蛋白浓度的测定
蛋白浓度的测定方法
蛋白浓度的测定方法蛋白质是构成生物体的重要基本成分之一，对于研究生物学和医学具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质的浓度对于科研工作具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质浓度测定方法。
一、Lowry法Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质与硫酸铜在碱性条件下发生络合反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
二、Bradford法Bradford法是一种常用的快速、灵敏的蛋白质浓度测定方法。
该方法利用蛋白质与染料吸附后的吸收光谱变化来测定蛋白质的浓度。
Bradford染料在酸性条件下与蛋白质发生络合反应，形成蓝色复合物，其吸光度与蛋白质的浓度成正比。
三、BCA法BCA法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用还原性物质与蛋白质中的蛋白质酸和蛋白质酰胺反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
四、Ninhydrin法Ninhydrin法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质中的氨基酸与Ninhydrin反应，生成紫色复合物。
复合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定吸光度来计算蛋白质的浓度。
五、UV吸收法UV吸收法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，该方法利用蛋白质中芳香族氨基酸（如酪氨酸和色氨酸）的吸收特性来测定蛋白质的浓度。
在特定波长下，蛋白质吸收的光强与蛋白质的浓度成正比，可通过比色法测定光强来计算蛋白质的浓度。
六、生物传感器法生物传感器法是一种新兴的蛋白质浓度测定方法，该方法利用生物传感器与蛋白质结合后的信号变化来测定蛋白质的浓度。
生物传感器可以是抗体、酶或其他与蛋白质结合的生物分子，通过测定生物传感器信号的变化来计算蛋白质的浓度。
蛋白质浓度的测定方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，根据研究需要和实验条件的不同，可以选择合适的蛋白质浓度测定方法进行实验。
蛋白浓度测定的各种方法
蛋⽩浓度测定的各种⽅法蛋⽩质的定量分析是⽣物化学和其它⽣命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多⽣物制品，药物、⾷品质量检测的重要指标。
在⽣化实验中，对样品中的蛋⽩质进⾏准确可靠的定量分析，则是经常进⾏的⼀项⾮常重要的⼯作。
蛋⽩质是⼀种⼗分重要的⽣物⼤分⼦：它的种类很多，结构不均⼀，分⼦量⼜相差很⼤，功能各异，这样就给建⽴⼀个理想⽽⼜通⽤的蛋⽩质定量分析的⽅法代来了许多具体的困难。
⽬前测定蛋⽩质含量的⽅法有很多种，下⾯列出根据蛋⽩质不同性质建⽴的⼀些蛋⽩质测定⽅法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯⽒定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体⾦法染⾊性质：考马⽒亮蓝染⾊法、银染法其他性质：荧光法蛋⽩质测定的⽅法很多，但每种⽅法都有其特点和局限性，因⽽需要在了解各种⽅法的基础上根据不同情况选⽤恰当的⽅法，以满⾜不同的要求。
例如凯⽒定氮法结果最精确，但操作复杂，⽤于⼤批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量⼤，测量范围窄，因此在科研上的应⽤受到限制；⽽酚试剂法弥补了它的缺点，因⽽在科研中被⼴泛采⽤，但是它的⼲扰因素多；考马⽒亮兰染⾊法因其灵敏⽽⼜简便开始重新受到关注；BCA法⼜以其试剂稳定，抗⼲扰能⼒较强，结果稳定，灵敏度⾼⽽受到欢迎；胶体⾦法具有较⾼的灵敏度，可达到毫微克⽔平，⽤于微量蛋⽩的测定。
常⽤的测定蛋⽩质含量⽅法的⽐较⽅法测定范围（µg/ml）不同种类蛋⽩的差异最⼤吸收波长(nm)特点凯⽒定氮法⼩标准⽅法，准确，操作⿇烦，费时，灵敏度低，适⽤于标准的测定紫外分光光度法100—1000⼤280205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法1000—10000⼩540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量⼤Folin-酚试剂法20—500⼤750灵敏，费时较长，⼲扰物质多考马⽒亮蓝G-25050—500⼤595灵敏度⾼，稳定，误差较⼤，颜⾊会转移BCA50—500⼤562灵敏度⾼，稳定，⼲扰因素少，费时较长由于凯⽒定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度⼜太低，下⾯介绍Folin—酚试剂法，考马⽒亮蓝G—250染⾊法，紫外分光光度法、胶体⾦法等⼏种最常⽤使⽤的⽅法。
[指南]蛋白质浓度的测定方法总结
![[指南]蛋白质浓度的测定方法总结](https://img.taocdn.com/s3/m/9b0f826e30b765ce0508763231126edb6f1a7664.png)
一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。
选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。
从而显得结果很不稳定。
蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。
紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量0【实验目的】01. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
02. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
0【实验原理】0大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
0紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
0【实验材料】01.实验器材0试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。
02.实验试剂0(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。
0(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
0【实验操作】01. 绘制标准曲线0取7支试管按下列各表加入各试剂：0二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。
蛋白质浓度测量标准
蛋白质浓度测量标准
蛋白质浓度是衡量蛋白质含量的重要参数。
因此，确定正确的蛋白质浓度对于许多生物化学和分子生物学实验至关重要。
这里我们介绍几种常用的蛋白质浓度测量标准。
1. 比色法：比色法是测定蛋白质浓度最常用的方法之一。
该方法基于分子间色素的吸收差异，比较未知浓度的蛋白质样品与已知浓度的标准样品的吸光度。
2. BCA法：BCA法是一种常用的蛋白质浓度测量标准，其原理为利用还原性离子（如Cu2+）与蛋白质中的蛋白质酪氨酸残基发生反应，形成紫色化合物，通过比色法确定蛋白质浓度。
3. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测量方法，其原理是通过蛋白质与碱式铜离子复合，还原Folin-Ciocalteu试剂，生成蓝色化合物，最后通过比色法确定蛋白质浓度。
4. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感的蛋白质浓度测量方法，其原理为蛋白质样品与Bradford染料发生结合，形成复合物后，可通过比色法确定蛋白质浓度。
总之，选择正确的蛋白质浓度测量标准对于实验的准确性和可靠性具有至关重要的作用。
在选择测量方法时，应该根据实验需要和样品的特性选择适合的方法。
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蛋白浓度测定方法
蛋白浓度测定方法引言：蛋白质是生物体内广泛存在的一类重要有机分子，其浓度的准确测定对于生物研究和医学诊断具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白浓度测定方法，包括比色法、BCA法、Lowry法和Bradford 法，并对其原理、步骤和应用进行详细说明。
一、比色法：比色法是一种常用的蛋白浓度测定方法，基于蛋白质与某些特定试剂反应产生颜色变化的原理。
常用的试剂有布拉德福试剂、科学试剂等。
该方法操作简便，结果准确可靠，广泛应用于蛋白质研究领域。
1. 原理：比色法的原理是蛋白质与某些试剂反应产生可测量的颜色变化，根据颜色的强度可以推算出蛋白质的浓度。
这种反应通常是由于蛋白质中存在的特定官能团与试剂之间的化学反应导致的。
2. 步骤：比色法的步骤主要包括样品制备、试剂配制、反应和测量。
首先，将待测样品制备成适当浓度的溶液；然后，配制试剂，并与样品混合反应；最后，使用光谱仪或分光光度计测量反应产生的颜色的光吸收值，并根据标准曲线推算出蛋白质的浓度。
3. 应用：比色法广泛应用于生物化学、分子生物学、药学等领域。
例如，可以用于蛋白质表达水平的测定、蛋白质纯化过程中的监测以及药物研发过程中的蛋白质浓度测定等。
二、BCA法：BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质酰基反应产生紫色络合物的测定方法。
该方法具有灵敏度高、稳定性好等特点，广泛应用于蛋白质浓度测定和蛋白质含量分析。
1. 原理：BCA法的原理是蛋白质中的蛋白质酰基与铜离子在碱性条件下反应生成紫色络合物，该络合物的吸收峰位于562 nm处。
蛋白质浓度与吸光度呈线性关系，可通过比色法测定吸光度来推算蛋白质的浓度。
2. 步骤：BCA法的步骤主要包括样品制备、试剂配制、反应和测量。
首先，将待测样品制备成适当浓度的溶液；然后，配制BCA试剂，并与样品混合反应；最后，使用分光光度计测量反应产生的紫色络合物的吸光度，并根据标准曲线推算出蛋白质的浓度。
3. 应用：BCA法被广泛应用于生物化学、分子生物学、生物技术等领域。
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法
测蛋白浓度的方法有多种，常见的方法包括：
1. Bradford法：用Bradford试剂与蛋白质反应，形成蓝色的蛋白质-染料复合物。
根据复合物与蛋白质浓度成反比的关系，可以通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
2. Lowry法：将蛋白质与碱式铜试剂和Folin-Phenol试剂反应，生成紫色蛋白质-复合物。
通过比色法或荧光法测定复合物的吸光度，计算出蛋白质浓度。
3. BCA法：将蛋白质与BCA试剂反应形成紫色的蛋白质-染料复合物，根据复合物与蛋白质浓度成正比的关系，通过比色法或荧光法测定蛋白质浓度。
4. UV分光光度法：利用蛋白质在280nm处的吸收峰测定蛋白质浓度。
该方法的优点是快速、简单，但需要纯化后的蛋白质，并且无法区分不同种类的蛋白质。
5. 二维凝胶电泳：分析各种蛋白在二维中的迁移距离，可以定量测定蛋白质的相对含量。
该方法需要复杂的操作和设备，但能够同时定量多种蛋白质。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法蛋白质是生物体内一类重要的生物大分子，其浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义。
目前常用的蛋白质浓度测定方法主要包括比色法、BCA法、Lowry法和Bradford法等。
下面将对这几种常用的蛋白质浓度测定方法进行详细介绍。
比色法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与某种试剂发生反应后产生显色物质，通过测定显色物质的吸光度来确定蛋白质的浓度。
比色法操作简单，结果准确，适用于大多数蛋白质的浓度测定。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质和肽键发生还原反应而形成的紫色螯合物来测定蛋白质浓度的方法。
BCA法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和特异性，适用于各种类型的蛋白质。
Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，其原理是利用蛋白质与碱性铜离子和蛋白质中的酚类物质在碱性溶液中发生离子还原反应，生成蓝色络合物，通过测定其吸光度来确定蛋白质的浓度。
Lowry法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和稳定性，适用于大部分蛋白质的浓度测定。
Bradford法是一种基于某种染料与蛋白质中的氨基酸残基之间的相互作用来测定蛋白质浓度的方法。
Bradford法对于蛋白质的浓度测定具有较高的灵敏度和线性范围，适用于多种类型的蛋白质。
在进行蛋白质浓度测定时，需要注意以下几点，首先，选择合适的测定方法，根据样品的特性和实验要求进行选择；其次，掌握好操作技巧，严格按照操作步骤进行，避免操作失误；最后，对测定结果进行准确的记录和分析，确保结果的可靠性和准确性。
总之，蛋白质浓度的准确测定对于生物学研究和生物工程技术具有重要意义，选择合适的测定方法并掌握好操作技巧是保证测定结果准确可靠的关键。
希望本文介绍的蛋白质浓度测定方法能够对您有所帮助。
蛋白浓度测定
蛋白浓度测定（沈晨杰）1、用细胞裂解液裂解细胞3min左右，用刮刀刮，然后用国产EP管将蛋白收集12000rpm，4℃离心10min，吸取上清蛋白液，移至进口EP管中。
2、这里叙述的方法是我们最为常用的考马斯亮蓝法，测定蛋白浓度还可以根据需要选择BCA法等。
利用96孔板，每个蛋白样品做3个副孔，然后首先用200ul的考马斯亮蓝铺板（1:4水进行稀释），然后吸取蛋白样品在每孔滴加2ul蛋白上清液，用枪混匀。
通常来说，这里的动作越快越好，因为考马斯亮蓝会随着时间的增加它的颜色会变得更深，所以不同时间测得的吸光度可能有变化。
所以最好在最快的时间内加完蛋白，并振荡，再在酶标仪上测定吸光度。
切记，不要忘记做空白对照，也就是所谓的只有考马斯亮不加蛋白的孔。
3、设定酶标仪步骤在这里不做阐述了，下面就涉及到蛋白浓度的测定了。
首先仪器会根据吸光度读出一个OD值，利用每个OD值减去空白对照，然后得出各自去除背景的吸光值。
将3个副孔的吸光值求平均，带入标准曲线求得蛋白浓度，此时蛋白浓度要进行除以2的处理。
除以2后的蛋白浓度是你上清液的最终蛋白浓度了。
4、接下来就是涉及到计算的问题了。
首先决定你的蛋白上样量，比如我们一般用50ug蛋白进行上样，那你取的蛋白体积就是50ug/你蛋白液的浓度，知道这个体积后，你接下来应该想的就是你准备做几次WB，一般都做5-8次，那我们选取5次为例，那我们要从进口EP 管里取的蛋白体积就是5乘以我们算出来的蛋白体积。
在我们这个体系里，20ul一次的上样体积是固定的，也就是说我总体积就是100ul，即5乘以20ul。
那我5成的Loading要稀释成1成就是100ul体系里我要加20ul的loading。
那由此我们就可以得出，我们加水的量就是80-从进口EP管理取的蛋白体积的量。
这样，蛋白浓度就保持一致了。
操作为主，理论为辅。
蛋白质浓度测定方法
蛋白质浓度测定方法1.低里德试剂法低里德试剂法通过测定蛋白质与试剂中碱式染料之间的吸光度来计算蛋白质浓度。
常用的低里德试剂有考马斯亮蓝G-250和试剂Folin-Ciocalteu。
这种方法操作简便，灵敏度高，但依赖于特定的蛋白质。
2.比色法比色法使用吸光度测定蛋白质溶液中特定波长的光的吸收程度。
常用的试剂有Bradford试剂、Biuret试剂和BCA试剂。
这些试剂与蛋白质发生化学反应后，形成显色物质，显色强度与蛋白质浓度成正比。
这种方法操作简便，灵敏度高，但对于一些物质干扰较大。
3.紫外吸收法紫外吸收法是通过测定蛋白质在特定波长下的吸光度来计算蛋白质浓度。
蛋白质在280 nm波长下的吸光度与其含量成正比。
该方法对纯度较高的蛋白质测定较为准确，但对于包含核酸、色素等物质的溶液会有干扰。
4.氨基酸分析法氨基酸分析法是通过测定蛋白质中的氨基酸含量来估计蛋白质浓度。
可使用色谱法或光谱法进行氨基酸测定。
该方法需要较复杂的实验设置和仪器，适合用于纯化蛋白质或特定氨基酸分析。
5.生物学活性测定法生物学活性测定法是通过测定蛋白质对生物系统或特定底物的活化能力来估计蛋白质浓度。
例如，酶活测定法通过测定酶活性与酶浓度之间的关系来计算蛋白质浓度。
这种方法直接反映了蛋白质的功能性，但前提是需要具备可靠的活性测定方法。
在实验中选择合适的蛋白质浓度测定方法需要根据实验目的、样品属性和仪器设备等进行综合考虑。
此外，为了减小误差，实验过程中应注意控制实验条件的一致性，并进行适当的平行样品测定。
蛋白质浓度检测标准
蛋白质浓度检测标准引言蛋白质是生物体内非常重要的有机化合物，其浓度的准确检测对于许多生物学和生物化学研究具有重要意义。
蛋白质浓度的准确检测可以帮助科学家了解细胞内蛋白质的含量和分布，起到指导生物研究方法和结果解释的作用。
因此，制定蛋白质浓度检测标准至关重要。
确定蛋白质浓度的方法1.分光光度法分光光度法是目前最常用的测定蛋白质浓度的方法之一。
该方法利用蛋白质在特定波长下的吸光性质来测定其浓度。
具体操作步骤如下：–准备一定浓度的标准蛋白溶液，例如1mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液。
–使用分光光度计在280nm波长下测量标准蛋白溶液的吸光度。
记录吸光度与浓度的关系。
–测量待测蛋白溶液的吸光度，并根据标准曲线确定其浓度。
2.二氧化碳测定法二氧化碳测定法利用蛋白质氨基酸和二氧化碳的反应，原理是测定生成的二氧化碳量与蛋白质浓度成正比。
具体操作步骤如下：–将蛋白溶液与NaOH溶液混合，使蛋白质中的氨基酸与NaOH反应产生二氧化碳。
–静置反应混合液一段时间后，使用酸去除多余的NaOH。
–使用酸碱滴定法测定反应产生的一氧化碳的量，根据一氧化碳与蛋白质浓度的关系确定蛋白质的浓度。
3.比色法比色法是一种简单且常用的蛋白质浓度测定方法。
其原理是利用蛋白质与某些试剂的化学反应产生显色物质，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
具体操作步骤如下：–将蛋白质溶液与试剂混合，反应一段时间后生成显色物质。
–使用分光光度计测量显色物质的吸光度，根据吸光度与浓度的关系确定蛋白质的浓度。
蛋白质浓度检测的标准制定1.标准蛋白溶液的选取制定蛋白质浓度检测标准的第一步是选取标准蛋白溶液。
常用的标准蛋白溶液包括牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）等。
选取标准蛋白溶液时应考虑其纯度、稳定性、价格等因素。
2.确定标准曲线标准曲线是将已知浓度的标准蛋白溶液的吸光度与浓度进行关联的曲线。
制定标准曲线的具体步骤如下：–准备一系列浓度递增的标准蛋白溶液，例如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等。
测蛋白质浓度的方法
测蛋白质浓度的方法
测定蛋白质浓度的常用方法有：
1. 布拉德福法（Bradford法）：利用蛋白质与染料共存时发生吸光性变化的原理。
将样品与染料（布拉德福试剂）反应后，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
2. Lowry法：利用蛋白质与试剂（含铜离子和碱液）发生离子传递反应产生复合物，再与酚反应形成比色产物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
3. BCA法（双硫仑法）：利用蛋白质与试剂（含双硫仑和铜离子）反应生成紫色螯合物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
该方法适用于一般抗原浓度范围内。
4. 490 nm法：该方法利用酪氨酸与试剂（含酮氨酸和硫氰酸）发生反应生成紫色产物，通过比色法测定吸光度，再与标准曲线进行比较以确定蛋白质浓度。
需要注意的是，不同方法适用于不同类型和浓度的蛋白质，选择合适的方法进行测定非常重要。
同时，测定结果可能受到样品的酸碱度、离子浓度、存在的干扰物等因素的影响，应尽可能控制这些条件以获得准确的测量结果。
蛋白浓度测定方法
蛋白浓度测定方法蛋白浓度是生物学和化学研究中非常重要的参数，因此需要准确测定。
下面介绍两种常用的蛋白浓度测定方法。
一、比色法1. 原理比色法是利用蛋白质与某些试剂反应后形成的复合物吸收特定波长的光线，从而确定蛋白质含量的方法。
2. 实验步骤（1）制备标准曲线：取不同浓度的已知蛋白标准溶液，分别加入试剂，使其形成复合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并记录下来。
将吸光度值作为纵坐标，标准溶液的蛋白质浓度作为横坐标绘制曲线。
（2）待测样品处理：将待测样品加入相同试剂中，形成复合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质含量。
3. 注意事项（1）试剂选择：常用试剂有Bradford试剂、Biuret试剂和Lowry试剂等。
不同试剂的灵敏度和选择性不同，应根据实验需要选择合适的试剂。
（2）标准曲线制备：标准曲线中应包含待测样品中可能出现的蛋白质种类，以确保准确性。
二、BCA法1. 原理BCA法是利用还原剂将蛋白质中的酰胺键还原为游离氨基，然后使用BCA试剂与游离氨基反应生成紫色络合物。
络合物吸收特定波长的光线，从而确定蛋白质含量的方法。
2. 实验步骤（1）制备标准曲线：取不同浓度的已知蛋白标准溶液，加入还原剂和BCA试剂，使其形成络合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并记录下来。
将吸光度值作为纵坐标，标准溶液的蛋白质浓度作为横坐标绘制曲线。
（2）待测样品处理：将待测样品加入相同还原剂和BCA试剂中，形成络合物。
然后使用分光光度计在特定波长下测量吸光度值，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质含量。
3. 注意事项（1）还原剂选择：常用还原剂有DTT和β-巯基乙醇等。
不同还原剂的灵敏度和选择性不同，应根据实验需要选择合适的还原剂。
（2）标准曲线制备：标准曲线中应包含待测样品中可能出现的蛋白质种类，以确保准确性。
蛋白质浓度的测定(精华)
蛋白质浓度的测定一．紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。
某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。
近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。
因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。
比如，当蛋白质浓度为1mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。
但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。
这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。
该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。
同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A(absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。
消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。
其中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2. 远紫外吸收光谱法在190-210 nm范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。
此波长范围内，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。
对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。
检验蛋白质浓度的方法
检验蛋白质浓度的方法
常用检测蛋白质浓度的方法有比色法、质谱法、时间分光光度法、电泳法等。
1、比色法：利用蛋白质及其衍生物吸收光谱的特点，分别用不同浓度的染色剂对标准品和样品进行染色，然后比较染色后的色度强度多少，可确定蛋白质浓度。
2、质谱法：其原理是，利用质谱仪，通过电离质谱图，分析样品中各种分子量物质，通过其他组分中已知浓度的比较，考察来蛋白质浓度。
3、时间分光光度法：该法是利用偶联反应，比如蛋白质与某种琼脂糖结合反应等，在短时间内达到最高点，然后用某种光度测定仪检测，由其浓度变化来推测蛋白质的浓度。
4、电泳法：电泳法是检测蛋白质最常用的方法，原理是把样品放在凝胶泳道中，加上电压，使分子带电而沿正负极移动，然后根据电泳图判断蛋白质浓度。
蛋白浓度测定的方法
蛋白浓度测定的方法蛋白质是生物体内的重要物质，对于许多实验室研究和临床诊断都有着重要的意义。
因此，准确测定蛋白质的浓度是非常关键的。
目前，常用的蛋白质浓度测定方法主要有生物学素法、分光光度法、BCA法、Lowry法、Bradford法和尿素法等。
下面将分别介绍这些方法的原理和操作过程。
1.生物学素法：生物学素法是一种通过测定蛋白质与棒状素之间的结合来确定蛋白质浓度的方法。
这种方法主要应用于血浆、血清和尿液等样品的蛋白质测定。
实验方法如下：a.准备一组具有不同浓度的棒状素溶液。
b.将待测蛋白质溶液与棒状素一起孵育一段时间。
c.通过酸甲醛试剂对母液进行反应，并测量光密度。
d.制作标准曲线，并根据待测样品的光密度与标准曲线的关系计算蛋白质浓度。
2.分光光度法：分光光度法是一种通过测定蛋白质对特定波长的紫外光吸收量来计算浓度的方法。
这种方法适用于纯度较高的蛋白质样品。
实验方法如下：a. 准备一组蛋白质标准溶液，并使用光度计测量其在280nm波长处的吸光度。
b.将待测蛋白质样品的吸光度值与标准溶液的吸光度值进行比较，并计算浓度。
3.BCA法：BCA法是一种通过测定蛋白质与巴氏试剂之间的反应产生的紫色络合物的吸光度来计算蛋白质浓度的方法。
该方法对于各种类型的蛋白质样品都适用。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入BCA试剂。
b.将待测蛋白质样品与BCA试剂孵育一段时间。
c.使用光度计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
4. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，通过低里试剂和碱式铜试液与蛋白质样品反应，产生紫色或蓝色化合物，并通过比色计测量光密度来计算蛋白质浓度。
实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入低里试剂和碱式铜试液。
b.将待测蛋白质样品与低里试剂和碱式铜试液反应一段时间。
c.使用比色计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。
5. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感且广泛应用的蛋白质浓度测定方法，通过考虑到蛋白质在酸性溶液中与染料试剂环氧化苏丹蓝的特异性作用来计算浓度。
蛋白质浓度的测定(精华)
蛋白质浓度的测定一．紫外吸收法1. 近紫外吸收光谱法（280 nm）原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。
某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。
近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。
因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。
比如，当蛋白质浓度为1 mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。
但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。
这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。
该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。
同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：朗伯比尔定律：A (absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。
消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。
其中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2. 远紫外吸收光谱法在190-210 nm围，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。
此波长围，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。
对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。
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改良lowry法的原理图
650nm
• 紫外分光光度法
• 有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基 酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可根据280nm 处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。
• 在生物样品中还可能会含有核酸等成分，在280nm处也 有吸收，它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除 核酸的影响 蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260
制备标准曲线，根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度
• 紫外分光光度法
取待测样品稀释液，以蒸馏水为对照，在紫外分光光度 计上分别测定OD280nm和OD260nm的吸光度值，根据 经验公式计算蛋白浓度
蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260
实验仪器
实验讨论和注意事项
• 比色法是常用的测定浓度的方法，其关键点在于标准曲线 的制备一定要精确。标准样品的配置浓度是否精确直接影 响实验的结果，因此要正确掌握加样枪、移液管的操作， 保证标准样品配置的准确。
• 对于分光光度计的使用要正确掌握，注意调节波长。正确 的进行仪器的调试和测定，保证结果的准确。
波长 260
280
实验步骤
• 改良Lowry法
编号 1
2
3
4
5
6
测定管
蛋白含量 17.5 35
70
105 140 0
ug/ml
未知
标准溶液、 1.0 1.0
1.0
1.0
1.0
-
1.0
样品
ml
生理盐水 -
-
-
-
-
1.0
-
ml
试剂A
0.9 0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
ml
混匀后置于50度水浴中保温10分钟，冷却
试剂B 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 ml
室温放置10分钟 试剂C 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 ml 立即混匀，置于50度水浴中保温10分钟，冷却后在650nm处比色
制备标准曲线，根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度
改良Lowry法蛋白质浓度测定
蛋白浓度的测定
实验目的
• 通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、 实验步骤
• 了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法 测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。
实验原理
• 改良Lowry法
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜 复合物。（双缩脲反应 ） 蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸 -磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋 白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关 系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应）
• Coomassie亮蓝法
管 号1
2
3
4
5
6
蛋白质含 量ug/ml 标准溶液 ml 生理盐水 ml 样品 ml 染液 ml
500 0.1 － － 5
250 0.1 － － 5
125 0.1 － － 5
62.5 31.25 0
0.1
0.1
－
－
－
0.1
－－－Fra bibliotek55
5
测定管 未知 － － 0.1 5
摇匀，室温静置3分钟，以第六管为对照，于595nm波长比 色，读取吸光度。