PCR扩增原理及过程课件

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第一节 PCR技术原理和工作方式
• 一、PCR的基本原理 • 1、基本要素和扩增原理 • DNA的复制是生命活动中最基本的过程之一，PCR
的基本原理离不开DNA复制的基本规律。在PCR过 程中模板可以是双链DNA也可是单链DNA，最后 扩增出来的是双链状态的。其中引物是DNA复制 中不可缺少的。
若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温 度范围内.
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二、PCR反应体系
PCR反应需要在一定的条件下才能完成，只有 这些条件协调作用时才能达到很好的效果。 1、缓冲液 2、脱氧三磷酸核苷（dNTP） 3、引物 4、模板 5、DNA聚合酶
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1、 缓冲液：
缓冲液除了提供pH缓冲能力外，还有一些辅助反应 进行的成分，主要是Mg2+。 Mg2+浓度的高低会影响扩增 的特异性和产率，直接影响扩增的成败，最佳的镁离子浓 度对于不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度, 可 以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出 最适的Mg2+浓度。
• （3）VentDNA聚合酶
• ຫໍສະໝຸດ Baidu4）pwoDNA聚合酶
是使用较多具有3’到5’外切酶活性且具有高保 真度的PCR酶
• （5）pfuDNA聚合酶
是目前使用最广范具有3’到5’外切酶活性的PCR 酶商用混合酶
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学习本节课我们应该掌握以下问题
• 1.简述PCR反应的工作原理。
• 是在模板DNA、引物和dNTP的存在下依赖于DNA 聚合酶的酶促反应。由一对引物介导,通过温度的 调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能 与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、 在dNTP存在下,DNA聚合酶能使引物沿单链模板延 伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复 性-延伸的过程，就是一个PCR循环；
PCR技术及应用
PCR技术是模拟体内DNA复制的的方式，在体外 选择性的将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。 其过程与普通DNA复制一样有三个步骤，首先是 模板DNA变性，由双链状态变成单链状态;然后引 物与模板结合，完成复制过程；最后在DNA聚合
酶和底物存在情况下合成与模板互补的DNA。
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• 与单纯的DNA复制不同的是，PCR扩增总是在两个 引物的存在下对DNA的两条链同时进行复制，复 制的结果得到一条双链DNA。通过仪器的自动控 制，使这样的DNA复制重复进行，从而得到大量 的位于两个引物之间的DNA片段，即目的片段。 前一轮扩增得到的DNA产物可做下一轮扩增的模 板，扩增产物以几何级别递增。
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3、模板
模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是 PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件，一般要 有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应避免混 有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影响扩增 的效果，一般要求含量合适，3ⅹ105分子数（1μg）（提高 产量，减少非特异性扩增）；
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Tm (melting temperature)：50%DNA分子变性时 温度称为熔解温度/解链温度。
一般生理条件下，Tm在85℃ -95℃之间。影响 Tm值的因素：
（G+C）含量增加，Tm值增高
溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形 成增多）；
甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间 的氢键不稳定，可避免G、C含量高的DNA在高温 变性时引起断裂而失活）；
2、脱氧三磷酸核苷 （dNTP）
脱氧三磷酸核苷是DNA合成的底物，高浓度dNTP易 产生错误掺入；但浓度过低，将降低反应产物的产量。四 种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的 浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚 合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。
PCR中常用终浓度为200μM的dNTP
(1)Taq DNA聚合酶
是目前实验室PCR中应用最多的酶。具有5’到3’合成活性和5’ 到3’外切酶活性，但无3’到5’外切酶活性。在95度的半衰期 为40分钟。由于没有3’到5’外切酶活性，在扩增中有 8.9×10-5~~1.1×10-4的错配率。
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• （2）TthDNA聚合酶
来自嗜热热细菌HB8在74度下进行扩增Mg+存在条件 下，以DNA为模板合成DNA，Mncl2存在下可以RNA 为模板合成cDNA。
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• 2、PCR扩增的步骤
首先将模板DNA置于92~96度进行变性处理，使 双链DNA在高温下解链成为单链DNA此时的温度 称为解链温度Tm，且热变性不改变其化学性质； 染后退火，将温度降至37~72度，使引物与模板的 互补区结合，最后在72度条件下，DNA聚合酶将 dNTP连续加到引物的3’羟基端合成DNA这个步骤 称为延伸。这三个热反应过程的重复性称为一个 循环经过20~40个循环可扩增得到大量位于两条引 物序列之间的DNA片段。
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• 2.循环次数是否越多越好？为何？
• 很明显不是的，任何事都要有一个度。
• 一般循环在25到30次之间尔后循环数的进一步增 加并不意味着产物的数量一定增加这是由于PCR扩 增过程中后期会出现平台效应，这时期产物的积 累按减弱的指数速率增长这时一些不利因素也会 产生：如底物和引物浓度降低、dNTP和DNA聚合 酶的稳定性或活性降低、产生的焦磷酸会产生末 端产物抑制作用、非特异性产物或引物的二聚体 会产生非特异性竞争、扩增产物的自身复性、高 浓度扩增产物变性不彻底
4、DNA聚合酶
PCR反应中使用的DNA聚合酶是耐高温的，在90度以上的高 温下仍能有活性。也正是高温DNA聚合酶的应用才使得PCR 技术得以推广。选择聚合酶要从实验的具体要求考虑，高 保真的酶成本较高，只有要求严格时选用。
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Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少 3‘到5’外切核酸酶（校正）活性，但是产量高，是目前实验 室应用最多的酶。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定 聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA 聚合酶低。