植物组织培养技术 植物脱毒快繁技术

2020/3/24
热处理广泛应用于葡萄、草莓、马铃薯和菊 花等植物。如：葡萄置于38 ℃可去除扇叶病毒。
热处理对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹 果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒 不起作用，因此，必须与茎尖培养相结合脱毒效 果更好。
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葡萄扇叶病毒
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2、培养基
一般以White、MS为基本培养基，提高钾盐 和铵盐含量有利于茎尖生长。MS培养某些植物茎 尖时，有些离子浓度过高应稀释。
在双子叶植物中，激素可能在第2对叶原基中 合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必 须加入生长素与细胞分裂素，浓度要合适。在生长 素中应避免用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜用 NAA或IBA；细胞分裂素用KT或BA；GA3对某些 植物茎尖培养有用。
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1、茎尖培养脱毒原理
病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株 部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染 的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm） 几乎不含或含病毒很少。
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分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管 系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连 丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖 细胞不断分裂和活跃的生长速度。
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三、脱毒快繁材料的选择
应注意以下几点： 1）品种要可靠 2）要选择经当地栽培确认的高产优质的品种来作
为脱毒材料 3）名贵的植物良种 4）植物生长旺盛期，再生率高，脱毒效果好
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四、植物病毒的鉴定
1、外观判断法
2、指示植物法 3、抗血清鉴定法 4、电子显微镜检查法 5、酶联免疫鉴定法(ELISA)
在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存 活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。 除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分 生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生 组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。
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（2）培养条件
在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果 好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时，光 照强度便增加到4000lx。
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鉴定方法：
抗原的制备 →→抗血清的采收，分离→→把 稀释的抗血清与未知的病毒植物的汁液在小试 管内混合→→根据沉淀反应来鉴定病毒种类。
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植物无病毒苗的培育
3. 特点：
特异性高（这种抗血清是高度专一性 的试剂），测定速度快，一般几小时甚至 几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植 物病毒鉴定中最有用的方法之一。
细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热 处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的 活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增 殖停止，而失去病毒的侵染能力。
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②热处理是一种物理效应，可加速植物细 胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋 白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁 殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细 胞的分裂，能够获得无病毒植株。
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小麦黄矮病毒病
草莓镶脉病毒
西瓜病毒病
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烟草普通花叶病
目前，对细菌和真菌侵染的病害，可通过药 物处理达到治愈的目的。但还没有治病毒的特效 药。种子一般不带病毒，种子繁殖可得无毒植株。 但对于无性繁殖植物，必须采取一些特殊方法脱 除病毒。2020/3/24 无病毒植株培育的意义0
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The Apical Meristem
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剥取茎尖过程: 解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当
一个半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀 片将带1-2个叶原基的分生组织切下，接到培养基上。
将接种的茎尖置于22℃左右温度下。 2000-3000lx 16h/d 光照下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能 进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。 微茎尖需数月才能成功。
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植物无病毒苗的培育
4、电子显微镜检查法
病毒有一定的形态（ 球状、杆状、线状等）
和大小（ 0.01~0.3um ）。
采用电子显微镜（分辨率0.0001um）可以直
接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒 的种类。
优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量测
定病毒。
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2、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。 因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺 盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占 优势，使病毒无法进行复制。
3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。 4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生 组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。
苹果花叶病毒
（二）茎尖培养脱毒
1、茎尖培养脱毒原理 2、培养基 3、茎尖培养方法 4、影响微茎尖培养的因素
①外植体大小 ②培养条件 ③外植体的生理状态
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植物的去病毒技术，实质上就是采取不含 病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.1～0.5mm 带1～2个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁 殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。
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茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器 官的培养相同。
茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代 稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最 重要的一个途径。
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4、影响微茎尖成活及脱毒的因素
（1）母体材料病毒侵染程度
被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。
（2）外植体大小
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兰花
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马铃薯
切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易成 活，过大又不能保证完全出去病毒，所以茎尖 大小要合适。
离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响
茎尖长（ 叶原基数 小植株数 脱毒植株 脱毒率（
ｍｍ）
数
％）
0.12
1
50
24
48
0.27
2
42
18
42.9
0.6
4
64
0
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二、脱毒方法 (一) 热处理脱毒
（一）发现： 1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证
明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可 去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病 毒病。
热处理又称温治疗法。
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• 1、热处理脱毒原理： ①病毒是DNA大分子，病毒进入植物
第七章 植物脱毒快繁技术
一、病毒危害
多数栽培植物，尤其无性繁殖植物，都易受 到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如， 草莓染60多种病毒。并且随着培养时间的推移， 侵染病毒的种类越来越多。
植物病毒病原体可通过维管束传导。因此， 对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后， 就会代代相传越趋严重。
受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大 幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。
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（四）其它途径脱毒
1、愈伤组织培养脱毒 2、茎尖微体嫁接 3、化学疗法脱毒
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1、愈伤组织培养脱毒
愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病 毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的 愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。
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愈伤组织的某些细胞不带病毒原因： 1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度； 2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。 愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可 能会产生变异植株。
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3、茎尖的培养方法
需要一台解剖镜（8-40倍）。 剥离茎尖要迅速并尽快接种，或在一个衬有 无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，以防茎尖变干。 茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严 密保护，只要仔细解剖，(无须表面消毒)就可得 到无菌的外植体。有时消毒处理会增加培养物的 污染率。
即：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只 须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽， 如香石竹、马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠表 面消毒10min。
1. 去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理 、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通 过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类， 提高产量、质量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果 树等得到广泛的应用。 2. 减少环境污染，有利于保护环境 栽培去病毒植物可减 少药剂的使用。
5、酶联免疫吸附测定法(ELISA)
把抗原-抗体的免疫反应于酶的催化反应相结合而发展 起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，发展最快 应用最广的方法。
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理由：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖 速度；② 有些细胞通过突变获得了抗病毒 的抗性。
缺点：植株遗传性不稳定，可能会产生变异 植株
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（二）茎尖微体嫁接
1. 概念：将无病毒茎尖（ 0.4~1.0mm ）嫁接在培养基上 培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。
2. 适宜：茎尖培养难以生根的植物，如桃、柑橘、苹果等 3. 无病毒茎尖来源：成年无病毒植物、温室培养的植物、
（3）外植体的生理状态
茎尖最好要由活跃生长的芽上切取。 取芽的时间也很重要，一般选萌动期较好。否则 采用适当的处理，打破休眠才能进行。
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（三）茎尖与热处理相结合方法
能克服单独茎尖培养时，茎尖过小成活率太低， 茎尖太大又脱除不掉病毒的缺点。 1、热处理后取较大茎尖培养获得脱毒苗。 2、取茎尖（或茎段）培养获得无菌苗。然后将试管 苗热处理，再取茎尖培养获得脱毒苗。