流感病毒的分离培养
流感病毒的鸡胚培养,收获及血凝效价测定实验报告
篇一：鸡胚培养法鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材spf鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380c---390c孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
流感病毒的分离鉴定(二)
流感病毒血凝试验
试管号 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃0.2 病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对 照 0.5%鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温60～90分钟 结果
实验材料
(1)接种流感病毒的鸡胚。 (2)质量分数为0．5％的鸡红细胞悬液。
(3)流感病毒型与亚型免疫血清。
(4)碘酒，酒精消毒棉球。 (5)灭菌的镊子、剪刀。 (6)无菌小试管，毛细滴管，吸管。 (7)生理盐水。
(8)试管、试管架。
实验方法：
1、血细胞凝集实验 (1)收获尿囊液：鸡胚孵育3d后,放4度冰箱过夜,次日 取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处 撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管
实验十 流感病毒的分离鉴定（二）
1、血细胞凝集实验 2、血细胞凝集抑制试验
目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。 原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠 等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待 检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象， 即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝 抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免 疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用， 借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。
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流感病毒分离技术2019.3.3
2020/7/7
鹤壁市疾控中心
MDCK细胞培养法
材料与试剂
2020/7/7
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2020/7/7
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液体配置
1 细胞培养液：500ml DMEM+1.25ml 8万单位庆大霉 素+5ml 双抗（10%）+10%胎牛血清（现用现加，细胞 传代时用）
2 洗液：500ml MEM+1.25ml 8万单位庆大霉素+5ml 双抗+TPCK胰酶 0.5ml（1%）
3 病毒应用液：500ml DMEM+1.25ml 8万单位庆大霉 素 +5ml 双 抗 +TPCK 胰 酶 0.5ml+牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5ml（25%）Fra bibliotek2020/7/7
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细胞传代
消 化 细 胞 用 3ml EDTA 胰 酶 洗 两 遍 ， 之 后 再 加 3ml EDTA胰酶放于37℃隔水式恒温培养箱3min后出现雾状倒 掉胰酶，继续放于37℃隔水式恒温培养箱，观察细胞至出现 透明点状后取出用手轻拍直至贴壁细胞完全脱落，用细胞培 养液吹打细胞培养瓶长有细胞的面，加细胞培养液至所需要 的 量 ， 分 装 ， 标 记 。 放 于 3 7 ℃ 隔 水 式 恒 温 培 养 箱 培 养 1824h
异常增殖有顿挫感染和病毒干扰现象，顿挫感染为病毒进入宿主 细胞后，细胞不能为病毒增殖提供所需要的酶、能量及必要的成分； 干扰现象为两种病毒感染同一细胞时，可发生一种病毒抑制，另一种 病毒增殖，这种现象可发生于同种、同型及同株之间。
样本因素
样本病毒含量，质量等。 （MDCK细胞培养法非100%分离病毒）
2020/7/7
流感病毒在MDCK细胞中分离与培养的影响因素
ｐ Ｈ值 上升 ，所 以病毒 培养 基一般 现配 现用 。
． ２ ． ３ ． ６ 细胞 培 养物 的收获 当 ７ ５ ％ ～１ ０ ０ ％ 细胞 出 果 不 能在 ２ ４ ｈ送 到 的需 要 放在 一７ ０℃ 冰箱 保 存 ，也 １ 现病 变 时进 行 收获 ，Ｃ Ｐ Ｅ（ 细胞 病 变 ） 出现 时 间与病 可 以暂 时 放在 ４ 冰箱 ２ ４ ｈ 。
ｍ ｌ 的胰 酶可明显提高 细胞增
通过对 ＭＤ Ｃ Ｋ细胞培养与增毒 的影 响因素分 析 ，明显 提高流感病毒分离 与增毒 的效价 。
文章编号 ：１ ０ ０ ３— ６ ２ ４ ５（ ２ ０ １ ４ ）０ ５— ０ ５ ８ ５— ０ ２
本研 究通 过各 不 同培 养条 件下 对 ＭＤ Ｃ Ｋ细胞 接 种 检 测到 滴度后 改 用 Ｔ ２ ５培 养瓶 加 ７ ｍ ｌ 维 持液增 毒 。
１ ． ２ ． ２ 样பைடு நூலகம்处理
样 品 及 时 送 到后 用无 菌镊 子 把 棉
毒 的型别 和毒株 的差 异 以及感 染 量 的大小 有 关 。收获
之前 可 以将 细 胞放 于 一 ７ ０ 冰 箱 冻融 １ ～２次 ，以提 高收 获标本 的病 毒滴 度 。即使 无 细胞 病变 也应 该 于接
血清 白蛋 白组 分 Ｖ；细 胞 生 长 液 ＭＥ Ｍ 加胎 牛血清 ，
是样 本后 吸 咐 １ ． ５ ｈ为 佳 ，过少 时 问 吸 咐不 完 全 ，过
终浓 度 １ ０ ％ ；青 、链 霉 素 母 液 ５ ｍ ｌ（ 终 浓度达 １ ０ ０ 长 时 间病 毒培 养 的 阳性率 降低 。 ． ２ ． ３ ． ５ 病 毒 培养基 在 Ｍ Ｅ Ｍ加 入 Ｈ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ 、胰酶 和 Ｕ ／ ｍ ｌ 青 霉 素 ，１ ０ ０ ｍ ｌ 链霉素） ，Ｈ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ缓 冲 液 １ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ的 作 用 是加 １ ２ ． ５ ｍ ｌ（ 终浓 度 ２ ５ ｍ １ ） ；病 毒 维 持 液 ＭＥ Ｍ加 Ｔ Ｐ Ｃ Ｋ 牛血 清 白蛋 白组 份 Ｖ配 制 而成 ，Ｈ 胰 酶 ，终浓 度 为 ０ ． ２ ｍｌ ，１ ０ ％ 牛血 清 白蛋 白组 强体 系 的缓 冲能力 ，胰 酶 的作 用是 将 病毒 粒 非裂 解 型
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
细胞培养技术分离流感病毒及分离条件的研究
［ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ．２ ０ １ ５ Ｓ ｅ ｐ ；１ ０ （ ９ ） ： ８ １ ２ —８ １ ５ ． ］
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎｆ ｌ ｕ ｅ ｎ ｚ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏ ｎｓ
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4 流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项
在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封；
将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。
感病毒对热很敏感 • 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，
采样日期 • 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。
24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下
血清学标本注意事项
• 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清塑料管里， 拧紧；
膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部
的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育
不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
流感病毒操作要求生物安全规程
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本
国家流感中心 张烨
标本种类
临床标本
鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等
血清标本
病人的急性期和恢复期血清双份血清
临床样本的选择
采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例
流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者， 而缺乏其它的实验室确定诊断依据
采集时间：病人发病后的头三天
RT-PCR 组成成分
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94 温 度 72 （℃）
流感诊断的金标准
流感诊断的金标准
流感即流行性感冒，诊断的金标准通常被认为是病毒分离培养。
这种方法可以直接从患者体内分离出流感病毒，是确诊流感的最可靠方法。
然而，由于病毒分离培养需要一定的时间和实验条件，因此在实际操作中，医生通常会结合患者的流行病学史、临床症状以及其他实验室检查结果进行综合判断。
流感诊断的金标准是通过实验室检测直接从患者体内分离并鉴定出流感病毒。
具体来说，包括以下几个步骤：
1. 病毒核酸检测：实时荧光定量PCR（RT-PCR）是目前临床最常用的流感病毒检测方法，它能直接检测到患者呼吸道分泌物（如鼻咽拭子、喉咙拭子或痰液样本）中流感病毒的核酸（RNA），从而确定是否感染了流感病毒。
2. 病毒分离培养：在特殊细胞上培养患者的呼吸道分泌物标本，并观察是否有病毒生长和特征性的细胞病变效应，然后进一步通过免疫学或分子生物学技术鉴定病毒种类。
3. 血清学检测：虽然不是即时诊断手段，但在疾病恢复期采集血清进行抗体检测，对比发病初期和恢复期双份血清中的抗流感病毒抗体滴度变化，若4倍以上升高则有助于回顾性诊断。
根据国家卫生健康委员会发布的流感诊断标准，结合病人的流行病学史（如近期接触史、疫区旅行史等）和临床表现（如突发高热、咳嗽、头痛、肌痛、乏力等症状），可以初步怀疑流感。
但最终确诊
通常依赖于上述实验室检查的结果。
特别是在流感流行季节或者发生流感样症状的群体中，实验室检测是必不可少的确诊环节。
总之，流感诊断的金标准是病毒分离培养，但在实际操作中，医生需要综合考虑患者的流行病学史、临床症状以及实验室检查结果进行综合判断。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）是一种影响犬科动物的呼吸道疾病，最初在2004年首次在美国佛罗里达州引起了大规模的流行。
犬流感病毒是一种单股正链RNA 病毒，属于流感病毒科。
近年来，犬流感病毒引起了广泛的关注，其对犬的健康和生产力造成了严重的影响。
本文旨在介绍犬流感病毒的分离鉴定方法以及对其部分基因序列的分析。
一、犬流感病毒的分离鉴定1. 样品收集与处理需要对可能感染犬流感病毒的样品进行收集。
常见的样品包括犬鼻拭子、犬气管、犬肺组织等呼吸道相关的样品。
收集后，需立即将样品置于离心管中，并添加适量的细菌保存液或生理盐水，迅速送至实验室进行分离处理。
2. 病毒分离常用的病毒分离方法包括细胞培养法、鸡胚培养法等。
在病毒分离过程中，需要使用对犬流感病毒具有敏感性的细胞株，例如MDCK细胞株。
将样品接种于细胞培养基质中并培养一定时间，观察细胞情况，如发现病毒感染，可进一步进行鉴定。
3. 病毒鉴定在病毒分离后，需对分离的病毒进行鉴定。
目前常用的鉴定方法包括免疫荧光检测、PCR扩增等。
通过对病毒的免疫学特性和基因组结构进行分析，可以准确鉴定犬流感病毒，并进一步进行部分基因序列分析。
二、犬流感病毒部分基因序列分析1. 基因提取与扩增通过PCR扩增技术，可以对犬流感病毒的部分基因进行提取和扩增。
常用的基因包括HA（血凝素）、NA（神经氨酸酶）等。
通过PCR扩增后，可以得到病毒基因的DNA序列，为后续分析提供基础数据。
2. 基因测序将PCR扩增后的基因片段进行测序分析，可以得到该基因片段的具体序列信息。
通过比对数据库中已有的犬流感病毒基因序列，可以快速准确地确认所得基因序列的相关性，为病毒的分子鉴定提供重要依据。
对犬流感病毒基因序列进行分析，可以了解其遗传多样性、变异情况等重要信息。
通过比对分析，可以揭示不同病毒株之间的遗传关系、演化轨迹等。
基因序列分析还可以为疫苗研发、药物设计等提供重要参考。
流感病毒的分离技术操作规范
流感病毒的分离技术操作规范病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK 细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（一）实验室生物安全级别和生物安全规定1. 流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2. 流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1. 试验材料（1）刚75-90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（SIGMA T8802）（3）HEPES缓冲液,1M母液（4）D-MEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's 液（5）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素)（6）牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15260）（7）处理好的临床标本0.5mL（标本处理参见附件1第一部分）（8）无菌移液管：1mL和10mL2. 培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1）500mLD-MEM液中加入：a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达：100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)b) 牛血清白蛋白组分V12.5mL(终浓度:0.25％)c) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2）病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/mL。
病毒的分离与鉴定
(5)每日在灯下检视鸡
胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
实验材料 (1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
鸡胚尿囊腔接种法
实验材料： (1)来亨鸡受精卵、卵架、检卵灯。 (2)碘酒、酒精消毒棉球。 (3)灭菌的手术刀、镊子、剪刀。 (4)1ml注射器及针头。 (5)病毒液:流感病毒、新城鸡瘟病毒。 (6)无菌胶布。
分离鉴定程序 病人急性期咽喉含漱液 (经双抗处理) 鸡胚培养(羊水囊或尿囊腔) 35℃ ，72h 收获：取羊水或尿囊液作血凝试验 (+) ( —) 作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为 阴性时报告阴性
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml.
(4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒. 实验结果:
接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室
界线,于胚胎附近无大
血管处画出标记作为
注射入口.
(2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀 尖在标记处打一小孔.
实验方法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育.
用鸡胚和MDCK细胞分离流感病毒的实验研究
细胞培养 法分离流感 病毒 ３ ５株． 分离率 为 ７ 鸡胚 ％：
双腔培养法分离流感 病毒 １ ２株． 分离率为 ２４ ％。共 ３ ５株病毒 株， 其中 型 ｌ ５株 ， Ｓ型 ２ Ｏ株。结论 离 中， 细胞培养法 比鸡胚培养法 敏感 ． 同时用两种方法培养 ， 可明显提 高流感病毒分病率。 关键词 ： 流感病毒分离 中图分类号 ： ５ １ ７ Ｒ １ 细胞培养 鸡胚接和
５ ８ ２ ． ｎ １ ０ ０ Ｃ ｉ ａ）
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流 感 是 至 今 尚无 法 完 全 加 控 制 的一 种 非 常 重 要 的病 毒 性 急 性 呼 吸 道 传 染病 ． 时 也 是 国际 上 第 一 个 实 现 全 球 监 测 同
流感亚单位疫苗的制备流程
流感亚单位疫苗的制备流程1.病毒分离：首先，需要从流感病人的咽喉或鼻咽部样本中分离出感染的流感病毒株。
这个步骤通常通过将样本接种到细胞培养物中来实现，然后经过培养和观察，分离出纯种的流感病毒。
2.增殖：经过病毒分离得到的流感病毒株被接种到特定的细胞株中进行增殖。
这些细胞通常是鸡胚细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞等。
流感病毒在细胞中进行繁殖，经过一定的时间后，细胞会膨胀并释放出足够数量的病毒颗粒。
3.病毒纯化：病毒培养液经过离心和过滤等工序，将其中的病毒颗粒从其他杂质（如细胞碎片、蛋白质等）中纯化出来。
这可以通过差速离心、密度梯度离心等技术来实现。
4.病毒毒力灭活：为了保证疫苗的安全性，从纯化的病毒颗粒中，需要将病毒灭活。
这可以通过化学物质（如醚、酚等）或物理因素（如加热、辐照等）来实现。
灭活后的病毒仍然具有免疫原性，但无法复制和引发感染。
5.提取病毒表面蛋白：病毒颗粒中的表面蛋白被提取出来，这些蛋白是诱导免疫反应所必需的。
一种常用的方法是使用洗脱剂（如去洗脱剂等）来破坏病毒颗粒并释放蛋白质。
6.病毒表面蛋白纯化：提取出的病毒表面蛋白含有其他蛋白质和杂质，需要进行纯化。
纯化过程中，可以使用凝胶电泳、层析色谱、超滤等技术来除去杂质。
7.疫苗制剂的添加：病毒表面蛋白纯化后，需要将其添加到其他成分中，形成最终的疫苗制剂。
这些成分通常包括辅助剂如氢氧化铝、防腐剂等，以增强免疫反应的效果。
8.疫苗灭活性能检测：各个生产批次的疫苗需要进行灭活性能测试，以确保灭活的病毒表面蛋白对免疫系统具有充分的免疫原性，但不会引起实际的感染。
9.疫苗安全性和有效性评估：经过灭活处理的流感亚单位疫苗需要进行安全性和有效性评估。
这一过程包括动物试验和人体临床试验，以验证疫苗对流感病毒的保护效果和免疫反应的安全性。
10.批准上市：经过所有的安全性和有效性评估，并符合相关法规标准的流感亚单位疫苗，可以向相关监管机构申请上市批准。
总结起来，流感亚单位疫苗的制备流程包括：病毒分离、增殖、病毒纯化、病毒毒力灭活、提取病毒表面蛋白、病毒表面蛋白纯化、疫苗制剂的添加、疫苗灭活性能检测、疫苗安全性和有效性评估，以及批准上市等步骤。
流感病毒的分离培养与鉴定
流感病毒的分离培养与鉴定一．实验目的1.掌握临床呼吸道病毒感染标本的采集、处理及送检原则。
2.掌握病毒滴度测定—红细胞凝集试验原理。
3.熟悉流感病毒的分离培养---鸡胚尿囊腔接种技术。
4.熟悉鸡胚尿囊液收集方法；红细胞凝集试验操作方法、结果观察及病毒滴度判定。
二．实验原理1.病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一,流感监测最主要的目的为:及时发现并抓住有意义的流感病毒新变种,尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报，因此,在流感诊断中任何方法都不能完全替代病毒分离这一方法，通常多用鸡胚来分离流感病毒。
2.3.血球凝集试验原理：某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集多种哺乳类动物和鸟类的红细胞,出现红细胞凝集现象，简称血凝现象。
这是由于流感病毒表面的血凝素是糖蛋白成分，红细胞表面有糖蛋白的受体,流感病毒血凝素结合在红细胞表面的糖蛋白受体上,从而发生红细胞凝集。
三．实验步骤1.标本采集→杀灭杂菌→接种→鉴定病毒类型2.培养：(1)取孵育10~12d鸡胚,在检卵灯下画出气室界线,于胚胎附近无大血管处画出标记作为注射入口。
(2)将卵置于卵架上,消毒标记处,用无菌剪刀尖在标记处打一小孔。
(3用灭菌注射器吸取流感病毒液0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射。
(4)注射后,用无菌胶布封孔,置35度温箱孵育。
(5)每日在灯下检视鸡胚情况(若鸡胚在接种后24h内死亡为非特异性死亡,应弃之)。
3.鉴定：(1)取小试管9支（或采用塑料凹孔板）,于第一管加入生理盐水0.9毫升,其余各管均加入0.25毫升。
(2)于第一管注入羊水或尿囊液0.1毫升，充分混匀,吸出0.75毫升,于第二管注入0.25毫升,其余0.25毫升弃入消毒液中(切不可乱弃）。
从第2管起对倍稀释至第8管。
(3)各管加入0.5%鸡RBC 0. 25m1，摇匀后室温静置60分钟。
30分、45分、60分各观察结果一次,以阴性对照红细胞沉积结果为准。
流感病毒细胞分离培养
2、MDCK细胞传代
• （1）先把需用的Eagle’s和Versene放37℃水浴预温， 其它试剂不得放入。 • （ 2 ） 已 成 片 的 MDCK 细 胞 ， 将 其 生 长 液 倒 掉 。 用 Versene洗2遍。 • （3）把Versene与0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。 • （4）置37℃恒温箱5—10min，当细胞变圆，细胞与 细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成 片，表明消化时间未到。 • （5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37℃ 2’–3’， 取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的生长液， 稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3 天需传一代。
（一）MDCK细胞分离流感病毒 MDCK细胞分离流感病毒 细胞分离
1、实验材料：
• MDCK细胞（最好是早代的） • Eagle氏培养液（日本产的含谷氨酰胺 的以抽滤为好） • Hank氏溶液 • 0.25%胰酶和Versene消化液 • 双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真 菌素 • 胎牛或小牛血清 • 5.6%或7.5%的NaHCO3.
2012-4-17 7
• （5）无菌条件：细胞培养的关键之一是要有无菌概 无菌条件： 念，要防止污染。在细胞培养中，可能发生污染的来 源很多，有组织培养液、器皿、组织本身、工作者本 身、空气等。因此要对培养液、器皿用具、操作室进 行彻底消毒，在操作时要严格实行无菌操作。 • （6） 培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对 培养器皿的处理： 于细胞的贴壁生长影响很大。常用的器皿主要有玻璃 及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡过夜、 清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。塑料板 一般用2%NaOH浸泡1小时后，清水洗净再用1N HCl 浸泡1小时，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37℃干燥 后，紫外线照射消毒。
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适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做 病毒分离 • 2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型） • 3、HEPES缓冲液，1M母液 • 4、D-MEM培养基，Hank's液 • 5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G； 10000µg/mL硫酸链霉素
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• (5)将针头弃于合适的生物安全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床
采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。
• 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：
0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：
25mM）
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• （2）病毒生长液
• 每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶 的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细 胞分离步骤：
二、流感病毒分离之鸡胚培养法 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块
• 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
膜与鸡胚
• 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发
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一、流感病毒MDCK细胞分离方法
• （一）生物安全要求 • H5,H7亚型致病性禽流感病毒，H2N2亚
型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安 全级别：BSL-3。实验操作人员需进行 BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护 SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒， H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作 必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
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• 6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 • 7、临床样品0.5mL • 8、1mL无菌移液管 • 9、10mL无菌移液管 • 10、15mL无菌离心管
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• （三）实验步骤 • 1、准备病毒生长液 • （1）细胞维持液准备 • 500mL D-MEM液中加入 • ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达：
“—”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。
中移出。 • ②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，
温和摇动数次。 • ③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。 • ④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液
分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养 瓶中。 • ⑤放置于33～35℃培养箱培养。 • ⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀 圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落）。 •
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+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小
圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。
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• （3）细胞培养物的收获
• 当75%～100%细胞出现病变时进行收获， 收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融 1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即 使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。 收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次， 然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于 15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病 毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃ 冰箱待以后试验使用。
育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
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• （二）、接种样本
• 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。
• （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。
• (3)用注射器吸800µl标本。
• (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2 个鸡胚。
• （1）75％～90％成片细胞的准备，以选取 T25细胞瓶为例。
• ①用40×物镜观察细胞生长状态。
• ②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移 液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
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• （2）细胞培养瓶的接种 • ①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• 其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物 安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行 BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护 SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操 作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进 行。
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