电镜取样及固定液配制
细菌及细胞电镜观察样品制备方法
细菌及细胞电镜观察样品制备方法
1) 取样：取大量样品离心（转速3000r~4000r），去除上清液，加入适当PH（7.2~7.4）的0.1 M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。
2) 固定：2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。
再用纯水清洗两遍。
3) 梯度脱水：用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2 次；再将样品置于乙醇与叔丁醇1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min×2次。
（此步也能够尝试不做）4) 冷冻干燥：滴加处理好的样品于5*5 mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
5) 电镜观察：样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。
2.5%戊二醛：
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：（0.1M的就是稀释2倍）取50mL定容100mL
---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克
双蒸馏水加至500毫升
pH调至7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25% 戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4。
电镜观察固定方法
电镜观察固定方法固定：1、取材；取新鲜拟南芥组织2-3mm2或花苞，迅速放入约5ml固定液中（2.5%戊二醛），针筒抽气（抽干细胞液泡内空气）至材料沉入固定液（如抽气2小时，材料还没有沉入固定液中，可不用抽了）换液5ml戊二醛，4度冰箱中保存至少7天。
若效果不好，可在管口塞团棉花；漂洗：2、吸出固定液及悬浮未沉下的材料，用1ml磷酸缓冲液（4℃保存PH7.2）冲洗，每半小时一次反复3次，将花苞用小镊子分开；固定，染色：3、吸出磷酸缓冲液，加500ul锇酸（有毒，带手套，避光，用锡箔包裹；渗透力很弱，楼下加）过夜染色（打开抽湿机操作）；漂洗，脱水：4、磷酸缓冲液洗去锇酸，开始酒精脱水过程如下：30%10min 50%10min 70%10min 到70%酒精可存放至晴天脱水较好；（注意：以上均为4℃条件即放在冰上进行，以下几步都在室温下进行）80%15min 90%15min 95%15min 100%30min 100%30min（晴天秋季为宜）包埋:环氧丙烷20min 环氧丙烷20min 包埋剂：环氧丙烷1：3过夜，500ul(注意：100%乙醇和环氧丙烷在使用时，要提前用无水硫酸钠或无水硫酸铜过滤，除去里面水分)5、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比1：1），过夜；6、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比3：1），过夜；（以上包埋放在摇床上，以便均匀渗透）聚合7、在橡胶小板上加入纯包埋剂，用牙签把材料分别移入橡胶小板的空格内摆放整齐，一般放2个花苞，过夜。
（注意：多余的包埋剂置于4℃保存，防止凝固）8、直接把橡胶小板置于65℃条件下聚合48h；9、切片（先切厚片看看，以免重复切片，再切薄片）；10、染色：醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，双氧水漂洗1-2秒；（注意：染色期间不要说话，避免CO2造成切片污染）。
电镜步骤
生物医学测试中心细胞生物学平台电镜机组常规透射电镜样品处理步骤1. 取新鲜的足够小的样品立刻置于pH=7.2的固定液（含2%PFA和2.5%的戊二醛的混合液）中，4°C过夜或者室温固定2h以上。
2. 0.1M的PB缓冲液冲洗样品3次，10min/次。
3. 1%饿酸后固定1h。
4. 0.1MPB缓冲液冲洗3次，10min/次。
5. 梯度酒精脱水，50%，70%，80%，90% 10min，100%酒精3次，10min/次。
6. 酒精：丙酮=1:1 10min。
7. 丙酮10min。
8. 丙酮：812树脂=1:1 2h，RT9. 丙酮：812树脂=1:2 2h，RT10. 丙酮：812树脂=1:3 2h，RT11. 树脂过夜。
12. 更换新鲜树脂8h。
13. 包埋样品，RT静置4h。
.14. 37°C过夜。
15. 60°C24h。
16. 制作超薄切片。
17. 电镜观察拍照。
注意事项：1. 如有条件对实验动物用混合固定液（（含2%PFA和2.5%的戊二醛的混合液）进行灌流（perfusion fixation），或者在低温环境下用锋利的切割器械迅速取材。
2. 动作迅速：组织离体后应尽快将其快速放入化学固定液内，使组织和细胞尽可能保持原来的生活状态。
3. 减少损伤：选择锋利切割器械，避免或尽量减少牵拉或挤压组织。
4. 组织块大小：为使组织得到均匀而充分固定，所取材料应小于1mm³。
5. 低温操作：为减少对组织细胞酶活性的破坏，最好在4℃下操作，所用容器、器械及固定液均需要预冷。
在血液供给停止后，防止组织和细胞内各种酶的作用使组织发生自溶，降解组织中蛋白、核酸等主要成分。
6. 需要定位样品请与相关人员咨询特定取材方式。
常见样品脱水时间：细胞8min组织10min,若较嫩为8min细胞器2min脂肪8min或＜8min叶片15min根15min藻类15min菌10-15min以上均为常规注意事项，送样之前和送样时请与相关人员当面进行沟通，然后选择适合的处理方法。
电镜生物样品前处理固定液配方
固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液A液：二甲砷酸钠•3H2O 4.28g加双蒸水至100mlB液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A、B液以配制0.2M二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M二甲砷酸钠缓冲液Na2HPO4•2H2O 35.6gNa2HPO4•4H2O 53.63gNa2HPO4•7H2O 71.64g100mlB液：NaH2PO4溶液NaH2PO4 24.0g/ NaH2PO4 •H2O 27.6g/ NaH2PO4 •2H2O 31.21g 加双蒸水至100ml二、四氧化饿固定液1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜5内将安踣瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d.2、用0.1M磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液0.1M磷酸缓冲液5ml2%四氧化饿水溶液5ml三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液1、10%多聚甲醛水溶液多聚甲醛2g双蒸水20ml2、固定液配制0.2M磷酸缓冲液50ml25%戊二醛10ml 双蒸水加至100ml10%多聚甲醛水溶液20ml染色液配方一、超薄切片染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液硝酸铅 1.33g柠檬酸三钠 1.76g切片染色时间5-10min 双蒸水30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液醋酸双氧铀2g50%乙醇100ml切片染色时间15-30min（室温），延迟时间or提高温度可加反差NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
二、负染色液1、磷钨酸负染色液（PTA）磷钨酸1-2g双蒸水100ml2、醋酸双氧铀负染色醋酸双氧铀双蒸水3、钼酸铵负染色（AM）钼酸铵2g双蒸水。
扫描电镜细菌制样方法
细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。
(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入2.5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体,可在菌落外表滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。
将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。
(2)固定,脱水按常规方法。
2.5%戊二醛,2~4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4~6h→缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。
(3)临界点枯燥: 普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。
将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。
放入临界点枯燥器样品室,进展CO2临界点枯燥。
一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。
(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将枯燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。
碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。
离子溅射金后,即可进展扫描电镜观察。
细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌。
然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内参加适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h以上。
然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进展扫描电镜观察。
2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min，弃上清液，参加2.5%戊二醛固定2h，pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗，然后参加蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。
电镜观察固定方法
电镜观察固定方法固定：1、取材；取新鲜拟南芥组织2-3mm2或花苞，迅速放入约5ml固定液中（2.5%戊二醛），针筒抽气（抽干细胞液泡内空气）至材料沉入固定液（如抽气2小时，材料还没有沉入固定液中，可不用抽了）换液5ml戊二醛，4度冰箱中保存至少7天。
若效果不好，可在管口塞团棉花；漂洗：2、吸出固定液及悬浮未沉下的材料，用1ml磷酸缓冲液（4℃保存PH7.2）冲洗，每半小时一次反复3次，将花苞用小镊子分开；固定，染色：3、吸出磷酸缓冲液，加500ul锇酸（有毒，带手套，避光，用锡箔包裹；渗透力很弱，楼下加）过夜染色（打开抽湿机操作）；漂洗，脱水：4、磷酸缓冲液洗去锇酸，开始酒精脱水过程如下：30%10min 50%10min 70%10min 到70%酒精可存放至晴天脱水较好；（注意：以上均为4℃条件即放在冰上进行，以下几步都在室温下进行）80%15min 90%15min 95%15min 100%30min 100%30min（晴天秋季为宜）包埋:环氧丙烷20min 环氧丙烷20min 包埋剂：环氧丙烷1：3过夜，500ul(注意：100%乙醇和环氧丙烷在使用时，要提前用无水硫酸钠或无水硫酸铜过滤，除去里面水分)5、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比1：1），过夜；6、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比3：1），过夜；（以上包埋放在摇床上，以便均匀渗透）聚合7、在橡胶小板上加入纯包埋剂，用牙签把材料分别移入橡胶小板的空格内摆放整齐，一般放2个花苞，过夜。
（注意：多余的包埋剂置于4℃保存，防止凝固）8、直接把橡胶小板置于65℃条件下聚合48h；9、切片（先切厚片看看，以免重复切片，再切薄片）；10、染色：醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，双氧水漂洗1-2秒；（注意：染色期间不要说话，避免CO2造成切片污染）。
电镜材料固定方法
1、固定液固定（固定液体积是固定材料的十倍以上）
3%戊二醛in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存
（取材：先整个材料放入固定液中，之后用锋利的双面刀片分割，不能撕扯材料，分割成小块后1*1mm，置于固定液中，抽气~20min，让材料沉入固定液中）
2、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3、1%锇酸固定in 0.1M PBS，4°C overnight
4、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5、乙醇系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）
-80%-90%-95%-100%-100%（每级20-30分钟，不同材料时间不同）
注意：100%乙醇时不要吸干，防止材料干了。
用丙酮置换乙醇：
乙醇：丙酮=1：1，纯丙酮2次，每级20-30分钟
6、丙酮：树脂=2：1，1：1（可以停下了，overnight），1：2 2-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h （从进入树脂开始就要防潮！）
7、包埋
8、聚合60°C 24hr
注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in 0.1M PBS Ph 7.2。
扫描电镜样品制备程序
扫描电镜样品制备程序一、固定：戊二醛-锇酸双固定法1．2.5%戊二醛（试剂1）固定4小时（或者过夜）2．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15-30分钟3．1%锇酸（试剂3）固定2-4小时4．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15分钟二、脱水：乙醇系列1．30%乙醇15－20分钟2．50%乙醇15－20分钟3．70%乙醇15－20分钟4．80％乙醇15－20分钟5．90%乙醇15－20分钟6．95%乙醇15－20分钟7.100%乙醇两次每次15-20分钟三、置换：乙酸异戊酯2次，每次15分钟（或过夜）。
四、干燥：临界点干燥五、离子溅射金六、扫描电镜观察附注：试剂配置试剂1：2.5%戊二醛取0.2M磷酸氢二钠40.5mL（A液），0.2M磷酸二氢钠9.5mL（B液），混合均匀（即0.2M磷酸盐缓冲液pH7.4），加入10mL浓度为25%的戊二醛，用超纯水稀释至100mL。
试剂2：0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）A液：0.2M磷酸氢二钠称取3.561g Na2HPO4.2H2O（或者5.365g Na2HPO4.7H2O）; 或7.164g Na2HPO4.12H2O)，溶于100mL双蒸水中。
B液：0.2M磷酸二氢钠称取2.760g NaH2PO4.H2O（或者3.121g NaH2PO4.2H2O），溶于100mL双蒸水中。
量取A液36.0mL, B液14.0mL，混合均匀后用双蒸水稀释至100mL，得0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）。
试剂3：1%锇酸将2%的锇酸溶液与0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）等体积混合，得1%锇酸。
注意：该操作在通风橱中进行。
电镜制片
一．取材： 组织块小于1立方毫米 二．固定： 2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或 更长时间。 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次 1%锇酸固定液固定 2-3小时 用0.1M磷酸漂洗液漂洗 15分 三次
三．脱水： 50%乙醇 15-20分 70%乙醇 15-20分 90%乙醇 15-20分 90%乙醇 90%丙酮（1：1） 15-20分 90%丙酮 15-20分 以上在4度冰箱内进行 100%丙酮 室温 15-20分三 纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3-4小时 纯丙酮+包埋液（1：2）室温 过夜 纯包埋液 37度 2-3小时 五．固化： 37度烘箱内 过夜 45度烘箱内 12小时 60度烘箱内 24小时 六．超薄切片机切片 50-60 nm 七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色 八．透射电镜观察。拍片
包埋剂
环氧树脂(Epon)包埋剂: Epikote812 (Epon 812) 162ml DDSA(十二烷基琥珀酸酐)100ml(软化剂) MNA(甲基丙次甲基邻苯二甲酸 酐)89ml(硬化剂) DMP ～30(2,4,6,二甲氨基甲基苯酚) 3～ 4滴 60℃条件下,聚合48小时.
制刀机
半薄切片机
超薄切片机
透射电镜
电镜缓冲液、固定液、染液配方
固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液 A 液：二甲砷酸钠•3H 2O 4.28g加双蒸水至100ml B 液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M 二甲砷酸钠缓冲液0.1mol/L 磷酸缓冲液 A 液：Na 2HPO 4溶液 2.84g Na 2HPO 4 / 3.161g Na 2HPO 4 •H 2O / 3.56g Na 2HPO 4 •2H2O /5.363g Na 2HPO 4 •4H2O / 7.164g Na 2HPO 4 •7H2O加双蒸水至100mlB 液：NaH 2PO 4溶液 2.40g NaH 2PO 4/ 2.76g NaH 2PO 4 •H 2O/ 3.121g NaH 2PO 4 •2H 2O 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 磷酸缓冲液，加1倍双蒸水即得0.1M 磷酸缓冲液二、四氧化饿固定液 1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g 装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜内将安瓿瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d. 2、用0.1M 磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液 0.1M 磷酸缓冲液 5ml2%四氧化饿水溶液 5ml 三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液 1、10%多聚甲醛水溶液 多聚甲醛 2g 双蒸水 20ml 2、固定液配制0.2M 磷酸缓冲液 50ml25%戊二醛 10ml 双蒸水加至100ml 10%多聚甲醛水溶液 20ml染色液配方一、 透射电镜正染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液 硝酸铅 1.33g 柠檬酸三钠 1.76g 切片染色时间5-10min 双蒸水 30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO 2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃 2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液 醋酸双氧铀 2g 50%乙醇 100ml 切片染色时间15-30min （室温），延迟时间or 提高温度可加反差 NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
电镜样品处理流程
电镜样品处理流程电镜样品处理流程可以分为以下几个步骤：1. 采集样品：根据需要，选择合适的样品进行采集。
样品可以是细胞、组织、材料等。
2. 传统固定：将样品进行固定处理，以保持其形态和结构的稳定性。
常用的固定剂有冰乙酸、乙醛、戊二醛等。
3. 脱水：将固定后的样品通过浓度递增的酒精溶液进行脱水处理，以去除组织中的水分。
常用的脱水溶液有30%，50%，70%，95%，100%的酒精。
4. 渗透：将脱水后的样品通过有机溶剂（如丙烯酸甲酯，或Epon等）进行渗透，使其逐渐转变为切片时易于切割和观察的坚硬物质。
5. 嵌包：将渗透后的样品置于嵌包物（如丙烯酮），并放入模具中固定，以形成坚硬的嵌包样品块。
6. 切片：将嵌包样品块进行切片处理，常用的切片工具有超薄切片机。
7. 上网：将切片后的样品片置于网状金属网底上，并使用适当的胶水或聚合物将其固定在网上。
8. 吐壳：将样品上的嵌包剂和其他杂质去除，使样品表面清晰可见。
可以使用酶解等方法。
9. 染色：根据需要，对样品进行染色处理，以增加对比度和观察效果。
常用的染色剂有重金属盐、酸性着色剂等。
10. 干燥：将染色后的样品片在通风处晾干，以去除残留的溶剂和水分。
11. 金属蒸镀：将样品片放置于金属蒸镀设备中，进行金属蒸镀处理，以增加样品的导电性，以便观察。
12. 观察和拍摄：将样品片放置在电子显微镜中，利用电子束对样品进行观察，可以通过摄像机等设备进行图像记录。
13. 分析和解释：根据观察到的图像和结构，进行分析和解释，得出相关结论。
14. 保存和归档：将样品片进行妥善保管，以备将来的研究和参考之用。
电镜样品制作规程
透射电镜超薄切片样品制作常规
1.取材:规格:2mm粗细,10mm以下长条形;
2.缓冲液清洗:除尘，除杂质;
3.固定:2%～3%戊二醛,2hr以上;
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9.包埋: 纯包埋剂倒入包埋槽，样品定向放置其中；
10.聚合: 60℃，48hr；
11.修块:成金字塔形,顶部面积约0.2mm×0.2mm; 超薄切片:50～110nm,粘铜网；
12.醋酸铀染色,清洗:铜网样品面朝蜡板上的醋酸铀滴,避光漂染5~15min；
蒸馏水3×30次;
醋酸铀配方：50%乙醇：2%硝酸铀→配成1~3%饱和溶液；
13.柠檬酸铅染色,清洗:铜网样品面朝蜡板上的柠檬酸铅滴,避光漂染5~10min；
0.01%NaOH 30次, 蒸馏水3×30次;
柠檬酸铅配方：硝酸铅︰柠檬酸钠︰蒸馏水（去CO2）=1.33g︰1.76g︰30ml；振荡；
加1N NaOH 5ml；加双蒸水至50ml；
扫描电镜样品制作常规
1．取材: 规格:不超过样品台大小；
2．缓冲液清洗: 除尘，除杂质；
3．固定:2%～3%戊二醛,2hr以上;
4．清洗: PBS缓冲液（或双蒸水），10mi n×3；
5．梯度乙醇脱水
50%、70%、80%、90%各15min；
100% 30min×3；
6. 置换：叔丁醇30 mi n×3；
7．冷冻干燥：叔丁醇淹没样品，置冷冻干燥机，干燥2~3hr；8．粘样：将样品以方便观察的体位粘于样品台上；
9．镀膜：离子溅射仪镀膜120s，约10nm；。
电镜样本制备原理
电镜样本制备原理
1.固定：将取下的组织块及时投入
2.5%戊二醛固定液中，以固定细胞的形态。
这一步非常重要，因为固定液可以迅速凝固组织中的蛋白质和核酸，从而保持细胞的原有结构和功能。
2.脱水：将固定好的组织块进行脱水处理，通常使用乙醇或丙酮进行脱水。
脱水可以使组织块变硬，以便于进行后续的包埋和切片操作。
3.包埋：将脱水后的组织块放入包埋剂中，经过加热等处理后，使包埋剂凝固，将组织块固定在其中。
包埋剂的硬度适中，可以确保切片时能够切出较薄的样品。
4.切片：使用超薄切片机将包埋的组织块切成薄片，通常厚度在40-50纳米之间。
切片的厚度和质量对于后续的观察和鉴定非常重要，因此需要非常精细的操作。
5.染色：将切好的薄片放在载玻片上，用染色液进行染色，以增强细胞的对比度和结构细节的可见度。
这一步是为了使细胞的结构更加清晰，以便于在电镜下观察。
6.电镜观察：将染色后的薄片放入电镜中观察，可以使用透射电镜或扫描电镜进行观察。
在电镜下，可以观察到细胞的超微结构和细节，如细胞膜、细胞器、细胞核等。
总的来说，电镜样本制备原理需要经过多个步骤，每个步骤都需要严格的操作和质量控制，以确保最终观察到的细胞结构和功能的准确性。
扫描电镜 样品制备方法
扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。
二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。
用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。
三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。
＊整个过程，样品不要暴露于空气。
1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。
四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。
五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。
用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。
玻片过大或者过厚影响观察效果。
2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。
3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。
离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。
样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。
4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。
将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。
（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。
5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。
磷酸盐缓冲液(PBS)a.磷酸盐缓冲液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液0.2M磷酸盐缓冲液的配制将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。
透射电镜标本制备方法
透射电镜样品制备方法透射电镜的样品制备方法，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞器自溶现象。
因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。
（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。
（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm，取样形状为牙签状。
也可将组织修成1mm*1mm*2-5mm大小长条形。
因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
推荐使用手术刀或双面刀片。
（4）操作最好在低温（0℃—4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
（5）取材部位要准确。
切片窗小于1mm*1mm，如取样带有太多的多余组织，可能造成你需要的部分刚好被修掉。
二．取材方法（按照自己的样品类型检索）1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5 ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官。
用手术刀切割取一小块组织，放在干净的硬质板上（例如培养皿底部），滴一滴冷却的固定液。
用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1 mm宽，3~5 mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条（牵拉损伤将直接破坏组织，切取时刀片下压，不要来回拉锯），用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5 ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）4小时或以上。
*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。
送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。
送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。
后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。
透射电镜固定液的选择和配方
固定液的选择和配方：1、缓冲液的配制：在配制固定液之前，应先配制缓冲液。
0.2M磷酸缓冲液的配制：磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g重蒸馏水加至500ml调pH至7.42 (灌注)固定液的配制4%多聚甲醛用0.2M磷酸缓冲液配制，重蒸馏水补足容积。
4%多聚甲醛+（0.5-2%）戊二醛，以4%多聚甲醛+1%戊二醛为例，配方如下：0.2M磷酸缓冲液的配制 100ml25%戊二醛（电镜专用） 4ml重蒸馏水加到200ml多聚甲醛和戊二醛混合固定液：1.4%多聚甲醛+5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加10 ml 25%戊二醛，再加15 ml 0.2 PB,调pH备用。
此固定液中含多聚甲醛4%，戊二醛5%，属高渗液，但固定效果不错，尤其对细胞内的微管保存较好。
2.2%多聚甲醛+2%戊二醛：溶解1g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加4 ml 25%戊二醛，再加21 ml 0.2 PB,调pH备用。
常规固定选用这种配方。
3.4%多聚甲醛+0.5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加1 ml 25%戊二醛，再加24 ml 0.2 PB,调pH备用。
推荐用作免疫电镜标本固定剂，对于抗原较强的标本，可将浓度降低到2%多聚甲醛+0.25%戊二醛。
注意：多聚甲醛一瓶几十元，电镜专用戊二醛200左右，二者价格差距太大，因此，对于较大的动物要做电镜，灌注固定，则选择4%多聚甲醛+（0.5-2%）戊二醛的混合固定液，这两种固定剂优缺点可以互相补充。
多聚甲醛与戊二醛相比，其渗透力强、固定迅速、价格低廉，它对细胞基质保存不如戊二醛，但对酶的活性保存好。
电镜样品制备标准方法
电镜样品制备标准方法
试剂
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液，pH 7.2
甲液：
Na2HPO4·2H2O 35.61 g 或Na2HPO4·12H2O 71.64 g
加双蒸水到1000 mL
乙液：
NaH2PO4·H2O 27.60 g 或NaH2PO4·2H2O 31.21 g
加双蒸水到1000 mL
甲液360 mL
乙液140 mL
0.1 mol/ L磷酸盐缓冲液（PBS工作液，pH 7.2）
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液250 mL
加双蒸水到500 mL
2.5 % 戊二醛固定液
25 %（m/v）戊二醛水溶液10 mL
0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液，pH 7.2 50 mL
加双蒸水到40 mL
实验流程
一．取材与固定
单层培养细胞或悬浮培养细胞样品
1.3000 rpm离心5 min，收集细胞样品，尽量多的吸弃培养液上清（注意若是
贴壁细胞请用胰酶消化细胞）。
2.加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4 min，3000 rpm离心5 min，吸
弃上清。
3.重复步骤2两次。
4.加入预冷的血清，充分吹吸混匀，3000 rpm离心10 min，吸弃大部分上清，
留少部分（大约3-5mm），吹吸悬浮沉淀细胞。
（或离心后吸弃上清，留少部分上清，不悬浮沉淀细胞，视样品浓度而定）
5.沿着EP管壁缓慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定过夜。
扫描电镜制样及观察
扫描电镜1.固定：用2.5%（动物）或4%（植物）戊二醛固定液于4℃下固定6h以上（昆虫样也可以：选用卡诺固定液固定12h保存于70%酒精或波恩式固定液固定4-24h），然后转到70%酒精的标本，在解剖镜下解剖，得到自己所要观察的结构。
注：如材料中有空气不能沉入固定液时，则在真空泵下抽气至样品沉入瓶底。
2.清洗：PBS(0.1mol/L磷酸缓冲液)漂洗三次，每次5-10min (视材料的厚薄而定)。
依据研究部位、结构的不同在用超声波清洗仪中清洗，一般20s-10 min 不等。
PBS漂洗的目的是洗去残留的戊二醛，防止戊二醛的存在与下一步的俄酸固定液发生反应而影响固定效果。
3.后固定：在用1%锇酸固定2小时（需放入4℃冰箱中）（此步可以省略。
）。
4.清洗：如果用锇酸固定了，就要用PBS漂洗三次，每次5-10min。
5.脱水和酒精：在10％、30%、50％、70％、80％、90％、95％的酒精浓度梯度液中逐级脱水各10-20 min，100％两次，每次20-30 min（可保存于70%酒精过夜）；在25％、50％、75％叔丁醇浓度梯度液中逐级脱酒精各15min （叔丁醇浓度梯度：无水酒精和叔丁醇体积比是3:1；1:1；1:3，目的是脱酒精），纯叔丁醇30-40 min。
6.冷冻干燥：纯叔丁醇加入放有样品的样品仓，注意加入纯叔丁醇要没过样品，干燥约3h。
7.粘台：将干燥后的样品利用双面导电胶在显微镜下粘到样品台上。
8.喷金：在真空喷涂仪内喷金。
9.观察与照相：在S-3400N型电子显微镜（加速电压5-15KV）下观察并数码拍照。
注意：1）卡诺氏固定液(Carnoy's Fluid)：配方（v/v）：3份无水酒精：1份冰醋酸适用于一般植物组织和细胞的固定，常用于根尖，花药压片及子房石蜡切片等。
有极快的渗透力，根尖材料固定15-20min即可，花药则需1h左右，此液固定最多不超过24h，固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止；如果材料不马上用，需转入70%酒精中保存。
电镜材料固定方法
电镜材料固定方法
1、固定液固定（固定液体积是固定材料的十倍以上）
3%戊二醛in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存
（取材：先整个材料放入固定液中，之后用锋利的双面刀片分割，不能撕扯材料，分割成小块后1*1mm，置于固定液中，抽气~20min，让材料沉入固定液中）
2、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3、1%锇酸固定in 0.1M PBS，4°C overnight
4、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5、乙醇系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）
-80%-90%-95%-100%-100%（每级20-30分钟，不同材料时间不同）
注意：100%乙醇时不要吸干，防止材料干了。
用丙酮置换乙醇：
乙醇：丙酮=1：1，纯丙酮2次，每级20-30分钟
6、丙酮：树脂=2：1，1：1（可以停下了，overnight），1：2 2-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h （从进入树脂开始就要防潮！）
7、包埋
8、聚合60°C 24hr
注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in 0.1M PBS Ph 7.2。
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固定方法：现在磷酸戊二醛固定液中固定24小时，然后换用新的磷酸戊二醛缓冲液永久固定
工具：手术刀两把，镊子两把，锋利的刀片，100ml蓝盖瓶8个
根茎叶取样：最后成熟稳定期取野生型和突变型的根茎叶组织
根：野生型和突变型取相同部位根的相同部位，根尖偏上部位
茎：野生型和突变型取茎相同节间的中间部位（例如第5节茎中间部位），用锋利的刀片切成1cm×0.2cm方块
叶：野生型和突变型取相同叶片的相同部位（例如第5片叶的中间部位），3cm×1cm
磷缓戊二醛固定液：以下两步配成
一、磷酸盐缓冲液配方
A液：0.2M磷酸氢二钠贮备液
磷酸氢二钠Na2HPO4·2H2O 35.61g
或Na2HPO4·7H2O 53.65g
或Na2HPO4·12H2O 71.64g
加双蒸水至1000ml
籽粒取样:
大粒野生型和小粒突变型授粉后分三个时期取样：5天，15天，35天
取样部位：野生型和突变型三个时期各自选取三株，每株取穗轴中部籽粒5-10粒
取样方法：将各个时期所取籽粒的左右两侧和上下两头切掉一部分，留中间部位，切成0.5cm×0.2cm大小（另外可以将各个时期取的样品保留3-5粒种子完整不切开存放在固定液）
B液：0.2M磷酸二氢钠贮备液
磷酸二氢钠NaH2PO4·H2O 27.60g
或NaH2PO4·2H2O 31.21g
加双蒸水至1000ml
C液：0.2M磷酸盐缓冲液:
pH(25℃)
A液
B液
7.2
36ml
14ml
二、磷缓戊二醛固定液配方
C液50mlPH
25%戊二醛溶液10ml 7.2
ห้องสมุดไป่ตู้加蒸馏水至100ml 7.2