DNA提取液配方及步骤

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裂解液配方:100mmol Tris-Hcl(PH8.0);

25mmol EDTA(PH 8.0);

500mmol NaCl;

1%SDS

母液配制:

1.500mmol Tris-Hcl(PH8.0)

称取15.1425g Tris,加入150ml 蒸馏水,加入Hcl调PH至8.0,定容至250ml。

2.100mmol EDTA或EDTA-Na2

称取7.3062g EDTA或8.455g EDTA-Na2,加入200ml 蒸馏水,调PH至8.0,定容至250ml。

3.5mol NaCl

称取29.22g NaCl,加入90ml 蒸馏水,定容至100ml。

4.10% SDS

称取10gSDS,加入100ml蒸馏水。

蛋白酶K配置:10mg/ml蛋白酶K溶液。

称取10mg蛋白酶K粉末,加入1ml蒸馏水溶解。-20度保存。

配制1000ml裂解液:加入溶液1体积为200ml,加入溶液2体积为250ml,加入溶液3体积为100ml,加入溶液4为100ml。配制500ml裂解液则相应减半。

步骤:

1.在1.5ml离心管中加入0.2ml(200ul)裂解液,用配套的研磨棒杵成浆状,加入2ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml,45度水浴2-4h。

2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml,水浴30min。

3.加入0.7ml苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),轻微颠倒混匀,14000rpm离心5min。

4.中号枪头切去头部,抽取上清,重复抽提一次。

5.取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),14000rpm离心5min。

6.取上清,加入2-2.5倍体积的无水乙醇,颠倒混匀,材料用量较多的昆虫可看到DNA沉淀,材料用量较少或酒精长时间浸泡着的标本可在-70度放置30min,14000rpm离心5min。

7.75%乙醇漂洗沉淀两次,无水乙醇漂洗,室温干燥。

8.根据沉淀量,加入30-50ulddH2O。

方法二:

1.在1.5ml离心管中加入0.1ml(100ul)裂解液,用配套的研磨棒杵成浆状,用400ul裂解液冲洗研磨棒,加入5ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K至终浓度100ug/ml,45度水浴1-2h。

2.加入RNaseA至终浓度20ug/ml,水浴15min。

3.加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),轻微颠倒混匀,14000rpm离心5min。

4.取上清,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),14000rpm离心5min。

5.取上清,加入2-2.5倍体积的无水乙醇,14000rpm离心10min。

6.75%乙醇漂洗沉淀两次,无水乙醇漂洗,室温干燥。

7根据沉淀量,加入30-50ulddH2O。

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