乳腺癌基因治疗的研究进展

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存在的问题 ？
目的基因的表达不受控制，存在过度 表达或不适当表达，特别是当插入基 因是一些毒性的基因或对机体有影响 时，不仅对疾病的治疗不利，甚至会 导致致命的副作用。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第三节 乳腺癌自杀基因调控治疗
特异性的转录调控元件使治疗基因准 确、有效地表达于肿瘤细胞，使治疗 基因的表达受体外因素的调控，提高 基因治疗的有效性和可控性，是基因 治疗领域的一个重要问题。
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Dox 浓度对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞生长的影响
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Cell number (1x10 4 cells/ml)
8 7 6 5 4 3 2 1 0
0 200 400 600 800 1000 1200 1500
Doxcycline concentration (ng/ml)
图 5 GCV 浓度为 1 μg/ml 时，不同浓度 Dox 对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活数的影响
Clinical trials of p53 gene replacement have had limited success ;
PTEN expression alters metastatic potential
and reduces neovascularization
6
Prospects
抗血管生成基因治疗
抗血管生成基因的因子包括内皮抑素、血管抑素 和干扰素-α。基于肿瘤和正常内皮细胞之间基因 表达的差异，选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基 因的表达，抑制肿瘤血管生成，从而达到治疗肿 瘤的目的。 最强的血管生成细胞因子是VEGF。反义核酸， 可溶性VEGFR、核糖酶、抗VECF单克隆抗体和 受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂已被用于抗肿瘤 血管生成的基因治疗。
•药物前体激活基因治疗（GPAT）可以利用正常和肿瘤
细胞之间的某一基因转录差异，选择性驱动表达导入肿 瘤细胞内的无活性化疗药物前体转化为有活性的代谢产 物，特异性杀伤肿瘤细胞。 •氟脲类药物对乳腺癌有杀伤作用，但5-氟胞嘧啶核苷酸 （5-FC）作为药物前体，对细胞无杀伤作用，而它在嘧 啶脱氨酶的转化下，可代谢为有活性的5-FU（5-氟尿嘧 啶）而具有杀伤肿瘤细胞的能力。
The ability to induce growth arrest and apoptosis
Downstream targets of p53 and Rb is necessary Clinical trials of second-generation oncolytic viruses
Combinations of tumour suppressor genes
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RT-PCR 检测 SCID小鼠肿瘤组织 HSVtk的表达
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乳腺癌抗体治疗
单克隆抗体 Herceptin(贺赛汀) 针对HER-2/neu原癌 基因的人/鼠嵌合单 抗，与细胞表面的 erb-B2受体结合,抑 制乳腺癌细胞的生长, 产生抗体依赖细胞介 导的细胞毒作用。
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免疫基因治疗
•指在基因水平，通过诱发或加强机体内针对肿
瘤细胞表面的肿瘤相关抗原（TAAs）的特异性 免疫反应，调动宿主的免疫系统来识别并破坏 癌细胞。 •乳腺癌组织表达多种TAAs，包括HER-2/neu（ c-er -2）、MACG-1和MUC-1等，机体针对这些 TAAs产生一定的特异性体液和细胞免疫反应。
图 2 重组质粒pRevTRE/tk 的PCR鉴定结果
M: 100bp DNA ladder Marker; lane 1: PCR product with primer TK1 and TK2; lane 2: PCR product with primer TK3 and TK4
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MCF-7细胞转染实验
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重组逆转录病毒载体 pRevTRE/tk的构建
PCR 扩增获得 HSVtk 基因 DNA 片段，设 计引物时，在 引物 TK1 的 5’ 加上BamHⅠ酶 切位点，引物 TK2 的 5 ’加上 Hind Ⅲ 酶切 位点，定向克 隆到pRevTRE 质粒上, 得到 pRevTRE/tk质 粒。
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克隆计数(均值 ±SE)
36.0±0. 81
34.0±0. 4.5±0.6 81 5
5.0±0. 71
5.0±0.58 3.5±0.5 0
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可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立
以表达 HSVtk基因及调控系统 Tet-On 的 乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 直接接种 SCID 小鼠成功建立了可调控性自杀基因乳 腺癌动物模型，为探讨自杀基因体外调控 机制的研究奠定了基础。
Tet 系统利用大肠杆菌抗 四环素操纵子 的阻遏与去 阻遏作用来调控基因表达， 使基因表达受四环素的精 确调控。Tet 激活系统 （Tet-On）是突变的 tet 阻遏蛋白与 VP16 的激活 域融合表达 rtTA , 强力霉 素存在时，rtTA 与 tetOp 结合，激活靶向转 录。
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Tet-On 调节乳腺癌细胞株 HSVtk 表达及 体外调控性治疗作用的实验研究
肿瘤抑癌基因治疗
•野生型p53基因具有通过调控视网膜母细胞瘤基因控
制细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用。但是，由于乳腺 癌细胞中p53易突变而失活，影响了p53基因治疗乳腺 癌应用。在乳腺癌家族中发现抑癌基因BRCA1常存在 突变而表达过低。 •在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体， 直接注射入瘤内，可抑制晚期乳腺癌胸壁转移瘤的生 长。
世界大多数地区的发病率有逐年增
高的趋势，现已成为女性发病率最
高的恶性肿瘤。
2
乳腺癌的危险因素：
(1)与发育、激素水平有关 (2)与营养膳食有关 (3)与家族史和基因改变遗传因素有关 a. 抑癌基因失活 b. 癌基因异常 (4) 其它危险因素
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乳腺癌肿瘤治疗模式
手术、放疗、化疗、激素治疗是肿瘤治疗的 常规模式。这些治疗方法常难彻底消灭肿瘤 细胞又易伤及正常组织，特别是伤害机体的 免疫系统。目前肿瘤的基因治疗日益受到人 们的重视，显示出良好的应用前景。
图 3 Dox 调节 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞中 HSVtk 基因的表达 M: 100 bp DNA Marker; Lane 1-6代表 Dox 浓度为0，0.1，1，10，100, 1000 μg/ml时细胞 HSVtk 基因的表达
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MTT 法检测分析 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率
MCF/TRE/tk/Tet-On
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Tet-On 基因调控系统中，其发挥作用所需 的两个组成元件：TRE 元件和rtTA 元件， 分别克隆于两个载体系统中。使用时先将 含有TRE元件和目的基因转染入宿主细胞， 然后再以含有 rtTA 的质粒转染该细胞， 经过两次转染而构建出细胞株。
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MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞 HSVtk 基因的表达
化学基因治疗
• 将耐药基因，如多药耐药基因（MDR）转入造血干细胞
，然后自体回输以增加化疗药物剂量，增强疗效，也不影 响机体的造血系统。 • Cowan等将4例乳腺癌病人的造血细胞提取后，体外转 染MDR基因，并且在体外应用大剂量化学药物杀死可能污 染的肿瘤细胞后，将转染了MDR的造血细胞自身移植。给 予大剂量的化学药物治疗后，3例病人移植细胞中仍可检 测到MDR的表达，转染MDR的细胞存活率与骨髓抑制成反 比，无严重毒副作用发生。
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乳腺癌基因治疗的调控元件
1)乳腺癌相关基因：erbB-2、Muc-1、 p53、BRCA1、BRCA2、nm23、p16等；
2)组织特异性基因:雌激素反应元件 (ERE)、人α乳白蛋白基因(hALA)、羊乳 球蛋白基因(oBLG)等；
3)缺氧反应元件(HRE)等。
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Tet 基因表达调控系统
乳腺癌基因治疗研究进展
The research progress of human breast cancer gene therapy
曾
赵
军
中南大学生物科学与技术学院 分子生物学系
第一节 乳腺癌基因治疗研究背景
乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性 肿瘤。据国际抗癌协会（ IARC ） 公布的统计资料表明，乳腺癌在全
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SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化
图 6 乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 接种 SCID小鼠后， NS组、GCV组、GCV+Dox组 SCID小鼠肿瘤体积的变化
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SCID小鼠肿瘤组织病理学观察
图 7 三组 （NS组、GCV组、GCV+Dox组）SCID 乳腺癌小鼠 经治疗15天后肿瘤组织病理学观察 H-E染色（×250） A. NS 对照组; B. GCV 治疗组; C. Dox+GCV 治疗组
目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原包括HER-2、CEA、 MAGE-1、MUC-1等。 • 采用基因工程将编码这些抗原的基因修饰后，克隆到逆 病毒载体，转入体内；或在体外采用基因工程，将这些抗 原的不同抗原簇克隆，产生不同抗体，筛选出能抑制肿瘤 细胞生长的抗体。 • 赫赛汀（Herceptin）就是针对c-er-2细胞外区域不同抗 原簇的人单克隆抗体。它可有效抑制c-er-2的下游信号传 导，从而抑制乳腺癌细胞的生长。
重组逆转录病毒载体 pRevTRE/tk的鉴定
M 1 2
图 1 重组质粒 pRevTRE/tk的 酶切鉴定结果
M: λDNA/ Hind Ⅲ DNA Marker lane 1: pRevTRE/HSVtk / Bam HI + Hind Ⅲ; lane 2: pRevTRE/HSVtk plasmid DNA
将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直 接在体内转染到肿瘤细胞内，或在体外 将这些基因转染到肿瘤细胞内，在肿瘤 细胞经放射线照射灭活后，自身移植于 体内，以增强免疫反应。包括IL-2、IL-
12、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激
因子（GM-CSF）等。
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特异性靶抗原的免疫治疗
• 采用特异的靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应更有效。
1.2
Cell Survival（％）
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
1
0.374 0.28 0.15 0.11
1000
0
GCV Concentration（ng/ml）
1
10
100
图 4 在 Dox 浓度为 1μg/ml 时，MTT 法检测 GCV不 同浓度时 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率的变化
化合物中筛选出一种名为维生素B17的化合 物。维生素B17可以通过竞争性结合ATP， 不可逆地抑制c-er -2活性，而不影响其蛋白 表达。动物实验表明，维生素B17可使c-er 2过度表达的乳腺癌肿瘤缩小。
显性基因敲除治疗
敲除显性的癌基因，削弱肿瘤的生长和浸润 能力。研究表明，一种myc反义核酸对雌激 素依赖型和非依赖型乳腺癌细胞均有抑制作 用，转化生长因子α（TNF-α）的反义信使 RNA能够抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳 腺癌细胞的增殖。
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第二节 乳腺癌自杀基因治疗的 概念、内容与特点
乳腺癌发病的分子机理主要有两个方面： 第一、基因表达异常。
最常见的基因表达异常是 cyclin D1 、 neu 和 ras、c-myc 或 Wnt-1 原癌基因过表达。
第二、基因结构改变。 包括染色体缺失与基因扩增。
5
Breast cancer gene therapy using tumour suppressor genes
自杀基因治疗乳腺癌的作用机理
乳腺癌细胞 直接杀伤癌细胞
病毒蛋白 病毒载体 通过旁观者效 应杀伤癌细胞 药物前体
自杀基因
毒性代谢物
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自杀基因 HSVtk 编码胸腺嘧啶激酶，在 细胞内，自杀基因HSVtk 能将核苷类似 物 GCV 磷酸化，使其进一步代谢为三磷 酸 GCV，抑制细胞 DNA 聚合酶，影响 DNA合成，导致细胞死亡，达到清除肿 瘤的目的。
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旁观者效应
表 1 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞旁观者效应的克隆记数
1组 (n=4) 2组 (n=4) 3组 (n=4) 4组 (n=4) 5组 (n=4) 6组 (n=4)
MCF-7
100%
95% 5%
90% 10%
75% 25%
50% 50%
0% 100%
MCF/TRE/tk/Tet- 0% On