DNA提取液配方及步骤
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
裂解液配方:100mmol Tris-Hcl(PH8.0);
25mmol EDTA(PH 8.0);
500mmol NaCl;
1%SDS
母液配制:
1.500mmol Tris-Hcl(PH8.0)
称取15.1425g Tris,加入150ml 蒸馏水,加入Hcl调PH至8.0,定容至250ml。
2.100mmol EDTA或EDTA-Na2
称取7.3062g EDTA或8.455g EDTA-Na2,加入200ml 蒸馏水,调PH至8.0,定容至250ml。
3.5mol NaCl
称取29.22g NaCl,加入90ml 蒸馏水,定容至100ml。
4.10% SDS
称取10gSDS,加入100ml蒸馏水。
蛋白酶K配置:10mg/ml蛋白酶K溶液。
称取10mg蛋白酶K粉末,加入1ml蒸馏水溶解。-20度保存。
配制1000ml裂解液:加入溶液1体积为200ml,加入溶液2体积为250ml,加入溶液3体积为100ml,加入溶液4为100ml。配制500ml裂解液则相应减半。
步骤:
1.在1.5ml离心管中加入0.2ml(200ul)裂解液,用配套的研磨棒杵成浆状,加入2ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml,45度水浴2-4h。
2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml,水浴30min。
3.加入0.7ml苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),轻微颠倒混匀,14000rpm离心5min。
4.中号枪头切去头部,抽取上清,重复抽提一次。
5.取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),14000rpm离心5min。
6.取上清,加入2-2.5倍体积的无水乙醇,颠倒混匀,材料用量较多的昆虫可看到DNA沉淀,材料用量较少或酒精长时间浸泡着的标本可在-70度放置30min,14000rpm离心5min。
7.75%乙醇漂洗沉淀两次,无水乙醇漂洗,室温干燥。
8.根据沉淀量,加入30-50ulddH2O。
方法二:
1.在1.5ml离心管中加入0.1ml(100ul)裂解液,用配套的研磨棒杵成浆状,用400ul裂解液冲洗研磨棒,加入5ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml,45度水浴1-2h。
2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml,水浴15min。
3.加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),轻微颠倒混匀,14000rpm离心5min。
4.取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),14000rpm离心5min。
5.取上清,加入2-2.5倍体积的无水乙醇,14000rpm离心10min。
6.75%乙醇漂洗沉淀两次,无水乙醇漂洗,室温干燥。
7根据沉淀量,加入30-50ulddH2O。