基因表达调控第三课mRNA水平的研究9-29汇总.
真核生物基因表达的调控
4、DNA甲基化与基因组印迹 （1）基因组印迹：来源于父母本的一对等位基因
表达不同（如X染色体失活） （2）基因组印迹的机制--DNA高度甲基化
5、DNA甲基化与X染色体的失活 X染色体DNA序列高度甲基化，基因被关闭
（1）与X染色体的失活有关的序列：
AP2
??
结合蛋白 (protein binding)
AP2 AP1
? SP1
? TF IID +
RNApol
BLE basal level element MRE metal response element AP activator protein
应答元件的特点：
1. 具有与启动子、增强子同样的一般特性. 2. 与起始点的位置不固定（多在-200以内;单个功能充分,
非洲爪蟾的卵母细胞 rDNA的拷贝数目： 500份 2×106份，可装配1012个核糖体 当胚胎期开始，增加的rDNA便失去功能并逐渐消失
二、基因丢失
有的生物在个体发育的早期在体细胞中要丢 失部分染色体，而在生殖细胞中保持全部的 基因组。
小麦瘿蚊（染色丢失了32条，只保留8条）
马蛔虫
三、基因重排(gene rearrangement)
的下游起作用。 4、与它结合的转录因子是GCN4和GAL4，识别位
点为 ATGACTCAT。
（四）绝缘子(Insulator)
阻止激活或失活效应的元件
举例：
1、当绝缘子位于增强子和启动子间时，能阻止 增强子激活启动子作用。
2、当绝缘子位于一个活化基因和异染色质之间 时，它保护基因免受由异染色质扩展造成的失 活效应影响。
Constant
基因表达调控
基因表达调控基因表达调控是指细胞中基因的转录和翻译过程，以及基因产物的调控和调节。
调控基因表达可以影响细胞的生理状态和功能。
本文将介绍基因表达调控的机制和方法。
一、转录调控转录调控是指通过调节基因的转录过程来影响基因表达。
转录调控可以通过激活或抑制转录因子的结合来实现。
1. 转录激活转录激活是指转录因子与启动子结合，促进转录的过程。
转录因子可以通过结合DNA序列上的特定区域，招募RNA聚合酶，从而启动基因的转录。
例如，转录因子可以结合到启动子区域，招募辅助蛋白质，形成转录激活复合物，促进转录的进行。
2. 转录抑制转录抑制是指转录因子与启动子结合，阻碍转录的过程。
转录抑制可以通过阻止转录复合物的形成或招募转录抑制因子来实现。
例如，一些转录因子可以竞争性地结合到启动子区域，阻碍转录因子的结合，从而抑制转录。
二、转录后调控转录后调控是指在基因转录和翻译之后对基因产物进行调控和调节。
1. RNA剪接调控RNA剪接是指在转录后的RNA分子中去除内含子，将外显子连接起来的过程。
通过不同的剪接方式，可以合成出不同的mRNA亚型，从而影响基因表达。
剪接调控可以通过剪接因子的调节来实现。
例如，一些剪接因子的表达水平可以受到转录因子的调节，从而影响剪接的结果。
2. RNA修饰调控RNA修饰是指在转录后的RNA分子中添加各种化学修饰基团的过程。
RNA修饰可以通过调节修饰酶的活性来实现。
不同的RNA修饰形式可以影响RNA的稳定性、转运和翻译效率。
三、表观遗传调控表观遗传调控是指通过改变染色质结构和DNA甲基化状态来影响基因的表达。
表观遗传调控可以通过组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA等多种方式实现。
1. 组蛋白修饰调控组蛋白修饰是指在染色质上修饰组蛋白蛋白质的过程。
组蛋白修饰可以改变染色质的紧密程度，从而影响基因的可及性。
例如，乙酰化组蛋白可以解开染色质的紧密程度，促进基因的转录。
2. DNA甲基化调控DNA甲基化是指在DNA分子上添加甲基基团的过程。
第八章9-29 Meta分析
一般来说，研究题目应符合FINER标准(可行，有趣，新颖， 符合伦理，有意义) Meta分析和系统评价要解决的问题相对专一，因此要求原 始资料的研究方案、研究对象、干预措施相似或相同。
第八章 第二节 Meta分析的计划书
一般步骤：
（二）检索所有相关的研究文献（要求查新和查全结合）
要求包括公开发表和未公开发表的文献。检索质量非常关键，最后会影响Meta分析
第八章第二节 Meta分析的计划书
一般步骤：
（五）制定综合定量分析与内容
的框架图：
包括比较目的？主要指标？结果相似性？
效应量的表达方式？
第八章第二节 Meta分析的计划书
一般步骤：
（六）绘制森林图：
森林图是由多个原始文献的效应量及其95%可信区间绘制而成，纵坐 标为效应量尺度，横坐标为原始文献的编号，按照一定的顺序，将各个研 究的效应量及其95%可信区间依次绘制到图上。 可图示原始文献研究结果的主要特征。 可用于描述每个原始研究的效应量 分布及其特征，同时展示研究间结果的差异情况。
的效度（真实性）。注意查全与查新结合。建立全面地检索策略。避免偏倚（如发 表偏倚、选择性偏倚、语种偏倚）。
思路：查阅个人文档 找一篇符合纳入标准的原始文献和一篇相关综述，从
这两篇文章的题目和摘要中找出索引词（关键词）。
检索适当的电子文献数据库 找到关键词，设计检索公式，检索文献；浏览
文献，寻找新的关键词，重复检索，直到没有新的文献出现为止。用修改 好的最后检索公式检索整个数据库。
一、 Meta分析的统计描述 （一）数据来源及分类 （二）确定效应量的表达形式 （三）森林图
二、异质性检验 （一）Q检验 （二）异质性来源与处理 三、合并效应量的估计与统计推断 四、敏感性分析
基因表达调控的转录后机制例题和知识点总结
基因表达调控的转录后机制例题和知识点总结基因表达调控是细胞生命活动中至关重要的环节，它确保了基因在适当的时间和空间以合适的量进行表达。
其中，转录后机制在基因表达的精细调节中发挥着关键作用。
本文将通过一些例题来帮助您更好地理解基因表达调控的转录后机制，并对相关知识点进行总结。
一、转录后调控的主要机制1、 mRNA 加工在真核生物中，初级转录产物（前体 mRNA）需要经过一系列的加工才能成为成熟的 mRNA。
这包括 5'端加帽、3'端加尾以及内含子的剪接。
例如，5'端的帽子结构可以提高 mRNA 的稳定性，促进核糖体的结合和翻译起始。
2、 mRNA 运输mRNA 从细胞核转运到细胞质的过程也是受到调控的。
只有经过正确加工和修饰的 mRNA 才能被有效地运输到细胞质中进行翻译。
3、 mRNA 稳定性mRNA 的半衰期长短对基因表达水平有重要影响。
一些 mRNA 会被特定的核酸酶快速降解，而另一些则相对稳定。
例如，某些 mRNA 上存在特定的序列，能够与稳定蛋白结合，从而延长其寿命。
4、翻译调控这包括核糖体结合、起始密码子的识别、翻译起始因子的作用等。
例如，一些蛋白质可以结合到mRNA 的特定区域，抑制核糖体的结合，从而阻止翻译的进行。
二、例题分析例题 1：研究发现，某种细胞中一个特定基因的 mRNA 半衰期明显缩短，导致其编码的蛋白质表达量降低。
以下哪种情况最有可能导致这一现象？A 5'端帽子结构缺失B 3'端多聚腺苷酸尾缩短C 内含子剪接错误D 核糖体结合效率降低解析：A 选项，5'端帽子结构缺失会影响 mRNA 的稳定性，使其更容易被核酸酶降解，从而导致半衰期缩短。
B 选项，3'端多聚腺苷酸尾缩短也会降低 mRNA 的稳定性。
C 选项，内含子剪接错误可能会影响mRNA 的正常结构和功能，但不一定直接导致半衰期缩短。
D 选项，核糖体结合效率降低主要影响翻译过程，而不是 mRNA 的稳定性。
基因表达调控机制解析
基因表达调控机制解析基因表达调控机制是指细胞在特定的生理或病理条件下，通过不同的分子信号和调节因子，对基因的转录和翻译进行调控的过程。
这一过程对于维持细胞的正常功能、发育和适应环境变化至关重要。
本文将针对基因表达调控机制进行详细解析，包括转录调控、转录后调控和翻译调控等。
转录调控是基因表达调控的第一步，它决定了哪些基因要被转录成mRNA。
在细胞核中，DNA中的特定序列被RNA聚合酶识别并转录成mRNA。
转录因子是一类能与DNA结合的蛋白质，它们通过与DNA结合来调节RNA聚合酶的结合和活性。
转录因子可以降低或增强RNA聚合酶的结合和转录活性，从而对基因的转录进行调控。
例如，激活型转录因子结合到启动子区域上，促进RNA聚合酶与基因的结合和转录，而抑制型转录因子则具有相反的作用。
转录因子的调控活性可以受到多种内外因素的影响，如细胞外信号分子、细胞内代谢物的浓度改变等。
转录后调控是指在RNA聚合酶合成mRNA之后，对mRNA进行修饰和调控的过程。
其中一个重要的调控方式就是RNA的剪接。
在剪接过程中，pre-mRNA分子中的部分内含子序列被剪切掉，从而生成成熟的mRNA。
剪接的精确性和效率对于基因表达的正确调控起着重要作用。
此外，还有其他一些方式可以调控转录后的mRNA，如RNA编辑和RNA 降解等。
RNA编辑可以通过改变mRNA中的碱基组成来改变其编码的蛋白质序列，从而调节基因表达。
RNA降解是指通过降解mRNA分子来调节其表达水平，这是一种常见的调控方式。
翻译调控是指在mRNA被翻译成蛋白质的过程中，通过调节翻译的速率和效率来对基因表达进行调控。
这种调控方式主要通过翻译起始子和终止子区域的序列差异来实现。
翻译调控还可以通过一些非编码RNA和结合蛋白的方式来发挥作用。
这些非编码RNA可以与mRNA结合，从而改变mRNA的翻译效率。
结合蛋白可以与mRNA或蛋白质结合，从而调节蛋白质的稳定性和功能。
除了上述的直接调控机制外，基因表达还受到染色质结构和组织特异性等因素的影响。
基因表达与调控知识点总结
基因表达与调控知识点总结基因表达和调控是生物学中非常重要的概念，关乎着生物个体的生长发育、适应环境以及疾病的产生。
本文将对基因表达和调控的相关知识点进行总结，以帮助读者更好地理解这一领域。
一、基因表达的概念与过程基因表达是指通过DNA转录成RNA，再通过RNA翻译成蛋白质的过程。
这个过程可分为三个主要步骤：转录、剪接和翻译。
1. 转录：转录是指DNA模板上的信息被RNA聚合酶酶依据碱基互补配对的原则合成成为一条mRNA链的过程。
转录分为起始、延伸和终止三个阶段，其中起始阶段涉及到转录起始因子和启动子的结合，延伸阶段则是RNA链的合成过程，终止阶段是转录终止信号的识别和RNA链的释放。
2. 剪接：在转录后，mRNA经历了剪接这一过程。
剪接是指将mRNA上含有内含子（introns）的序列剪除，只保留外显子（exons）的过程。
这是因为在真核生物中，基因上的非编码区域和编码区域是交错存在的，剪接的目的是产生功能蛋白质所需的成熟mRNA。
3. 翻译：翻译是指mRNA上的信息被核糖体翻译成蛋白质链的过程。
翻译过程中，mRNA的密码子与tRNA上的氨基酸互相匹配，从而合成出特定顺序的氨基酸链。
翻译完成后，蛋白质会进一步经历折叠和修饰过程，最终形成功能蛋白质。
二、基因调控的方式及相关机制基因表达的调控是指细胞根据环境和内部信号对基因表达的调整和控制。
基因调控主要包括转录水平的调控和转录后的调控。
1. 转录水平的调控（1）启动子和转录因子：启动子是位于基因的上游区域，能够招募转录因子结合并促进或抑制基因转录。
转录因子是一类能够识别和结合到启动子上的蛋白质。
不同基因的启动子和转录因子组合形成了复杂的转录调控网络，大大影响基因的表达水平。
（2）组蛋白修饰：组蛋白修饰是指对染色质上的组蛋白进行化学修饰，从而影响染色质的结构和染色质的开放程度。
这些化学修饰包括甲基化、磷酸化、乙酰化等，能够影响基因的可及性和转录因子的结合。
mrna lncrna基因表达调控原理
mrna lncrna基因表达调控原理mRNA和lncRNA是基因表达调控的重要角色。
下面是它们各自的基因表达调控原理：1. mRNA的基因表达调控原理：mRNA是蛋白质编码基因的转录产物。
mRNA的表达调控主要包括转录调控和转录后调控两个层次。
- 转录调控：转录调控主要通过调控转录因子的结合来控制基因转录活性。
转录因子是能够结合到DNA上启动子区域的蛋白质，它们能够激活或抑制基因的转录。
转录因子的结合能力受到多种因素的影响，如细胞内信号传导和环境因素等。
- 转录后调控：转录后调控指的是mRNA在转录过程后的调控过程，包括可变剪接、核糖体选择性和mRNA降解等。
可变剪接使得一个基因可以产生多个不同的转录本，从而扩展了基因的功能。
核糖体选择性是指选择性地翻译某些mRNA分子，使之产生蛋白质。
mRNA降解是指通过降低mRNA的稳定性来调控基因表达水平。
2. lncRNA的基因表达调控原理：lncRNA是长链非编码RNA，它们不被翻译成蛋白质，而是通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用来调控基因表达。
- 转录调控：lncRNA可以作为转录因子来调控某些基因的转录活性。
它们可以与DNA相互作用并改变某些基因的表达水平。
- 转录后调控：lncRNA还可以通过与mRNA相互作用来调控转录后过程，包括可变剪接调控、mRNA稳定性调控和翻译调控等。
例如，某些lncRNA可以与mRNA形成RNA-RNA 复合物，从而影响可变剪接的进行。
此外，lncRNA还可以通过与蛋白质相互作用来调控基因表达，例如某些lncRNA可以与转录因子或翻译因子相互作用，从而影响基因的转录和翻译过程。
总之，mRNA和lncRNA通过转录调控和转录后调控等多种机制来调控基因表达。
它们的作用可以是促进基因表达，也可以是抑制基因表达。
mRNA稳定性与基因表达
二、原核生物中mRNA稳定性与基因表达
Csr AB是大肠杆菌中的一个调节系统，CsrA是 一个RNA结合蛋白，CsrB是一个非编码RNA分子。 一般条件下CsrA结合到CsrB分子上，调控表达 时，CsrA从CsrB上脱落，结合在受调控的mRNA 分子上，通过改变mRNA的二级结构，使得其变 成易受核酸酶攻击的不稳定构象，最终被降解。 静止期细菌细胞糖原的储存和生长期糖酵解途 径消耗糖原的平衡便是由Csr AB系统调节。
而mRNA分子降解的可能性主要取决于他们的二 级结构。
inhibit
DNA
feedback
RNA聚合酶/转 录复合物
识别蛋白
protein
inhibit
mRNA
RNase/ PNPase/ RNA helicase
mRNA degradation
Figure1 mRNA稳定性调节模型图
PNPase： exonuclease polynucleotide phosphorylase
铁浓较低
不能起始翻译
稳定性高 不降解
铁浓度较高 起始翻译 稳定性低 降解
csrA-csrB 复合体
glg mRNA
csrA
核酸酶
glg mRNA降解
glg mRNA不能作为模版翻译
三、真核生物中mRNA稳定性与基因表达
真核生物中，转铁蛋白受体（TfR）负责铁摄取， 铁蛋白负责铁解毒。在转铁蛋白受体和铁蛋白 mRNA上存在相似的铁应答元件（iron responsive element，IRE），IRE与IRE结合蛋 白（IRP）之间的相互作用控制了两个mRNA的翻 译效率。 其中，铁蛋白中，IRE和IRP的相互作用促使 mRNA构象改变，无法起始铁蛋白mRNA的翻译。 在转铁蛋白受体中，IRE和IRP的相互作用使得 mRNA变得更加的稳定，不易受到细胞中核酸酶 的攻击，可以稳定的翻译出新的蛋白质。
基因的表达与调控
No RNA
R-
1 No RNA R-
No RNA
RNA
RNA
RNA
RNA
No RNA
No RNA
1
21
2
2
32
3
3、基因的微细结构
20世纪50年代的生化技术还无法进行DNA的序列 测定，本泽尔利用经典的噬菌体突变和重组技术， 对T4噬菌体rⅡ区基因的微细结构进行了详细分析。
野生型T4噬菌体 可侵染B株和K12株 噬菌斑小而模糊
功能上被互补（顺反）测验所规定的核苷酸 序列。
假定有两个独立起源的隐性突变，如a1与a2，它 们具有类似的表型。
如何判断它们是属于同 一个基因的突变，还是分 别属于两个基因的突变？ 即如何测知它们是否是等 位基因？
二、基因的微细结构
1、互补作用与互补测验(顺反测验)
需要建立一个双突变杂合二倍体，测定这两个突 变间有无互补皱粒表现型是由于缺少了淀粉档分享dnagtacatcatgtacttgaaacttgacctggagaacttgaacttaaatttmrna密码子guacaucuuacuccugaagaaaaa氨基酸dnagtacatmrna密码子gua氨基酸dnaaaatttmmrna密码根据红色面包霉的研究提出了一个基因一个酶的假说后来又被修改为一个基因种多肽链
Enzymes
B
CAP
G
R
ZY A
a
b
P
X
在有葡萄糖存在时，不能形成cAmp，也就不能 形成正调控因子cAmp-CAP，因此，基因不表达。
目前，通过遗传分析证明了lac操纵元的存在； 已经分离出阻遏蛋白，并成功地测定了阻遏蛋白 的结晶结构，以及阻遏蛋白与诱导物及操纵子序 列结合的结构。
基因表达的调控
基因表达调控(gene regulation或gene control)：对 基因表达调控 或 ： 基因表达过程的调节。 基因表达过程的调节。 基因表达的组织特异性(tissue specificity)： 基因表达的组织特异性(tissue specificity)：不同组 织细胞中不仅表达的基因数量不相同，而且基因 织细胞中不仅表达的基因数量不相同， 表达的强度和种类也各不相同。 表达的强度和种类也各不相同。 基因表达的阶段特异性(stage specificity)： 基因表达的阶段特异性(stage specificity)：细胞分 化发育的不同时期，基因表达的情况是不相同的。 化发育的不同时期，基因表达的情况是不相同的。
魔斑的主要作用： 魔斑的主要作用： (1) ppGpp—四磷酸鸟苷(魔斑I magic spot I) ppGpp—四磷酸鸟苷(魔斑I 调控一些反应的效应物，主要功能是： 调控一些反应的效应物，主要功能是： 抑制rRNA基因的启动子与RNA聚合酶与结合的专一性 基因的启动子与RNA聚合酶与结合的专一性； ① 抑制rRNA基因的启动子与RNA聚合酶与结合的专一性； 抑制多数或大多数基因转录的延伸。 ② 抑制多数或大多数基因转录的延伸。 (2) pppGpp—五磷酸鸟苷(魔斑II magic spot II) pppGpp—五磷酸鸟苷(魔斑II 当细胞缺乏氨基酸时产生ppGpp， 当细胞缺乏氨基酸时产生ppGpp，可在很大范围内做出应急 反应，如抑制核糖体和其他大分子的合成， 反应，如抑制核糖体和其他大分子的合成，活化某些氨基酸操 纵子的转录表达，抑制与氨基酸运转无关的转运系统， 纵子的转录表达，抑制与氨基酸运转无关的转运系统，活化蛋 白水解酶等。 白水解酶等。 空转反应（ reaction） 空载tRNA 空转反应（idling reaction）－空载tRNA 松驰型突变（relaxed(rel)mutants） 松驰型突变（relaxed(rel)mutants） 应急因子（ factor） 应急因子（stringent factor）：RelA
mrna水平鉴定基因表达途径
mrna水平鉴定基因表达途径mRNA水平鉴定基因表达途径引言mRNA（messenger RNA）是一种在基因表达过程中起关键作用的分子。
通过mRNA水平的鉴定，我们可以了解基因的表达水平以及参与基因调控的途径。
本文将介绍mRNA水平鉴定基因表达途径的原理、方法和应用。
一、原理mRNA是由DNA转录而来的，它携带着基因信息并在细胞中转译成蛋白质。
mRNA水平鉴定基于mRNA的表达量来推断基因的表达水平。
当一个基因表达水平上调时，其对应的mRNA表达量也会增加，反之亦然。
二、方法1. qRT-PCR（定量逆转录-聚合酶链式反应）qRT-PCR是一种常用的mRNA水平鉴定方法。
首先，通过逆转录将mRNA转化成cDNA，然后使用聚合酶链式反应（PCR）来扩增cDNA。
在PCR过程中，引入了一种荧光探针（例如SYBR Green 或T aqMan探针），可以实时监测PCR产物的扩增情况。
根据PCR 产物的丰度，可以推断出初始mRNA的表达量。
2. RNA-SeqRNA-Seq是一种高通量测序技术，可以对全转录组进行测序。
通过RNA-Seq，可以得到每个基因的mRNA序列的数量信息，从而推断基因的表达水平。
RNA-Seq的优势在于不需要事先知道基因的序列，且可以检测低表达基因和新基因。
3. 基因芯片基因芯片是一种常用的高通量平行检测技术。
它通过固定在芯片上的DNA探针与待测样品中的mRNA结合，从而检测mRNA的表达水平。
基因芯片可以同时检测上千个基因的表达水平，具有高通量和高灵敏度的优势。
三、应用mRNA水平鉴定基因表达途径广泛应用于生物医学研究和临床实践中。
1. 疾病诊断和预后评估mRNA水平的变化与多种疾病的发生和发展密切相关。
通过分析患者样本中特定基因的mRNA表达水平，可以帮助医生进行疾病的诊断和预后评估。
例如，某些肿瘤标志物的mRNA表达水平可以用于肿瘤的早期诊断和预后评估。
2. 药物研发和治疗选择mRNA水平鉴定可以帮助研究人员了解药物对基因表达的影响，从而指导药物的研发和治疗选择。
基因表达的调控机制
基因表达的调控机制基因表达是指基因信息转录成RNA，再翻译成蛋白质的过程。
在细胞内，基因表达需要受到严格的调控，以确保细胞在不同环境下能够适应并正常运作。
基因表达的调控机制涉及到多个层面，包括转录水平、转录后调控、翻译水平和蛋白后修饰等。
本文将从这些方面介绍基因表达的调控机制。
1. 转录水平的调控转录是基因表达的第一步，也是调控基因表达的关键环节。
在转录水平，基因的表达可以通过启动子区域的甲基化、转录因子的结合、染色质重塑等方式进行调控。
启动子区域的甲基化可以影响转录因子的结合，从而影响基因的转录活性。
转录因子是一类能够结合到DNA上特定序列的蛋白质，它们可以促进或抑制基因的转录。
染色质重塑是指通过改变染色质的结构来影响基因的可及性，从而调控基因的表达水平。
2. 转录后调控转录后调控是指转录后RNA的修饰和稳定性调控。
在细胞核内，RNA经过剪接、剪切、聚腺苷酸化等修饰过程，形成成熟的mRNA。
这些修饰过程可以影响mRNA的稳定性和翻译效率。
另外，miRNA和siRNA等小RNA也可以通过靶向特定mRNA分解或抑制翻译来调控基因表达。
3. 翻译水平的调控翻译是指mRNA上的密码子被翻译成氨基酸序列的过程。
在翻译水平，基因的表达可以通过启动子区域的结构、mRNA的稳定性、翻译因子的结合等方式进行调控。
启动子区域的结构可以影响翻译因子的结合，从而影响翻译的进行。
翻译因子是一类能够结合到mRNA上特定序列的蛋白质，它们可以促进或抑制翻译的进行。
4. 蛋白后修饰蛋白后修饰是指蛋白质合成后，蛋白质经过翻译后修饰的过程。
在细胞内，蛋白质可以通过磷酸化、甲基化、乙酰化等方式进行修饰，从而影响蛋白质的功能和稳定性。
这些修饰过程可以调控蛋白质的活性、亚细胞定位和相互作用等。
综上所述，基因表达的调控机制涉及到转录水平、转录后调控、翻译水平和蛋白后修饰等多个层面。
这些调控机制相互作用，共同调节基因的表达水平，以适应细胞在不同环境下的需要。
基因表达调控 第三课 mRNA水平的研究9-29
11.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％。
12.TM值在55-63度之间。
Real-time PCR的应用：
DNA 或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物 或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数 的检测，RNAi 基因失活率的检测等。 基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本 之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处 理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达 差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。 基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。
（3）Alternative polyadenylation (APA)
APA consist of two steps, cleavage and polyadenylation of RNAs, which are maturation events that cut and add an oligo(dA) tail to the 3’ end of the nascent transcript. This processing protects mRNAs from degradation and increases their stability. The specific cleavage position and the efficiency of the process depend on the interaction between trans-acting polyadenylation factors and cis-elements present in the pre-mRNAs, such as the central sequence motif AAUAAA.
提取用试剂：Trizol reagent RNA提取注意事项：要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase
基因的表达与调控
基因的表达与调控基因是生物体内遗传信息的基本单位，能够影响个体的生长发育、形态特征和功能活动。
基因表达与调控是指基因在细胞内转录和翻译过程中的调节机制。
通过对基因的表达与调控的深入研究，我们可以更好地理解生物体的发育过程、疾病的发生机制以及其他重要生物学现象。
一、基因表达的过程基因表达是指基因中的遗传信息转录成RNA分子并进一步翻译成蛋白质的过程。
在这个过程中，涉及到DNA的转录、RNA的加工修饰和翻译等多个环节。
1. DNA的转录DNA转录是指在细胞核内的DNA模板上合成RNA的过程。
这一过程主要通过RNA聚合酶酶对DNA进行识别并复制。
在DNA的编码区域上，RNA聚合酶按照一定的序列将DNA转录成RNA。
这种RNA 称为信使RNA（mRNA），它携带着基因的信息，将参与到后续的翻译过程中。
2. RNA的加工修饰转录得到的初级RNA（pre-mRNA）需要进行加工修饰，以生成成熟的mRNA。
这个过程包括去除非编码区域（外显子）和连接编码区域（内含子）等步骤，最终形成成熟的mRNA分子。
这些修饰过程有助于提高基因表达的效率和准确性。
3. RNA的翻译mRNA在细胞质中通过核糖体与tRNA和氨基酸配合，进行翻译成蛋白质。
这个过程涉及到密码子与氨基酸的配对，根据规定的遗传密码表将RNA翻译成蛋白质的氨基酸序列。
二、基因表达的调控基因的表达需要在不同时间和空间上进行精确的调控，以满足细胞和生物体在各种环境中的需求。
基因调控主要通过转录调控和转录后调控两个层面实现。
1. 转录调控转录调控是指在基因转录过程中，通过调控转录起始和速率来控制基因表达水平的过程。
这一过程涉及到启动子、转录因子和染色质结构等多个因素的调控。
- 启动子区域：启动子是转录起始的信号区域，细胞通过启动子的甲基化、乙酰化和甲基化等修饰方式调控基因的转录起始。
- 转录因子：转录因子是参与基因转录的蛋白质，它们能与启动子和调控区域结合，促进或抑制基因的转录活性。
分子生物学第八章 基因表达调控
4、阻遏蛋白与操作子的相互作用
阻遏蛋白与操作子是否发生相互作用？ 硝酸纤维素膜可以和蛋白质结合而不与ＤＮＡ结合 阻遏蛋白四聚体结合与膜上，可以与野生型DNA片段形 成复合物。并可被IPTG抑制。 而用lacOc 突变体的DNA片段，则不能与阻遏蛋白结合
Luxury gene
顺、反因子间互作方式的基因表达调控
♫ 顺式作用元件（cis-acting element）:能够影响 同一条或相连DNA序列活性的特定DNA片段。例如，启 动子 ♫ 反式作用因子（trans-acting factor）:一种基 因的蛋白质产物，能够影响位于基因组另一条染色体上的 （或基因组别处的）另一个基因的表达活性。例如，RNA polymerase
经典锌指的三维结构：一个β发卡和一个α－螺旋
锌指上的α－螺旋 负责与DNA作用
b、Cys-Cys(C2/C2)锌指
Zn＋＋与4个Cys残基 形成配位键
酵母的转录激活 因子GAL4、哺 乳类的固醇类激 素受体为典型代 表。
糖皮质激素受体
• ZYJ272 •
The DNA-binding domain of Cys2-Cys2 zinc finger proteins (Figure 1. Glucocorticoid receptor) is composed of two irregular antiparallel beta-sheets and an alpha-helix, followed by an extended loop.
♫ 操纵元中各结构基因按一定比例协调翻译 ♫ 聚有极性突变效应：
操纵元中一个近基因的无义突变能够影响远基因表， 且根据距离远近呈极性梯度效应
基因表达调控 第三课 mRNA水平的研究9-29
（三）Real-time PCR 实时定量PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变 化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的 变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定 量分析。
引物设计原则
在NCBI找到目的基因序列，以CDS区进行引物设计。 1.最好位于编码区5′端的300-400bp区域内，可以用DNAman,
（六）原位杂交（in situ hybridization，ISH）
➢ 可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位 ➢ 标 记 探 针 特 异 性 地 与 目 标 靶 mRNA 序 列 杂 交 ， 检 测 标
记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。 ➢ 可作为定量分析的补充。
什么情况下选择原位杂交？ 没有合适的抗体，不宜做Western blot检测；样本量太少或比 较复杂，不宜提取RNA或蛋白。
RPA比Northern Blot的优势：
1. 过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应 更加完全 2. RPA比Northern Blot灵敏15-150倍，适合检测各种表 达水平之基因 3. RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一 情况下的差异表达 4. 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加 快研究速度
➢ 基本原理：
将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的 RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的 RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化； 而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化 形成寡核糖核酸。
RPA基本程序：
➢ 待测RNA的分离 ➢ 体外转录标记RNA探针 ➢ 待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ➢ RNA酶消化 ➢ 不同大小杂交片段凝胶电泳分离
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反转录引物
反转录引物
注意事项：
1．防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 2. 避免gDNA的污染，用DNase处理。 3．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 4．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参 有
GAPDH、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及
提取用试剂：Trizol reagent RNA提取注意事项：要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase
的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止 手、唾液和空气中RNase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、 移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌 15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase，可以 不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品 经常有RNase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃 器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）
RNA浓度和纯度检测 A260/A280 表示质量（一般在1.8-2.0），A260表示数量。 RNA完整度检测 28S RNA大小一般为5 kb，18S RNA 大小一般为2 kb。28S RNA 的亮度一般是18S 的两倍。
RNA琼脂糖凝胶电泳
（二）RT-PCR（半定量PCR）
RT-PCR相关试剂
Northern blot 流程图
Northern blot
优点：northern blot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于 它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化； 与定量PCR的高灵敏度相比，northern blot较高的特异性可以有效 的减少实验结果的假阳性。 缺点： Northern blot 实验中要防止RNA的降解，所有实验用品都需要经 过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时， northern blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人 体都有一定的伤害。
RPA基本程序：
待测RNA的分离
体外转录标记RNA探针
待测RNA与探针RNA进行液相杂交
Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变 剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的 处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。
（五）核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA）
是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法 基本原理： 将标记的特异 RNA 探针（ 32P或生物素）与待测的 RNA样品液相杂交，标记的特异 RNA 探针与目的 RNA结合，形成双链 RNA，免受RNA酶的消化； 而未结合的单链 RNA经 RNA酶 A或 RNA 酶 T1 消化 形成寡核糖核酸。
一、RNA研究策略和方法
RT-PCR, Real-time PCR， Northern blot, RNA酶保护实验,
差异筛选，
基因芯片
（一）RNA的提取
Total RNA：rRNA约占80％-85％，tRNA和核内小分子 RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，琼脂糖凝胶电泳
中只能看到：28S，18S，5S。
11.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％。
12.TM值在55-63度之间。
Real-time PCR的应用：
DNA 或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物 或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数 的检测，RNAi 基因失活率的检测等。 基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本 之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处 理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达 差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。 基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。
A
B
RT PCR Real-time PCR
定量PCR引物设计软件：
Primer bank
（四）Northern blot
将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继
而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和
用探针进行杂交检测。
Northern blot主要用于检测样品中是否含有基 因的转录产物（mRNA）及其含量。
各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 5. 稀释cDNA，内参循环数20-26。
6. 扩增产物长度300-500 bp。
（三）Real-time PCR 实时定量PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变 化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的 变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定 量分析。
mRNA分析技术
基因表达 基因
mRNA
蛋白质多肽链
基因表达的变化可以两个水平进行分析：mRNA 水平 和蛋白质水平 mRNA表达变化的检测方法：Northern blot, RTPCR(半定量PCR), Real-time PCR (定量PCR), 荧光原 位杂交等、基因芯片、高通量测序等 mRNA 表达变化的机制的研究方法方法有：启动子活性分 析（转录水平分析）、mRNA转录效率分析（Nuclear run on）、mRNA稳定性检测（转录后水平）
5.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6.引物5′端可以修饰。
7. 3′端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich 的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 8. 引物3′端要避开密码子的第3位。 9. 荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 10. 最好跨内含子。
引物设计原则
在NCBI找到目的基因序列，以CDS区进行引物设计。
1.最好位于编码区5′端的300-400bp区域内，可以用DNAman,
Alignment 软件看看结果。 2.引物长度一般-60%之间，45-55％最佳。 4.引物自身不能有连续4个碱基的互补。