蛋白浓度的测定

改良lowry法的原理图
650nm
• 紫外分光光度法
• 有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基 酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可根据280nm 处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。
• 在生物样品中还可能会含有核酸等成分，在280nm处也 有吸收，它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除 核酸的影响 蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260
蛋白浓度的测定
实验目的
• 通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、 实验步骤
• 了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法 测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。
实验原理
• 改良Lowry法
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜 复合物。（双缩脲反应 ） 蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸 -磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋 白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关 系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应）
• 对于分光光度计的使用要正确掌握，注意调节波长。正确 的进行仪器的调试和测定，保证结果的准确。
制备标准曲线，根据测定管的OD595nm值计算未知蛋白质浓度
• 紫外分光光度法
取待测样品稀释液，以蒸馏水为对照，在紫外分光光度 计上分别测定OD280nm和OD260nm的吸光度值，根据 经验公式计算蛋白浓度
蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260
实验仪器
实验讨论和注意事项
• 比色法是常用的测定浓度的方法，其关键点在于标准曲线 的制备一定要精确。标准样品的配置浓度是否精确直接影 响实验的结果，因此要正确掌握加样枪、移液管的操作， 保证标准样品配置的准确。
试剂B 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 ml
室温放置10分钟 试剂C 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 ml 立即混匀，置于50度水浴中保温10分钟，冷却后在650nm处比色
制备标准曲线，根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度
改良Lowry法蛋白质浓度测定
波长 260
280
实验步骤
• 改良Lowry法
编号 1
2
3
4
5
6
测定管
蛋白含量 17.5 35
70
105 140 0
ug/ml
未知
标准溶液、 1.0 1.0
1.0
1.0
1.0
-
1.0
样品
ml
生理盐水 -
-
-
-
-
1.0
-
ml
试剂A
0.9 0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
Fra Baidu bibliotekml
混匀后置于50度水浴中保温10分钟，冷却
• Coomassie亮蓝法
管 号1
2
3
4
5
6
蛋白质含 量ug/ml 标准溶液 ml 生理盐水 ml 样品 ml 染液 ml
500 0.1 － － 5
250 0.1 － － 5
125 0.1 － － 5
62.5 31.25 0
0.1
0.1
－
－
－
0.1
－
－
－
5
5
5
测定管 未知 － － 0.1 5
摇匀，室温静置3分钟，以第六管为对照，于595nm波长比 色，读取吸光度。