基因结构分析的基本策略.ppt
微生物基因组学 ppt课件
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六、研究基因组功能的意义 1． 加速致病基因的研究 2． 寻找灵敏而特异性的病原分子标记 病原微生物的特异性DNA序列可以作为分子标记用于疾病的诊断。 3． 促进新药的发现和疫苗的发展 （1）促进新药的发现 （2）疫苗的研究 4． 促进微生物分类的发展
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5. 提高对人类相关基因功能的认识
（1）一些人类的遗传性疾病，如结肠癌、肝豆状核变性、肾上腺脑白质 营养不良等，在细菌的基因组分析中，也存在类似的蛋白物。
（2）可以利用微生物做模拟，去检测高等生物的基因性状和功能。 （3）从基因水平去揭发人类疾病与病原微生物之间关系，如发病机理， 人类与病原微生物之间相互作用的基因机理等。
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三．微生物基因组的注释 （一）概念：在微生物基因测序的基础上，对其基本 结构和部件进行认定，以进一步研究其功能。
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（二）微生物基因组注释的内容 1.碱基组成分析，即G+C Mol%测定。 G+C含量是物种的一个重要特征，在微生物的分类上具有重要意义，是 重要参数之一。 2．开放阅读框的鉴定： 3．编码序列分析
消化 （4）分子杂交 （5）Southern十字杂交法
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五、微生物基因组功能分析 1、根据目的基因组的性状而推测可能的基因组功能。 如致病岛的G+C mol%与细菌本身的G+C mol%有很大差异。致病岛或耐 药岛等。 2、根据已知的数据库进行同源性搜索。 美国NIH的GenBank；欧洲的分子生物学实验数据库（FMBL）日本的 DNA数据库(DDBJ) 3、利用不同条件、不同作用因素的影响而鉴定未知基因的功能。 如用过氧化氢酶处理沙门氏菌而获得该菌的对H2O2氧化应激反应的基因。 4、采用基因敲除的方法来推测或确定基因的功能。
基因组学
基因表达调控的研究
蛋白质组学（proteomics） • 鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和 相互作用方式
2 基因组图谱的构建
基因组计划的主 要任务是获得全 基因组序列 但是，现在的测 序方法每次只能 测800～1000bp 小基因组物种常 用鸟枪射击法
（restriction fragment length polymorphism，RFLP）
如有两个 DNA 分子（一对染色体），一 个具有某一种酶的酶切位点，而另一个 没有这个位点，酶切后形成的DNA片段长 度就有差异，即多态性。
• 利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小 不等、数量不同的分子片段， • 经电泳分离， • 通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜 (尼 龙膜或硝酸纤维素膜)上， • 然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高 辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片 段进行杂交。 • 不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得 RFLP谱带表现出不同程度的多态性.
中英联合实验室
双脱氧终止法测序反应体系包括：
DNA polymerase
Template:(单链DNA模板)
Primer:（带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物)
Mg2+ dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)
DNA自动测序
形态标记
能够用肉眼识别和观察、明确显示遗传多样性 的外观性状。 形态性状：株高、颜色、白化症等 又称表型标记 简单直观 数量少 很多突变是致死的 受环境、生育期等因素的影响
基因诊断原课件-精品文档
基因诊断
基因诊断的目的：
就是要通过各种手段，如杂交、扩增等，去寻找和发现这些 独特基因组、基因或基因片段的存在，从而证实某种病原体的存 在。
传统诊断与基因诊断的比较：
传统诊断的缺陷多，方法大多为：
1、表型诊断：以疾病或病原体的表型为依据。而表型的改变 在多数情况下是非特异的，出现的时间也比较晚，易错过治疗的 最佳时期。某些疾病本身不呈现显著的表型改变，用传统的检测 方法亦出现假阴性。
基因诊断
根据诊断目的或要求
分为定性诊断Biblioteka 定量诊断和半定量诊断,以及序列分析等。
二，基因诊断的策略
1， 从基因产物入手
这是一种比较早期的诊断策略。首先分析异常基因的产物 （蛋白质），并弄清是如何引起临床症状的。在纯化了该蛋白质 以后，进行氨基酸序列测定,据此合成致 疾病的分子缺陷。这种策略是由蛋白质至DNA，由表型至基因型。 迄今分离的绝大部分分子病和遗传性代谢缺陷病如白化病,苯丙酮 尿症(PKU)和镰状细胞贫血等的相关基因都是根据这一策略分离 的。
1、杂交Southern印迹用于检测DNA;Northern印 迹用于检测RNA;斑点印迹或称斑点杂交 ,既可检测 DNA也可检测RNA。
2、PCR法主要用为直接扩增DNA，但是通过逆转 录技术,可以将RNA先转变为cDNA再行扩增，称逆 转录PCR,如检测HCV，HGV，HIV等。
3、原位杂交,或原位PCR,也可分DNA或RNA原位 杂交和原位PCR或逆转录PCR。
基因诊断
根据待测标本的性质
分析体中的(血，尿，粪，痰液,胸腹水等等),细胞和组织 基因检测。
1、体液中的待测基因可在将标本适当处理后,根据需要 采用上述各种方法检测
2、组织切片内基因检测则可采用原位杂交和原位PCR法
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
基因功能分析的基本策略
2、双链干涉RNA的合成； 化学合成法；体外转录法
3、双链干涉RNA对目标RNA的干涉： 首先，将干涉RNA转染到靶细胞； 其次，是对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-
PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上 进行监测
RT-PCR Western blot
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用：
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
转基因技术存在的问题
1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特 定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基 因组功能； 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同， 可能出现不同表现型； 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的 不稳定遗传。
二、稳定转染细胞
稳定转染细胞是一种最常用的细胞水平的转基因模 型，外源基因通过转基因过程插入到细胞染色体中，使 外源基因可以作为细胞染色体的一部分得以在细胞中稳 定表达。
RNA干涉的机制：
在植物、动物和人的细胞内存在着无活性或低活性的被 称为Dicer的由核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合体。 当细胞内出现异常双链RNA时，如病毒RNA，可以激活 Dicer，被激活的Dicer识别并将其切割成短的双链RNA， 同时生成的短的双链RNA又可以进一步激活Dicer，并 与之结合，形成的复合物称为RNA诱导的沉默复合物。 该复合物通过Dicer中的解旋酶将短的双链RNA变成互 补单链RNA，此单链RNA即可识别并结合到细胞内与其 互补的靶RNA分子上，并通过Dicer中的核酸内切酶将 靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被认为是机 体的一种防御机制。
基因组作图ppt课件
➢ 遗传标记可用于连锁分析、基因定位、遗传作图、基因转 移、辅助选择育种等；
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形态标记 (morphological markers)
细胞学标记 (cytological markers)
➢ 用具染色体变异的材料与正常材料杂交，特定染色体上的 基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可测 定基因所在染色体及其位置；
➢ 克服了形态标记易受环境影响的缺点，但标记材料的产生 需大量的人力物力进行培养选择；
➢ 有些物种对染色体变异的耐受性差，难以获得相应的标19 记 材料。
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➢ 形态标记简单直观、经济方便， 容易观察记载。
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形态标记的不足
➢ 可以观察到的标记非常有限，难以建立饱和的遗传图谱； ➢ 许多形态标记受环境、生育期等因素的影响； ➢ 复等位基因位点很难全部鉴定、标记出来。
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2.1.2 细胞学标记
➢ 指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构和 数量特征是常见的细胞学标记；
20世纪80年代后期,人们开始应用微卫星序列(microsatellite,MS)绘制图谱。1994
年底，美、法完成了以RFLP及微卫星ＤＮＡ为标志的遗传图谱.图谱包含了
5826位点，覆盖4000cM，分辨率高达0.7cM．1996年法国报道了完全以微卫星
DNA标志构建的遗传连锁图，包含2335位点，分辩率为1.6cM
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RFLP标记的特征
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➢ 同一亲本及其子代相同位点上的多态性不变；
遗传学(全套课件752P)ppt课件
遗传学(全套课件752P)ppt课件目录•遗传学基本概念与原理•基因突变与修复•基因重组与染色体变异•遗传规律与遗传图谱分析•分子遗传学技术与应用•细胞遗传学技术与应用CONTENTSCHAPTER01遗传学基本概念与原理遗传学定义及研究领域遗传学定义研究生物遗传信息传递、表达和调控的科学。
研究领域包括基因结构、功能、表达调控，基因突变、重组、进化，以及遗传与发育、免疫、疾病等方面的关系。
遗传物质基础：DNA与RNADNA脱氧核糖核酸，是生物体主要的遗传物质，由碱基、磷酸和脱氧核糖组成。
RNA核糖核酸，在蛋白质合成过程中起重要作用，由碱基、磷酸和核糖组成。
遗传信息传递过程DNA复制在细胞分裂间期进行，以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程。
转录以DNA为模板合成RNA的过程，发生在细胞核或细胞质中。
翻译以mRNA为模板合成蛋白质的过程，发生在细胞质中的核糖体上。
基因表达调控机制基因表达基因携带的遗传信息通过转录、翻译等过程转变为具有生物活性的蛋白质分子的过程。
调控机制包括转录水平调控（如转录因子、启动子等）、转录后水平调控（如RNA剪接、修饰等）和翻译水平调控（如蛋白质磷酸化、去磷酸化等）。
这些调控机制使得生物体能够适应不同的环境条件并维持正常的生理功能。
CHAPTER02基因突变与修复点突变包括碱基替换、插入和缺失。
染色体畸变包括染色体结构变异和数目变异。
03生物因素如某些病毒和细菌。
01物理因素如紫外线、X 射线等。
02化学因素如亚硝酸、碱基类似物等。
直接修复切除修复重组修复SOS 修复DNA 损伤修复机制01020304针对某些特定类型的DNA 损伤，通过特定的酶直接进行修复。
通过核酸内切酶将损伤部位切除，再利用DNA 聚合酶和连接酶进行修复。
在复制过程中，当遇到无法直接修复的DNA 损伤时，可通过重组机制进行修复。
当DNA 受到严重损伤时，细胞会启动SOS 修复机制，通过易错复制方式快速完成复制过程。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
功能基因组学及其研究方法ppt课件
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基因组学包括2-3个亚领域
亚领域
内容
结构基因组学 整个基因组的遗传制图、物理 制图、DNA测序；
功能基因组学 认识、分析整个基因组所包含 的基因、非基因序列及其功能；
蛋白质组学 研究细胞内蛋白质的组成及其活 动规律。
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结构基因组学
结构基因组学
结构基因组学，顾名思义，就是研究生物基因组 结构的科学。它是基因组研究的第一阶段的工作， 建立功能基因组学的基础。其主要目标是绘制生 物的遗传图（genetic map）、物理图（physical map）、转录图（transcript map）和序列图 （sequence map）。
专用技术: 1，SAGE分析 2，生物芯片技术(基因芯片，细胞芯片，组织
芯片) 3，其它
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Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) 用于定量地、平行地分析大量的转录本。若要知道一
☺同源分析和检索，包括DNA数据库、 EST数据库、STS数据库、Unigene数 据库、Swissprot数据库等。
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蛋白质的数据分析 蛋白质一级结构分析：
结构特点分析，包括等电点、信号肽、穿膜 区、DNA结合序列等同源分析和检索，包括Nr数 据库、Swissprot 数据库等功能区分析，包括 Prosite、Emotif、Identify分析等。
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根据序列分析搜寻基因
☺ 查找开放阅读框（open reading frame, ORF） ☺ 开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还要有
遗传学幻灯ppt课件
包括基因结构、功能、表达调控， 以及生物遗传变异、进化等方面。
遗传物质基础：DNA与RNA
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DNA
RNA
脱氧核糖核酸，是生物体主要的遗传物质， 存在于细胞核中。
核糖核酸，在蛋白质合成过程中起重要作 用，存在于细胞质中。
DNA与RNA的关系
DNA通过转录过程合成RNA，RNA再指 导蛋白质的合成。
染色体的形态结构
包括着丝粒、端粒、次缢 痕等结构，不同物种的染 色体形态各异。
染色体的功能
在细胞分裂过程中，染色 体通过复制、分离和重组 等过程，确保遗传信息的 准确传递。
染色体数目变异及意义
染色体数目变异类型
染色体数目变异的意义
包括整倍体和非整倍体变异，如单体、 三体、多倍体等。
对生物进化、物种形成和遗传育种等 方面有重要意义。
染色体数目变异的原因
可能是由于细胞分裂异常、基因突变 或环境因素等导致。
性别决定与性染色体遗传
性别决定机制
生物体内存在性别决定基 因，通过不同机制控制性 别分化。
性染色体类型
包括XY型和ZW型两种类 型，不同生物采用不同的 性染色体类型。
性染色体遗传规律
性染色体上的基因遵循特 定的遗传规律，如分离定 律和自由组合定律等。
详细介绍多基因风险评分（PRS）等风险预测模型的原理和应用。
实际应用举例
通过具体实例，如糖尿病、高血压等，展示如何利用风险预测模型 进行多基因遗传病的风险评估和预防。
染色体异常导致疾病诊断治疗
染色体异常概述
简要介绍染色体异常的概念、类型和常见疾病。
诊断方法
详细介绍染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）等染色体异常的 诊断方法。
第7章基因治疗精品PPT课件
1、内源基因的变异 2、外来生物的入侵
基因致病
基因结构的异常 基因表达的异常
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基因诊断常用技术
• 核酸分子杂交： • PCR： • 生物芯片： DNA芯片或基因芯片 • 基因测序：
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血友病A基因诊断
• 病因：factor VIII 基因缺陷 （碱基取代、缺失或插入等）， 使凝血因子VIII 无活性或不 稳定，导致凝血障碍。
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基因治疗的两种途径
ex vivo
靶细胞
载体 目的基因
in vivo
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基因治疗的总体策略
1、基因矫正（修正）（gene correction）：未实现 2、基因置换 （gene replacement）： 3、基因修饰（增补）（gene augmentation）： 4 、基因激活（gene activation）： 5 、基因失活（干预）（gene interference ）：反
细胞生长分裂
10天 Gene表达
IL-2刺激C分裂
回输患儿体内
1~2月治疗一次, 10个月 患儿体内ADA水平达正常人的25%
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基因治疗基本过程 例2
• 逆转录病毒载体 +FⅨcDNA
重组体
5` LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3`
①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达；
②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养） →FⅨ表达；
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7.2 基因治疗的载体
7.2.1 逆转录病毒载体 7.2.2 腺病毒载体 7.2.4 单纯疱疹病毒
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7.2.1 逆转录病毒载体
• 正链RNA病毒
• 5’ gag- pol-
env 3’
基因家族分析套路
近年来，测序价格的下降，导致越来越多的基因组完成了测序，在数据库中形成了大量的可用资源。
如何利用这些资源呢？今天小编带你认识一下不测序也能发文章的思路--全基因组基因家族成员鉴定与分析（现在这一领域可是很热奥）；一、基本分析内容⏹数据库检索与成员鉴定⏹进化树构建⏹保守domain和motif分析.⏹基因结构分析.⏹转录组或荧光定量表达分析.二、数据库检索与成员鉴定1、数据库检索1）首先了解数据库用法，学会下载你要分析物种的基因组相关数据。
一般也就是下面这些数据库了⏹Brachypodiumdb:⏹⏹Rice Genome Annotation Project ：.⏹⏹⏹2）已鉴定的家族成员获取。
如何获得其他物种已发表某个基因家族的所有成员呢，最简单的就是下载该物种蛋白序列文件（可以从上述数据库中下载），然后按照文章中的ID，找到对应成员。
对于没有全基因组鉴定的，可以下列数据库中找：a. NCBI: nucleotide and protein db.2、比对工具。
一般使用blast和hmmer，具体使用命令如下：⏹Local BLASTformatdb–i db.fas–p F/T；blastall–p blastp(orelse) –i known.fas–d db.fas–m 8 –b 2(or else) e 1e-5 –o alignresult .txt.-b:output two different members in subject sequences (db).⏹Hmmer (hidden Markov Model) search. Thesame as PSI-BLAST in function. It has a higher sensitivity, but the speed islower.Command:3、过滤。
⏹Identity: 至少50%.⏹Cover region: 也要超过50%或者蛋白结构域的长度.⏹⏹EST 支持⏹ Blast and Hmmer同时检测到4、通过上述操作获得某家族的所有成员基因家族分析套路（二）本次主要讲解在基因家族分析类文章中，进化部分分析的内容。
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2019-11-3
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第一节
基因序列结构的生物信息学 检索和比对分析
2019-11-3
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•基因或DNA序列比对
•就是在数据库中对基因序列或DNA序列进行
比对分析，以其能够推测出其结构、功能及在
进化上的联系.
直接的数量关系
•比对方法：
序列比对目的：
1. 双重比对
•判断两个或多个序列间是
•而FASTA Report格式仅包括检出序列的简要特征描述。
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例如：人EPO基因序列检索
•输入关键词，选择合适的程序
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•向下拉寻找符合目标的条目
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•点击此条打开连接
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第二十五章
基因结构分析的基本 策略
Basic strategy for analyzing gene structure
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主要内容： 第一节 基因序列结构的生物信息学检索和比对
分析 第二节 基因转录起始点的鉴定 第三节 启动子的结构及功能分析 第四节 编码序列结构分析
•NCBI 已 经 将 结 构 数 据 交 叉 链 接 到 书 目 信 息 、 序 列 数 据 库 和 NCBI的Taxonomy中运用NCBI的3D结构浏览器和Cn3D，可 以很容易地从Entrez获得分子的分子结构间相互作用的图像
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(4) Taxonomy
•即生物学门类数据库，可以按生物学门类进行检 索或浏览其核苷酸序列、蛋白质序列、结构等
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点击核酸序列blast，在框内输入序列：
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பைடு நூலகம்
选择搜索条件：
2019-11-3
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选择特殊程序：
2019-11-3
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比较两个序列之间的相似性：
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以上仅简介了NCBI相关数据库及工具软 件关于其他数据库及软件工具等信息见书中 第二十五章表1-5。
•三个组织每天交换各自数据库中的新增序列 实现数据共享
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(2) Genome
•即基因组数据库，提供了多种基因组、完全染 色体、重叠序列图谱以及一体化基因物理图谱
(3) Structures
•即结构数据库或称分子模型数据库(MMDB)， 包含来自X线晶体学和三维结构的实验数据
(5) PopSet
•包含研究一个人群、一个种系发生或描述人群 变化的一组组联合序列 •PopSet既包含了核酸序列数据又包含了蛋白质 序列数据
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(7) 文献数据库
•PubMed：生物医药科学的检索系统 •OMIM：孟德尔遗传学数据库是人类基因和基 因疾病的目录数据库
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-3 +1 +5 ATG Initiator 谢谢你的关注 Py2CAPy5
+20
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目录
二、基因转录起始点的序列分析
思考： •转录起始点 (TSS)位于基因编码序列的5端 •基因编码区是指能体现在多肽链中的核苷酸 序列 •多肽链是以mRNA为模板经翻译合成的
•主要有两种方法：
•5 ′端连续分析基因表达（5 ′ -end serial analysis of gene expression, 5 ′ SAGE）
•帽分析基因表达（cap analysis gene expression, CAGE）
2019-11-3
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(1) 5 ′ SAGE
PCR产物
随机引物
以5’-RACE引物和5’端甩尾的基因 特异性反向引物进行巢氏PCR
5-RACE adaptor
以5’-RACE发光标记引物对PCR混 合物直接进行一次性测序
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分析基谢因谢你转的录关起注始点
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目录
3.连续分析基因转录起始点
•在RACE的基础上，通过在转录本5 ′端引入一 个特殊的II型限制性核酸内切酶识别位点，实 现了基因5 ′端短片段串联连接产物一次测序分 析多个基因转录起始点的目的
2. 多序列比对
否具有足够的相似性 从而判断二者之间是否具
有同源性
2019-11-3 进化上曾具有共同祖先谢谢你的关注
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目录
序列比对的结果：
•取代 •插入 •缺失
保守序列： •可能是共同进化的标志 缺失？ •可能并不代表功能的重要性
Mouse: GGKDSCQGDSGGPVVCNG----QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAAN
因此， 分析鉴定TSS的方法都是以cDNA为切入点
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目录
1. cDNA克隆测序
mRNA
CCCCC
cDNA第一链 cDNA第二链
nGGGG
nCCCC cDNA第一链
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mRNA
AAAAAn AAAAAn AAAAAn
反转录酶 Oligo (dT)15-18
反转录酶 10nt 随机引物
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5-RACE adaptor 5-RACE adaptor 5-RACE adaptor
5-RACE adaptor
长短不同的cDNA
随机引物
用10nt随机引物与5-RACE引物 进行PCR扩增
5-RACE adaptor
5-RACE adaptor 5-RACE adaptor 5-RACE adaptor
•在识别位点下游18~20碱基处切开双链DNA
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Gppp
p
XhoI MmeI
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1. 各种数据库的介绍
(1) Nucleotide
•该数据库由国际核苷酸序列数据库成员美国 国立卫生研究院GenBank、日本DNA数据库 (DDBJ)和英国Hinxton Hall的欧洲分子生物学 实验室数据库(EMBL）三部分数据组成
•5′SAGE是在PCR过程中将MmeI酶切位点引物cDNA的5′ 端，通过酶切和连接获得不同短片段重复序列，并对重 复序列进行测序获得大量片段序列信息
•不同序列的短片段代表不同基因的转录起始点 (TSS)
MmeI:
•是一种特殊的II型限制性核酸内切酶
•识别的序列不是回文结构，而是不对称的DNA 序列5′-TCCRAC-3′（R代表G或A）
•该数据库包括原文信息、图片和参考信息， 同 时 还 可 以 链 接 到 Entrez 系 统 MEDLINE 数 据库中相关文献和序列信息
•其他：书目，杂志，文章引用匹配等
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2. NCBI数据库检索
•在检索框中输入检索词，检索词间默认逻辑关 系为AND，检索规则基本同PubMed
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•向下拉寻找关注的内容
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•可以直接拷贝保存相关内容
•凡是连接的地方都可以点击查看
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3. NCBI数据库搜索工具
•Entrez：
是一个用以整合NCBI数据库中信息的
搜寻和检索工具 •Entrez的一个强大和独特的特点
蛋白质
核苷酸 （翻译）
蛋白质
核苷酸 （翻译）
核苷酸 （翻译）
内容 使用取代矩阵寻找较远的关系： 可以进行SEG过滤 寻找较高分值的匹配，对较远关系 不太适用 对于新的DNA序列和ESTs的分析极 为有用 对于寻找数据库中没有标注的编码 区极为有用 对于分析EST极为有用
2019-11-3
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发光标记巢氏PCR引物实现高通量鉴定转录
起始点
5-p 帽
mRNA
AAAAAn
牛小肠磷酸酶 (CIP)
5-帽
AAAAAn
烟草酸焦磷酸酶 (TAP)
5-
5-RACE adaptor (寡核苷酸)
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AAAAAn
将5-RACE adaptor (寡核苷 酸)加到脱帽RNA分子上
AAAAAn
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第二节 基因转录起始点的鉴定
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主要内容： 一、基因转录起始点的序列特征 二、基因转录起始点的序列分析
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一、基因转录起始点的序列特征
1. 真核基因及其调控元件
顺式作用元件
-GCGC---CAAT---TATA
结构基因
转录起始点