基因表达调控第三课mRNA水平的研究9-29汇总.

11.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％。
12.TM值在55-63度之间。
Real-time PCR的应用：
DNA 或RNA 的绝对定量分析，包括病原微生物 或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数 的检测，RNAi 基因失活率的检测等。 基因表达差异分析，例如比较 经过不同处理样本 之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处 理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达 差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。 基因分型，例如SNP检测，甲基化检测等。
Northern blot 流程图
Northern blot
优点：northern blot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于 它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化； 与定量PCR的高灵敏度相比，northern blot较高的特异性可以有效 的减少实验结果的假阳性。 缺点： Northern blot 实验中要防止RNA的降解，所有实验用品都需要经 过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时， northern blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人 体都有一定的伤害。
提取用试剂：Trizol reagent RNA提取注意事项：要注意RNase的污染，因RNA极易被RNase
的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止 手、唾液和空气中RNase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、 移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌 15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase，可以 不经处理直接用于提取RNA，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品 经常有RNase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃 器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）
反转录引物
反转录引物
注意事项：
1．防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 2. 避免gDNA的污染，用DNase处理。 3．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。 4．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参 有
GAPDH、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及
RPA基本程序：
待测RNA的分离
体外转录标记RNA探针
待测RNA与探针RNA进行液相杂交
mRNA分析技术
基因表达 基因
mRNA
蛋白质多肽链
基因表达的变化可以两个水平进行分析：mRNA 水平 和蛋白质水平 mRNA表达变化的检测方法：Northern blot, RTPCR(半定量PCR), Real-time PCR (定量PCR), 荧光原 位杂交等、基因芯片、高通量测序等 mRNA 表达变化的机制的研究方法方法有：启动子活性分 析（转录水平分析）、mRNA转录效率分析（Nuclear run on）、mRNA稳定性检测（转录后水平）
5.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6.引物5′端可以修饰。
7. 3′端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich 的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 8. 引物3′端要避开密码子的第3位。 9. 荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 10. 最好跨内含子。
一、RNA研究策略和方法
RT-PCR, Real-time PCR， Northern blot, RNA酶保护实验,
差异筛选，
基因芯片
（一）RNA的提取
Total RNA：rRNA约占80％-85％，tRNA和核内小分子 RNA约占10%-15%，mRNA约占1%-5%，琼脂糖凝胶电泳
中只能看到：28S，18S，5S。
RNA浓度和纯度检测 A260/A280 表示质量（一般在1.8-2.0），A260表示数量。 RNA完整度检测 28S RNA大小一般为5 kb，18S RNA 大小一般为2 kb。28S RNA 的亮度一般是18S 的两倍。
RNA琼脂糖凝胶电泳
（二）RT-PCR（半定量PCR）
RT-PCR相关试剂
Northern blot 的优势在于它可检测目的片段的大小、是否具有可变 剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的 处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用。
（五）核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA）
是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法 基本原理： 将标记的特异 RNA 探针（ 32P或生物素）与待测的 RNA样品液相杂交，标记的特异 RNA 探针与目的 RNA结合，形成双链 RNA，免受RNA酶的消化； 而未结合的单链 RNA经 RNA酶 A或 RNA 酶 T1 消化 形成寡核糖核酸。
A
B
RT PCR Real-time PCR
定量PCR引物设计软件：
Primer bank
www.ncbi.nlm.nih.gov
（四）Northern blot

将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继
而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和
用探针进行杂交检测。

Northern blot主要用于检测样品中是否含有基 因的转录产物（mRNA）及其含量。
各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 5. 稀释cDNA，内参循环数20-26。
6. 扩增产物长度300-500 bp。
（三）Real-time PCR 实时定量PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变 化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的 变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定 量分析。
Байду номын сангаас引物设计原则
在NCBI找到目的基因序列，以CDS区进行引物设计。
1.最好位于编码区5′端的300-400bp区域内，可以用DNAman,
Alignment 软件看看结果。 2.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 3.G+C含量在40%-60%之间，45-55％最佳。 4.引物自身不能有连续4个碱基的互补。