胞、MDS及重型 地中海贫血。
有核红细胞PAS反应物酶型
原、早红细胞为大粗颗粒、珠状、块状； 中、晚幼红细胞为细颗粒弥散状分布； 成熟红细胞有时亦可为阳性。
IDA - PAS MDS - PAS
M6 - PAS 染色
2. 帮助鉴别急性白血病的细胞类型： 急淋：（+）呈粗颗粒状或珠状、块状。 急粒：（+）细颗粒状或均匀红色。 急单：（+）颗粒状均匀分布，有时
过氧化物酶染色 (peroxidase，POX)
一、原 理
粒细胞和部分单核细胞的溶酶体 颗粒中含有过氧化物酶(POX)，它可 分解H2O2释放出新生态的氧，后者氧 化二氨基联苯胺，形成棕黄色不溶性 沉淀，定位于胞质内酶活性部位。
二、过氧化酶实验染色方法
1958年 Washburn 复方联苯胺法 1965年 Kaplow 二盐酸联苯胺法 1985年血液学国际标准化委员会(ICSH)
19%~44%， I~II型（ I型为主），无 Ⅲ型、Ⅳ型、环形铁粒幼红细胞及铁粒 红细胞。
四、临床意义
1. 缺铁性贫血： 外铁（－），内铁阳性率<10%； 治疗有效后，内外铁 。
2. 铁粒幼细胞性贫血： 外铁；内铁阳性率，环形铁粒幼 红细胞增多，可见Ⅲ、Ⅳ型铁粒幼 红细胞。
3. MDS-RAS：内外铁增多，环形铁粒幼 红细胞>15%。
4. 非缺铁性贫血：溶贫、巨幼贫、再障、 白血病等，内外铁常增多。
5. 感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等： 外铁增多。
五、应用评价
铁染色是临床常用的一种细胞化学 染色，虽不如血清铁蛋白敏感，但是反 映机体储存铁的金标准。 外铁：反映骨髓中铁的储存量； 内铁：反映骨髓中可利用的铁量。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色
++++
+++
++
++
+
+
－
EOS －
2. NAP染色结果报告：
NAP染色结果报告包括阳性率和积分值。
阳性率：指计数100个中性成熟粒细胞，其 阳性细胞的数量即为阳性率；积分值：指计 数100个中性成熟粒细胞，不同阳性程度细 胞数量乘以其阳性程度之和即为积分值，其 计算公式为：积分值=(＋)数量×1 +(＋＋)数 量×2 +(＋＋＋)数量×3 +(＋＋＋＋)数量 ×4。