荧光定量PCR实验指南一
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1、实验器材多样品研磨珠均质仪台式高速冷冻型微量离心机荧光定量PCR仪超净工作台分光光度计离心管TIP头2、主要实验试剂及耗材RNA提取液三氯甲烷异丙醇无水乙醇引物75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。
二、荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
2）取100mg组织，加入到匀浆器中。
3）充分研磨直至无可见组织块。
4）12000rpm离心10min取上清。
5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
6）4℃下12000rpm离心10min。
7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8）-20℃放置15min。
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11）4℃下12000rpm离心5min。
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃孵育5min。
15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。
2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl 逆转录引物。
3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4）于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
荧光定量PCR应用指南
荧光定量PCR应用指南荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR）是依靠荧光信号的强度来定量PCR产物的一种PCR技术。
该技术通过在PCR反应体系中添加特异性荧光探针，利用荧光信号的强度来反映PCR产物的数量。
荧光定量PCR在生物医学研究、基因表达分析、致病微生物检测等领域有着广泛的应用。
下面将介绍荧光定量PCR的原理、实验步骤和一些注意事项。
一、原理：荧光定量PCR最常用的荧光探针是TaqMan探针，TaqMan探针是由两个DNA引物和一个荧光标记的探针组成。
当PCR反应进行到延伸阶段时，引物和探针结合到靶序列上形成荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的强度可以定量PCR产物的数量。
二、实验步骤：1.设计引物和探针：选择特异性的引物和探针对目标序列进行扩增。
引物和探针的设计需要遵循一些原则，如避免引物和探针之间的自互补性、探针需选择合适的荧光染料等。
2.准备PCR反应体系：根据PCR反应需要，准备PCR反应体系。
一般包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液等。
3.荧光定量PCR反应：将PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，进行PCR反应。
PCR反应的条件需要根据目标序列的特性进行优化，包括温度、延伸时间等。
4.数据分析：通过荧光定量PCR仪记录荧光信号的强度，根据荧光信号的强度可以反应PCR产物的数量。
通过数据分析软件对荧光信号进行定量计算，获得PCR产物的数量。
三、注意事项：1.引物和探针的设计需要严格控制，确保其特异性，避免与非靶序列结合。
2.PCR反应的条件需要进行优化，不同的目标序列可能需要不同的温度、延伸时间等。
3.控制实验中的阳性对照和阴性对照，确保实验结果的可靠性。
4.严格遵守无菌操作，避免PCR反应体系受到外源性污染。
5.选择合适的荧光定量PCR仪进行实验，确保获得准确的荧光信号强度数据。
6.实验过程中需严格按照操作规程进行，避免操作失误对实验结果产生影响。
荧光定量PCR实验指南
荧光定量PCR实验指南荧光定量PCR（qPCR）是一种能够对DNA或RNA的特定序列进行定量分析的技术。
它结合了PCR技术和荧光检测技术，能够检测出非常低浓度的靶分子。
本文将为您提供一份荧光定量PCR实验的指南，以帮助您完成这一实验。
实验前的准备工作：1.设计引物和探针：引物和探针是荧光定量PCR实验的核心组成部分，因此需要确保它们与目标序列特异性结合。
同时，还需选择合适的荧光染料和探针的浓度。
2.准备实验材料：包括引物、探针、荧光染料、模板DNA或RNA、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等。
3.准备质量控制样品：根据需要制备相应的阳性对照样品，并准备阴性对照样品。
实验步骤：1.反应体系的准备：根据PCR试剂盒使用说明或自行优化，将引物、探针、荧光染料、逆转录酶酶、dNTP、聚合酶、缓冲液、MgCl2等加入PCR管（注意按顺序添加，避免污染）。
2.加入模板：将模板DNA或RNA加入PCR管中，注意保持反应体系的稳定。
3.PCR条件设定：根据目标序列的特性和PCR试剂盒的要求设定PCR反应的温度、时间和周期数。
4.PCR反应：将PCR管密封，然后置于热循环仪中进行PCR反应。
5.数据分析：使用荧光定量PCR软件分析PCR反应产生的荧光信号，得到目标序列的定量结果。
注意事项：1.严格控制实验室的污染，使用无核酸污染的试剂和器材，避免引物和探针的降解。
2.对于荧光定量PCR的标准曲线方法，可以使用标准品系列的不同浓度来制作标准曲线，并根据荧光信号的强度进行定量。
3.在实验过程中，建议进行阳性和阴性对照样品的实验，以确保实验结果的准确性。
4.合理选择PCR管的容量，适量调整反应体系的配比，以保证实验的稳定性和可重复性。
总结：荧光定量PCR是一种非常强大的技术，能够在基因表达调控、感染病原体检测、突变检测等多个领域发挥重要作用。
在进行荧光定量PCR实验时，我们需要设计特异性的引物和探针，并合理选择荧光染料和探针的浓度。
荧光定量PCR技术的使用教程
荧光定量PCR技术的使用教程PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩增起始序列的DNA片段。
荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。
本文将详细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。
第一步：准备实验材料与试剂在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：1. DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。
2. 引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。
应选择合适的引物，包括正向引物和反向引物。
3. 标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸，用于检测PCR扩增产物。
4. dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
5. 磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。
6. DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。
7. MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。
8. 蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。
第二步：制备PCR反应体系1. 在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：- 1 μL DNA模板- 1 μL 正向引物- 1 μL 反向引物- 0.5 μL 荧光探针- 10 μL 2× PCR反应缓冲液- 0.5 μL 10 mM dNTPs混合液- 0.2 μL DNA聚合酶- 1 μL 25 mM MgCl2- 35.8 μL 蒸馏水注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用量。
2. 轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。
第三步：进行PCR扩增反应1. 将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。
2. 将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。
- 初始变性：95°C，5分钟- 循环变性：95°C，30秒- 退火温度：根据引物的Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒- 延伸：72°C，持续1分钟- 终止延伸：72°C，10分钟3. 根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。
pcr定量实验方案
PCR定量实验方案实验目的本实验旨在通过聚合酶链式反应（PCR）定量检测目标DNA的数量。
通过PCR 定量实验，可以快速、准确地确定目标DNA的含量，为后续实验提供数据支持。
实验原理PCR定量实验基于聚合酶链式反应的基本原理，通过反复复制目标DNA序列，使其数量呈指数增加，并通过荧光信号在PCR循环的各个阶段实时监测目标DNA的增长情况。
荧光信号的强度与目标DNA的初始量成正比，从而可以定量测量目标DNA的数量。
实验步骤1.样本处理：–收集待检测样本，并提取目标DNA。
–使用核酸定量仪检测目标DNA的浓度，并计算出适当的稀释倍数。
–将目标DNA按照所需的浓度稀释，并制备出一系列不同浓度的DNA标准曲线样品。
2.PCR反应体系准备：–准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、荧光探针、酶和缓冲液等。
–按照所需的PCR反应体系，按比例向反应管中加入相应的试剂，确保反应混合液的配制准确。
3.反应条件设置：–设置PCR反应的温度和时间参数，包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。
–根据目标序列的特性和引物设计，调整PCR反应的温度梯度、循环次数等参数，以实现最佳放大效果。
4.PCR反应实施：–将PCR反应混合液分装到反应管中，注意避免产生交叉污染。
–将反应管放入PCR仪中，按照设定的温度和时间参数运行PCR反应。
–实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，记录关键点的荧光信号值。
5.数据分析：–将PCR反应过程中记录的荧光信号值绘制成实时荧光曲线图。
–根据所制备的DNA标准曲线样品，通过荧光信号值反推目标DNA的初始量。
–根据目标DNA的初始量和稀释倍数，计算样本中目标DNA 的浓度。
实验注意事项1.实验操作前，准备好PCR反应所需的所有试剂和设备，并保持反应管和工作台的清洁。
2.操作过程中，注意避免产生交叉污染，尤其是在样本处理和PCR反应准备阶段。
3.严格按照PCR反应体系准备说明书中的比例和操作要求进行试剂的配制和混合。
荧光定量实验方法操作手册
基因表达差异柱壮图显示，程序可以自动计算出基因表达的差异，并用柱壮图显示出来，每 一个柱表示一个样本，基因表达的趋势清晰可见，对照样本被算为 1。
柱壮图还可以表示成 Log 的形式，这样可以清楚分开上调和下调的样本。
Stratagene 定量 PCR 仪标准曲线制作方法
定量 PCR 定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品 和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检 测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。 标准样品的准备 1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。对于这类实验标准品是通过某种方 法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。最常见的是插入有目标序列的质 粒，因为质粒是环状 DNA 有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。也有 用线状的 PCR 产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片段要大一些，这也是为了获得分 子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确定， 先得到标准品的浓度 C(ng/uL)，因为无论是质粒还是 PCR 产物它们的序列都是已知的，这 样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量 B，则标准品的拷贝数 A(copy/uL) 为：
写看家基因和目的基因名 由于用 SYBR 染料做两种基因，所以应该在 SYBR 后面的 Assay 栏中写入看家基因和目的
基因名称。假设前两排是 GAPDH，后两排是 IL1，则可以在 assign assays within selected wells 中选择 SYBR 并输入 GAPDH 和 IL1 的名称，同时你可以选择一个颜色代表不同的基因。这 样系统就可以分辨哪个孔是什么基因了。
荧光定量PCR手册
荧光定量PCR手册一、什么是荧光定量 PCR荧光定量 PCR（Quantitative Realtime PCR，qPCR）是一种在 DNA 扩增反应中，通过荧光信号的实时监测来定量分析特定核酸序列的技术。
简单来说，它能告诉我们样本中特定基因的数量有多少。
这一技术在生物学、医学、农学等众多领域都发挥着重要作用。
比如，在医学诊断中，能检测病毒或细菌的感染量；在基因研究中，可分析基因的表达水平。
二、荧光定量 PCR 的原理荧光定量 PCR 的原理基于传统的 PCR 技术，但增加了荧光检测的环节。
在 PCR 反应中，DNA 会被不断复制。
我们会在反应体系中加入一种特殊的荧光探针或荧光染料。
这些荧光物质的荧光强度会随着 PCR 反应的进行而发生变化。
当 PCR 反应开始时，荧光信号很弱。
随着反应的进行，DNA 不断扩增，荧光信号逐渐增强。
通过检测荧光信号的强度变化，我们就能实时了解 PCR 反应的进程，并计算出初始样本中目标 DNA 的含量。
三、荧光定量 PCR 的实验流程（一）样本准备首先，需要从待检测的生物样本（如血液、组织、细胞等）中提取出 DNA 或 RNA。
提取的质量和纯度对后续实验结果至关重要。
（二）引物和探针设计设计合适的引物和探针是关键步骤。
引物是一小段能与目标 DNA 序列特异性结合的寡核苷酸，它们决定了 PCR 反应扩增的区域。
探针则用于检测扩增产物，通常带有荧光标记。
（三）PCR 反应体系配置将提取的核酸模板、引物、探针、酶、缓冲液、dNTPs 等试剂按照一定的比例混合，配置成 PCR 反应体系。
（四）PCR 反应将配置好的反应体系放入荧光定量 PCR 仪中，设置好反应程序，进行 PCR 反应。
（五）数据分析PCR 反应结束后，仪器会给出荧光信号的变化曲线。
通过对这些曲线进行分析，可以得出目标基因的初始含量。
四、荧光定量 PCR 的关键要素（一）引物和探针的设计引物和探针的特异性、长度、GC 含量等都会影响 PCR 反应的效率和特异性。
荧光定量PCR实验操作流程
6
45ul
对照
荧光定量PCR
2. 配制PCR预混反应体系：
做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：
试剂 2×UltraSYBR Mixture Forward Primer，10 µ M Reverse Primer，10 µ M 配制的8个孔的预混 体系 80 μl 6.4 μl 20 μl反应体系 10 μl 0.8 μl
加入体 积
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
2 μl
5. 混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 6. PCR反应程序：
步骤 预变性 变性 退火/延伸 融解曲线分 析 温度 95℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 95℃ 60℃ 时间 10min 15s 1 min 15s 1 min 15s 15s 注意事项： 1．首先配制预混体系，再将预混体系分 装到八连管中。 2. 稀释模板时，需要混匀。 不要直接在八连管管壁或管盖上做标
细胞RNA提取
3. 过柱子：
吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层） 加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀； 将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱 （Spin• Column RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
材料：2×UltraSYBR Green Mixture，cDNA，actin引物
实验步骤：
1. 稀释模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。
荧光定量PCR(染料法)实验操作SOP
荧光定量PCR实验操作SOP一、 实验目的：通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结果的分析；二、 实验准备：A.进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR操作实验室需紫外灯照射15分钟，关闭紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。
B.进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR模板污染；C.实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。
D.准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR实验操作的耗材（要求无菌）1ml 枪头、200ul枪头、10ul枪头、1.5ml离心管，用荧光定量PCR操作的试剂: 荧光定量PCRMaster Mix、Taqman Probe（实验前预先稀释浓度至25pmol）、H2O，DNA或CDNA模板（注意必须在配置完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）；E.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
F.实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。
三、 实验步骤：1、荧光定量PCR MIX的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、探针名称、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3倍平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix内容如下：Primer F: 0.5ul( 25pmol)Primer R: 0.5ul(25pmol)20×SYBER GREEN : 1.5uldNTP: 1ul(2.5mM)10*Buffer(含Mg2+) 3ulBT Taq: 0.5ulH2O: 22ulTotal: 29ul2、MIX配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA小心加入装有反应液体的反应管内，：DNA/CDNA Template: 1ul(200ng)荧光定量PCR 反应总体积：30ul3、模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；4、严格按照荧光定量PCR仪的操作手册启动机器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR扩增程序、荧光定量PCR样品孔及探针激发荧光程序、反应孔体系程序），保存文件，最好以日期及样品名称命。
荧光定量PCR操作规程(组织)
附录1第一步：RNA的提取材料：灭菌过的枪头、匀浆器、EP管、去离子水；TRIzol Reagent、三氯甲烷、异丙醇、、无水乙醇、离心机。
步骤：1）将大约100mg组织加入研磨器，加入1ml的TRLzol Rengent研磨20-30min；直到看不到大块的组织。
2）将液体倒入灭菌后的EP管内，加三氯甲烷250 μl，上下颠倒充分混匀，静置5min，4℃离心，13000×g，10min。
3）取上清液500 μl于另一灭菌过的EP管内，加入等量的异丙醇，混匀后放入4℃的冰箱15min后取出，4℃离心，13000×g，10min；倾倒出上面的液体，留在管底的白色沉淀即为RNA。
5）加入75%的乙醇1ml，4℃离心，7500×g，5min。
6）将上面的液体倒出，只剩白色沉淀；再瞬时离心，尽量吸干管内的液体，晾干，再加入适量的去离子水加以溶解。
第二步逆转录准备材料：逆转录试剂盒（TOYOBO，日本）反应体系：5×RT Buffer 4 μldNTP 2 μlOliga(dT)20 1 μlRNase free H2O 1μlRnase inhibitor 1μlReverTra Ace 1μlRNA 10μl总体系20μl 反应条件：42℃20min95℃5min4℃5min第三步Real-time PCR材料：SYBR Green mix（TOYOBO公司，日本）、上下游引物、cDNA、ddH2O 步骤：1、反应体系SYBR Green mix 12.5μlPlus solution 2.5μl上游引物（10pmol/μl）1μl下游引物（10pmol/μl）1μlddH2O 5.5μlcDNA（10倍稀释） 2.5μl总体系25μl2、反应条件50℃2min；95℃2min95℃15s Array退火15s72℃45s72℃10min；3. 扩增程序图：。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
!!Bio-Rad荧光定量PCR应用指南
50
5.5 应用举例
51
5.5.1 多重分析的反应组分
51
5.5.2 循环条件
51
5.6 基因表达数据分析
52
6. 基因型/等位基因分析
54
6.1 实验设计
55
6.2 使用 TaqMan 方法设计引物和探针
56
6.3 DNA 提取和样品处理
57
6.4 TaqMan 探针实验的反应组分
58
6.5 实验优化
目录
4. 荧光定量 PCR 数据分析
34
4.1 绝对定量
35
4.1.1 什么时候使用绝对定量?
35
4.1.2 使用标准曲线进行绝对定量
35
4.2 相对定量
37
4.2.1 什么时候使用相对定量
37
4.2.2 用质量单位作为标准进行相对定量
38
4.2.3 用参照基因作为标准进行相对定量
40
4.2.3.1 2–∆∆CT (Livak) 方法
Rozen S and Skaletsky HJ, Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers, pp 365–386 in Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology (Krawetz S and Misener S, eds), Humana Press, Totowa, NJ (2000); source code available at /primer3/
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实时荧光定量 PCR 仪快速操作指南说明书
实时荧光定量PCR仪快速操作指南1.连接电源从包装箱里取出仪器放置在实验台上，拿出电源线和电源适配器，将电源线一端与电源适配器相连，另一端连接至交流220V电源插座（AC85~264V）电源适配器的输出端连接到仪器电源插孔。
接口插入仪器电源插孔，注意插孔方向箭头方向朝上。
打开仪器背面的电源开关开启仪器，仪器自检成功，自动进入到软件界面。
2.样品准备◼准备试剂Q1600实时荧光定量PCR仪使用0.2ml透明离心试管根据试剂要求选用10-100μl合适的加液量。
◼离心操作配置完成试剂样本的试管在放入仪器之前，要用离心机进行离心操作，确保试剂液体处于试管底部，且液体内部不含有气泡。
◼放置样品将反应管按照顺序放入加热孔内。
3.设置程序，运行实验软件操作基本步骤：◼新建实验新建实验，选择运行槽◼基本设置设置实验名称，实验类型，检测项目，选择使用的染料。
◼样本设置设置样品名称，样本ID号，选择样本类型◼程序设置设置需要的反应程序◼保存文件单击保存，保存实验文件◼运行单击运行，运行实验。
4.结果分析◼实验结束，软件自动计算Ct值，根据判定规则自动出结果。
◼如需进行熔解分析和基因分型，在软件分析类型里选择相应的分析功能。
5.结果导出◼导出实验结果单击导出，导出实验数据。
◼结果打印连接配置的热敏打印机，选中要打印的样品孔，单击打印，打印实验结果。
6.关闭仪器◼实验结束，取出反应管◼长按仪器前面板关机按键，关闭仪器◼长时间不使用仪器，请关闭仪器背部左下角电源开关。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）是一种常用于检测和定量分析DNA或RNA浓度的技术。
该技术利用荧光探针与靶分子结合产生荧光信号，通过荧光信号的强度可以确定靶分子的数量。
本文将介绍荧光定量PCR实验及数据分析过程。
实验步骤：1.样品制备：根据研究需要选择DNA或RNA样品，提取并纯化目标DNA或RNA，并将其浓度测定。
2.酶切反应：如果需要对目标DNA或RNA进行酶切，可在此步骤中将其酶切为较小的片段。
3.扩增反应体系的准备：根据实验设计和厂家提供的建议，配置扩增反应所需的试剂。
4.PCR扩增：将目标DNA或RNA与引物和荧光探针一起添加到PCR反应管中，并进行PCR扩增。
根据实验设计，设置反应的温度梯度和时间。
5.实时荧光检测：在PCR扩增的过程中，使用实时PCR仪不断监测PCR反应管中的荧光信号，记录其强度变化。
6.构建标准曲线：选取一系列已知浓度的标准样品进行PCR扩增，并记录每个标准样品的荧光信号强度。
根据标准曲线绘制荧光信号强度和目标分子浓度的对应关系。
7.分析样品数据：将样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算样品中目标分子的浓度。
根据实验目的，可以对样品数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。
数据分析：1.标准曲线分析：使用标准曲线中的已知浓度和相应的荧光信号强度，通过拟合曲线或插值方法，可以计算出待测样品中目标分子的浓度。
2.相对定量分析：若需要比较不同样品之间目标分子的相对表达水平，可选取一个内参基因作为参照，通过计算目标分子基因和内参基因相对表达量的比值，进行比较分析。
3.统计分析：根据实验设计和样品数量，可以使用合适的统计方法对数据进行分析。
常见的统计方法包括t检验、方差分析等。
总结：荧光定量PCR技术在生物学研究中具有重要的应用价值，能够快速、准确地定量测定DNA或RNA的浓度。
在进行实验时，需要注意实验步骤的正确操作，并合理选择实验设计和数据分析方法，以确保结果的可靠性和准确性。
电子教材-荧光定量PCR应用指南
荧光定量PCR概述荧光定量PCR的主要概念2什么是荧光定量PCR?2荧光定量PCR工作原理3优化的qPCR实验特点4荧光定量PCR概述21. 荧光定量PCR概述核酸扩增和检测技术是当今生物学研究的重要手段之一。
包括基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等在内的各领域的科学家们用这种方法进行广泛的应用研究。
对于某些应用，核酸定性检测就可以满足需求；而另外一些应用，要求进行定量分析。
为你的应用选择最好的解决方案需要对技术有广泛的了解。
本指南介绍荧光定量PCR的多项技术特点，包括设计优化的荧光定量PCR实验以及不同应用目的的数据处理及分析。
第5-7章用不同的实验设计和数据来阐述荧光定量PCR在专业领域的应用，包括基因表达分析、等位基因分析、转基因生物(GMO)检测。
本指南介绍了一项强有力的技术及提供了一些必要的信息，希望能满足您现在及将来的应用需求。
1.1 荧光定量PCR的主要概念1.1.1 什么是荧光定量PCR？常规PCR中，扩增产物（扩增子）是通过终点法来分析检测，即PCR反应结束后，DNA通过琼脂糖凝胶电泳，然后进行成像分析。
而荧光定量PCR可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，即“实时”。
在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。
满足实验目的的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异引物或探针；专门的热循环仪配备荧光检测模块，用于监测扩增时的荧光，检测到的荧光信号反映了每个循环扩增产物的量。
相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。
荧光定量PCR结果可以用于定性（判断一段序列的有无），也可以用于定量（确定DNA拷贝数），即qPCR ，而常规PCR只能做半定量。
另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。
还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。
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荧光定量PCR实验指南（一）一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。
然后，点击“save”保存即可。
分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。
2、引物和探针设计2.1引物设计细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。
理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。
设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。
下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：序列选取应在基因的保守区段；扩增片段长度根据技术的不同有所分别：sybr green I技术对片段长度没有特殊要求；Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；避免引物自身形成环状发卡结构；典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；引物之间的TM相差避免超过2℃；引物的3’端避免使用碱基A；引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
2.2 T aqman 探针设计一般设计原则：探针位置尽可能地靠近上游引物；探针长度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。
探针的5’端应避免使用碱基G。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
()2.3 T aqman MGB 探针设计介绍MGB探针的优点：MGB探针较短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。
短片段探针(14-20bp)加上MGB后，Tm值将提高10℃，更容易达到荧光探针Tm值的要求。
MGB探针的设计原则探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
用primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67℃。
尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。
尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。
因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。
反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。
若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。
有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。
另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。
2.4 实时多重PCR探针的选择：多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。
另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。
多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman 探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon 探针。
在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件，打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。
弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。
3、影响PCR及荧光PCR 的其他因素引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。
可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。
但是，好的设计并不等于好的实验结果，影响PCR和荧光PCR的因素非常多，下面择其重要进行介绍。
3.1 引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。
在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
3.2 引物浓度引物的浓度会影响特异性。
最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。
较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。
然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。
微摩消光系数可以使用公式2计算。
与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。
这是因为引物较短，碱基组成差异很大。
在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。
一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少，在一般情况下，20个碱基长的引物，1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul（50μM）。
也可以用OLIGO软件，根据引物的的消光系数（OD/μmol），计算出一定的工作浓度下，引物的加水量。
浓度(μM)＝A260（OD/ml）×稀释系数×消光系数的倒数（nmol/OD）举例：计算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀释100倍（加入990μl）水中。
在A260处测吸光度为0.2。
计算消光系数的倒数为4.8 nmol/OD，代入得：浓度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM3.3 引物、探针的纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。
这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。
这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。
在任何一个循环都可能失败。
较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。
也可以用双蒸水溶解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记，标记本身有效率的区别。
探针标记以后一般应该纯化，纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，且保存时间可以高达一年以上。
不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。
由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2uM（10×），作为工作浓度分装多支，避光保存。