流感病毒的分离培养

二、流感病毒分离之鸡胚培养法 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块
• 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
膜与鸡胚
• 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发
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• 6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 • 7、临床样品0.5mL • 8、1mL无菌移液管 • 9、10mL无菌移液管 • 10、15mL无菌离心管
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• （三）实验步骤 • 1、准备病毒生长液 • （1）细胞维持液准备 • 500mL D-MEM液中加入 • ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达：
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• （3）细胞培养物的收获
• 当75%～100%细胞出现病变时进行收获， 收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融 1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即 使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。 收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次， 然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于 15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病 毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃ 冰箱待以后试验使用。
• （二）材料 • 1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合
适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做 病毒分离 • 2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型） • 3、HEPES缓冲液，1M母液 • 4、D-MEM培养基，Hank's液 • 5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G； 10000µg/mL硫酸链霉素
育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
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• （二）、接种样本
• 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。
• （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。
• (3)用注射器吸800µl标本。
• (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2 个鸡胚。
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+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小
圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。
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一、流感病毒MDCK细胞分离方法
• （一）生物安全要求 • H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，Biblioteka Baidu2N2亚
型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安 全级别：BSL-3。实验操作人员需进行 BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护 SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒， H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作 必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：
0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：
25mM）
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• （2）病毒生长液
• 每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶 的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细 胞分离步骤：
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• 其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物 安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行 BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护 SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操 作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进 行。
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“—”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。
• （1）75％～90％成片细胞的准备，以选取 T25细胞瓶为例。
• ①用40×物镜观察细胞生长状态。
• ②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移 液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
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• （2）细胞培养瓶的接种 • ①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶
中移出。 • ②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，
温和摇动数次。 • ③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。 • ④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液
分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养 瓶中。 • ⑤放置于33～35℃培养箱培养。 • ⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀 圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落）。 •
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• (5)将针头弃于合适的生物安全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床
采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。
• 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去