土壤中反硝化细菌的分离

土壤中反硝化细菌的分离、纯化

邓晓娟查美玲曹娟芳

（江西师范大学生命学院南昌330022）

摘要：

关键词：反硝化细菌，反硝化作用，硝酸盐

Abstract:

Key words:

氮素是水体污染中的一类重要的污染物，对人体健康和环境有极大的危害。近几十年来，规模日益扩大的水产养殖业造成水体中积累大量的鱼类粪便、残饵和死亡的动植物尸体，导致水体氮素含量严重超标，养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。硝化作用由亚硝酸盐细菌和硝酸盐细菌将氨化合物氧化为亚硝酸盐和硝酸盐；反硝化作用也称脱氮作用，由微生物在厌氧或微厌氧条件下将硝酸盐还原成氧化亚氮或氮气，因此，硝化作用与反硝化作用在维持自然界氨的平衡及氮的正常循环中扮演着非常重要的作用。

具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50多个属，约有150余种，绝大部分属于变形细菌纲(Proteobacteria)中的α和β簇群[]。反硝化细菌能将硝态氮或亚硝态氮还原成含氮气体或氮气，不过并不是所有的反硝化细菌都能进行完全的反硝化过程，编码亚硝酸盐还原酶的基因才是反硝化细菌的关键功能基因，在进行反硝化的分子生态学研究中也主要以nirS 或nirK基因作为分子标记。

传统上认为反硝化作用只有在厌氧或缺氧条件下发生，但是在水处理过程中也观察到好氧反硝化现象。尽管有人将好氧反硝化现象的发生归因于微环境中的厌氧条件，但是目前已有相当数量的好氧反[2]、Pseudomonas aeruginosa[l4,15]、Pseudomonas stutzeri [13,16,17] 、Alcaligenes sp．[18,19]。被分离并进行了深入研究，证实好氧反硝化细菌确实存在。本实验拟从花圃土壤中分离纯化反硝化细菌，对菌株进行初步鉴定，并对菌株的反硝化能力进行研究，旨在分离得到反硝化能力高的菌株，为实际应用提供依据。

1 材料

1.1培养基

富集培养基(即反硝化选择性培养基)：硝酸钾2g、硫酸镁0.2g、磷酸氢钾0.5g、酒石豫钾钠20g、蒸馏水1000ml；pH约7.2。

分离培养基：在富集培养基中琼脂即可。

纯化培养基：采用LB培养基。胰蛋白胨10g,酵母提取物5g/L，氯化钠10g,琼脂粉15g,NaOH调pH到7.2，加蒸馏水至1L。

1.2实验试剂

浓硫酸，水杨酸，硝酸钾，无菌水，革兰氏染液等。

1.3实验仪器

培养箱，超净工作台，可见分光光度计，移液管，试管，锥形瓶等。

2.方法

2.1分离纯化

土样1g加入到100ml的富集培养基中，30℃静置密闭培养2d后，l0倍稀释涂分离培

养基平板，挑取菌落进行多次分离，单菌落再经多次LB平板划线纯化，转入斜面保存。2.2形态鉴定

对所筛选到的菌株进行鉴定，通过显微镜下菌体形态观察、革兰氏染色的方法进行了菌株的初步鉴定等。

2.3反硝化能力鉴定

2.3.1硝酸盐浓度测定

采用浓硫酸-水杨酸比色法测定[88]。在浓酸条件下，[NO3–] 与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。生成的硝基水杨酸在碱性条件下（pH>12）呈黄色，最大吸收峰的波长为410nm，在一定范围内，其颜色的深浅与含量成正比，可直接比色测定。

2.3.1.1 试剂的配制

250 mg/L[NO3–]标准液：准确称取经110℃烘至恒重的KNO3 0.4078 g，用水溶解，定容至1000 mL，此溶液中含[NO3–] 250 mg/L。

显色剂：准确称取10.0 g水杨酸，再缓慢加入200 mL浓硫酸，不断搅拌至水杨酸全部溶解，储于棕色瓶，在4℃条件下保存，至少可稳定一个月。

2.3.1.2 标准曲线的绘制

将250 mg/L [NO3–] 标准液分别配制25 mg/L 、50 mg/L 、100 mg/L 、125 mg/L、200 mg/L、250 mg/L 的[NO3–]溶液。

分别取上述溶液100 μL加入25 mL试管中，接着加入0.4 mL 显色剂并摇匀，室温放置20 min,缓慢加入2 M NaOH 9.5 mL，冷却至室温，于410 nm下测定吸光值，空白样含100 μL去离子水。以[NO3–] 浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标作图，即为标准曲线，其相关系数R2=0.9963（如图2.1 所示）。

2.3.1.3 硝酸盐浓度测定

准确吸取1 mL 培养液于1.5 mL离心管中，在6000 rpm、10 min条件下离心，准确吸取0.1 mL上清液于25 mL 试管中，再加入0.4 mL 显色剂并摇匀，室温放置20 min,缓慢加入2 M NaOH 9.5 mL，冷却至室温，于410 nm下测定吸光值，空白样含100 μL去离子水，[NO3–] 的浓度根据标准曲线进行计算，并计算样品中实际[NO3–]的含量。

2.3.2 反硝化速率

单位时间内[NO3–]的去除率表示反硝化速率。

3 结果分析

3.1菌株的筛选

经过多次分离纯化，得到三种菌落形态不同的菌株，分别命名为A、B、C。其中菌株A为深黄色，BC

标准曲线

010*******

2

46

8

OD值

硝酸盐浓度

4.讨论

反硝化作用对于控制水体富营养化，处理污水和净化水域有着极大的利用价值。目前已发现某些植物、真菌和细菌都具有反硝化作用。已知有50属以上的微生物能够进行反硝化作用¨I ，其中绝大多数是细菌。反硝化细菌(denitrifying bacteria)通过诱导产生硝酸还原酶和亚硝酸还原酶对硝酸盐和亚硝酸盐进行还原。不同反硝化细菌的反硝化作用能力不同，生 长条件也存在很大差异