020细胞工程-第二章 清洗与消毒
细胞工程复习提纲
细胞工程复习提纲绪论名词：细胞工程：细胞工程是按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。
第1章细胞培养的设施与基本条件1.细胞工程实验室的要求和基本设置（无菌，6方面工作）要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。
六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。
2.动植物细胞工程实验室的设置1. 动物细胞工程实验室的设置(1) 无菌操作室无菌操作室是相对密封、防尘、防菌的工作空间。
理想的无菌操作室应划分为更衣间、缓冲间及操作间三部分。
(2) 培养与观察室(3) 制备室：在该区主要进行培养液及有关培养用液体等的制备。
(4) 储藏室(5) 清洗和灭菌室2. 植物细胞工程实验室的设置(1) 无菌操作室(2) 培养室(3) 鉴定室(4) 清洗室(5) 灭菌室(6) 制备室(7) 驯化移植室3.常用设备1. 动物与植物细胞工程实验室通用的仪器设备(1) 超净工作台(2) 倒置显微镜(3) 电热干燥箱(4) 水纯化装置(5) 冰箱(6) 压力蒸汽消毒器(7) 细胞计数板和电子细胞计数仪(8) 过滤除菌装置(9) 离心机(10) 移液管和吸管(11) 离心管(12) 移液器(13) 天平2. 动物细胞工程实验室的常用仪器设备(1) 培养箱(2) 显微操作仪(3) 细胞融合仪(4) 细胞冷冻储存器(5) 培养用器皿(6) 手术器械3. 植物细胞工程实验室的常用仪器设备(1) 光照培养箱(2) 人工气候室(3) 摇床(4) 培养瓶第2章清洗与消毒1.玻璃器皿清洗步骤及要求一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质。
2.常用的物理灭菌(1) 紫外线消毒紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能使用其他方法进行消毒的器皿。
紫外线的直接作用机制是通过破坏微生物的核酸和蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。
细胞培养用具的清洗、消毒方法
细胞培养用品的清洗与消毒v2.0一、清洗1、玻璃类流程：浸泡→刷洗和烘干→浸酸→冲洗要求：清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹，水滴不成股流下具体操作：新买：5%稀盐酸浸泡过夜1→自来水冲洗→洗洁精刷洗2→自来水冲洗（晾干或烘干50℃）→浸酸（一天一夜）3~4→自来水冲洗25遍→蒸馏水洗5次→双蒸水洗3次（或再用单蒸水冲洗5次）→干热灭菌（将温度升至150℃后关闭烘箱密闭3h，待冷却至常温）6→待使用已用：用后马上浸入洗洁精中浸泡一天7（带毒应浸入消毒水）→洗涤剂刷洗后自来水冲洗（晾干或烘干50℃）→浸酸（一天一夜）→自来水冲洗25遍→蒸馏水洗5次→双蒸水洗3次（或再用单蒸水冲洗5次）→干热灭菌（将温度升至150℃后关闭烘箱密闭3h，待冷却至常温）→待使用注意：1. 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等,用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质2.刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度3.清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。
浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面4.浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时5.最好用洗涤装置如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5次，晾干（或烘干）备用6.或高压蒸汽灭菌（湿热法），容器水分烘干→牛皮纸包内、报纸包外将容器口扎紧→121℃，30min高压灭菌→待使用7.用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面2、塑料类具体操作：新买：一次性无菌塑料制品打开包装即可使用已用：用后立即用流水冲洗→洗涤剂浸泡3小时后刷洗（用纱布或棉签）→自来水冲洗→5%稀盐酸浸泡过夜→双蒸水煮沸2~3次（10min/次）→包装烘干（50℃）→待使用3、橡胶类具体操作：新买/已用：用后立即用流水冲洗→洗涤剂浸泡3小时后刷洗（用纱布或棉签）→自来水冲洗→5%稀盐酸浸泡过夜→双蒸水煮沸2~3次（10min/次）→包装烘干（50℃）→待使用4、镊子、剪刀具体操作：洗涤剂刷洗→自来水冲洗5~6次→75%医用酒精浸泡3小时→酒精棉球1擦拭→待使用注意：1.酒精棉球应用双蒸水配置5、不锈钢除菌滤器具体操作：洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15min→蒸馏水冲洗2~3次（或浸泡24h）→三蒸水冲洗2~3次（或24小时）→干燥→备用6、金属滤网具体操作：自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗→干燥→备用二、消毒1.紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。
细胞工程课后题答案
第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术1、目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？1）MS培养基特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。
2）5B培养基其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。
3）White培养基其特点是无机盐数量较低，适于生根培养N培养基其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。
4）65）KM8P培养基其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。
2、简要说明MS培养基的基本组成。
1）大量元素母液配制MS培养基的大量元素主要包括硝酸铵（NH4NO3）、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、硫酸镁（MgSO4•7H2O）和氯化钙（CaCl2,CaCl2•2H2O）五种化合物。
2）微量元素母液配制MS培养基的微量元素由7种化合物（除Fe外）。
3）铁盐母液配制MS培养基中的铁盐是硫酸亚铁（FeSO4•4H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2•EDTA）的螯合物，必须单独配成母液。
4）有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、烟酸硫胺素和盐酸吡哆素。
5）激素母液配制MS培养基中的激素有生长素类、细胞分裂素3、配制培养基时，为什么要先配制母液？如何配制母液？为了避免每次配制时都要称量各种化学药品，常常把培养中必需的一些化学药品，以10倍、50倍或100倍的量，配制成一种浓缩液，这种浓缩液被称为母液。
配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移去，而且还便于低温保藏。
确定培养基--按照扩大倍数称量--溶解--按顺序混合--定容--母液分装--贴标签--保存于冰箱。
大量元素应配成浓度为10倍的母液，--般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。
配置时化合物应分别称量，分别溶解;混合时注意先后顺序，防止产生沉淀;混合时要边搅拌边混合。
4、常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？（一）物理灭菌1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。
细胞工程实验教程讲义2012
实验一清洗与灭菌[实验目的]能独立进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与灭菌，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法等操作技术，了解化学灭菌法的使用方法。
了解各种物理及化学消毒和灭菌的原理和适用范围。
为了维持细胞在体外长时间的生长繁殖，器具应严格洗净并用高压或干烤灭菌，对不能高压和干烤的培养液等，可用除菌漏斗过滤除菌。
维持细胞在体外生长的操作环境一般在无菌室(密闭、紫外线杀菌)进行；近年来多应用洁净工作台，借助空气过滤和高速吹风使细菌不能下落，也有两者结合使用的。
操作人员的手必须洗净和消毒。
为保证培养基的无菌条件，一般在培养基中加入青霉素100u∕mL、链霉素100μg∕mL。
也有人认为抗菌素具有毒性和抗药性而不加，这就需要更严格的无菌操作技术。
清洗与灭菌是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大的、最基本的步骤，也是其他组织培养实验成功的前提。
体外培养细胞对所使用的各种玻璃或塑料器皿的清洁和无菌要求程度很高。
细胞培养不好很多时候与清洗不彻底有关。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任伺物质。
一些有毒的化学物质，哪怕残留0.1μg，也可能影响细胞生长。
无菌操作是保障细胞培养成功的关键因素，为此所用的全部器具必须保证无菌，操作过程不能带人任何细菌和其他微生物，这是维持细胞生存的基本条件。
灭菌与消毒在概念上是不同的，消毒只要求杀灭或清除环境中的致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病，或者说使其无害化。
灭菌不仅要求杀灭或清除致病微生物，还要求将包括非致病微生物在内的所有微生物全部杀灭或清除掉，这包括细菌、病毒、真菌、支原体和衣原体，也包括抵抗力极强的细菌芽孢等，以达到无菌的目的。
所以灭菌比消毒要求更高。
总之，消毒只要求场所与物品达到微生物很低密度的水平，而灭菌则要求达到没有一个活菌存在。
“灭菌”可以达到消毒的目的，但消毒不一定能达到灭菌的效果。
在细胞和组织培养工作中，灭菌与消毒分别应用于不同的场所和对象。
《细胞工程》实验一 器材的清洗、包装、消毒与灭菌ppt课件
烤干75 ℃,1 h
待包装：吸管塞棉花，装好
待高压灭菌 备用
塑料器材
浸泡 超声波加洗涤剂清洗
清洗
注意事项
塑料培养板主要为一次性商品，仍可经过清 洗和消毒灭菌重复使用
冲洗干净
清洁液浸泡 过夜（12h） 自来水冲洗15次 去离子水冲洗3次
使用后应立即投入清水中浸泡
烤干
紫外线或辐射灭菌备用
橡皮器材
浸泡 洗涤剂刷洗，冲洗干净
清洗
注意事项 5%NaOH煮10 -20min , 冲洗干净 4%盐酸煮10 -20min 自来水冲洗8-10次
胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，用刷 逐个刷洗
去离子水冲洗3次
晾干备用
金属器材
纸擦去表面的油脂
清洗
洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠煮沸15min 水洗 95%酒精纱布擦干待包装灭菌源自包装常用包装器材：
4.消毒完毕，待压力指针降至零位，等数分钟后， 打开消毒器盖
压力蒸汽指示胶带
【结构与性能】压力蒸汽灭菌化学指示胶带，将特殊热敏化学染料与显 色剂及其辅料制成油墨，以斜形条纹或＾形状印制在特制的胶纸上制成；在 一定温度压力的饱和蒸汽作用下，经过一个灭菌周期处理后，指示剂变成灰 黑色或黑色；灭菌后的颜色不易褪色。 【使用范围】压力蒸汽灭菌化学指示胶带可适应各种型号压力蒸汽灭菌 器，用于固定物品包或标示物品包（或容器）是否已经过灭菌处理过程。 【使用方法】截取适当长度的压力蒸汽灭菌化学指示胶带，黏贴在待灭 菌物品包外，放入120℃下排汽压力灭菌器中20分钟，或放入132℃预真空 压力灭菌器中3.5分钟，胶带上指示剂由浅黄色变为灰黑色或黑色，表明灭 菌过程符合要求。 【注意事项】不要将压力蒸汽灭菌指示胶带与易形成冷凝水的金属，玻 璃等硬质表面直接接触，以防被冷凝水浸湿，使化学指示胶带的热敏化学染 料失去准确性。 【保存方法】贮存于避光，室温15℃~30℃和50%相对湿度，避免接触 腐蚀性气体。 【有效期】自生产日期起24个月。
实验1 细胞实验技术简介 细胞培养常用器械的清洗与消毒
实验一、细胞实验简介及细胞培养常用器械的清洗与消毒
一、实验室的消毒灭菌与维护
1.窗帘拆下清洗晒干后挂上。
2.缓冲间和细胞间所有的仪器、设备表面里面均用抹布先擦干净后再用75%酒精擦拭。
3.细胞间往有灭菌锅的门缝用透明胶全部封口上。
4.缓冲间和细胞间地板用清洁剂擦洗干净后，再用消毒水擦两次。
5.缓冲间和细胞间开紫外灯半个小时。
6. 实验室日常管理：固定4个同学来做实验室管理人员，2人为1小组，轮流值班。
（1）每天用消毒水擦地板和实验桌面一次；
（2）开紫外灯半个小时；
（3）检查培养箱的温度、湿度、二氧化碳情况；
（4）协助老师准备实验。
二、培养用品的清洗、包装和灭菌按教材21页。
细胞工程实验指导书
实验指导书课程：细胞工程讲课专业：生物工程、生物技术主编：徐艳实验一实验室的概况与培育基母液的配制一、实验目的：熟悉植物细胞工程实验室的大体结构、必需的大体设备及其用途与作用方式，把握配制培育基母液的大体技术。
二、材料与用具：一、药品：生长调剂类物质、无机盐类、有机化合物等。
二、用具：分析天平、移液管、量筒、培育瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。
三、教学时数：4课时。
四、实验内容：（一）实验室的大体结构及要紧设备：一、洗涤室：水槽、工作台、蒸馏水器等功能：器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。
二、消毒室：高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能：器皿的干燥；器皿及培育基的消毒。
3、试剂室：试剂柜、冰箱功能：寄存试剂及器皿。
4、预备室：工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各类玻璃仪器、金属仪器等功能：培育基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处置；培育材料的观看分析。
五、接种室（含缓冲室）：超净工作台、接种箱等功能：无菌操作。
6、培育室：培育架、摇床等功能：培育物的操纵培育。
7、驯化移栽室：如温室、大棚等功能：试管苗的驯化移栽。
（二）培育基母液的配制：一、MS大体培育基母液：各成份单独称量、单独溶解后混合定容①大量元素母液：10倍，1L注意：易与其他成份反映产生沉淀；②微量元素母液：100倍，0.5L③铁盐母液：100倍，0.5L注意：二者等体积溶解后混合，且需80℃水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；④有机母液：100倍，0.5L①1mg/ml的6－BA 50ml：先用∕L的 HCL或NaOH溶解后再加水定容；②ml的NAA 50ml：先用少量∕L的NaOH溶解后再加水定容。
注：精度要求精准到小数点后三位。
（三）培育器皿的洗涤：一、对污染的培育器皿先进行消毒灭菌处置；二、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时；3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净；4、用烘箱烘干或晾干，寄存于防尘橱内备用。
二、试剂标签：例：实验二 培育基的配制与灭菌一、实验目的：了解培育基灭菌的原理，熟悉培育基的组成和要求，把握固体培育基配制和灭菌的大体技术。
动物细胞工程试验讲义(学生版)
实验一细胞培养用品的清洗、消毒与灭菌体外人工培养的细胞缺乏抗感染能力，所以能否防止污染是决定培养成败的关键。
即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致细胞污染。
无菌技术原理是阻止无菌的、未被污染的物体与任何有菌的、被污染的物体相接触。
任何直接或间接地与培养细胞相接触的物体必须经过严格的清洗和消毒程序。
1.实验目的掌握细胞培养中所使用的器械的清洗与消毒方法。
2.实验原理清洗时采用化学药剂清除物体表面污垢的方法，它是借助清洁剂对物体表面污染物或覆盖层进行化学转化、溶解、剥离以达到脱脂、除锈和去污的效果。
消毒是指杀死病原微生物（但不一定能杀死细胞芽孢）的方法。
通常用化学方法来达到消毒的作用。
灭菌可除去或杀灭物体中全部微生物。
应根据微生物的种类、污染状况、被污染物体的性质与状态，选择单独或组合灭菌方法。
能否达到灭菌的目的，通常要采用无菌实验法进行判定。
对灭菌操作时采用的温度、压力等能否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。
在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。
灭菌的程度受灭菌的时间与灭菌剂强度的制约。
灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射线灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法等。
可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，空气灭菌则采用过滤除菌法。
3．实验准备仪器设备：超净工作台、超声清洗器、高压灭菌锅、干燥箱、过滤器、紫外灯、0.22um 微孔滤膜、电磁炉、电子分析天平、铝箔、试管刷等。
实验材料：玻璃器皿（三角瓶、烧杯、量筒、试剂瓶）塑料器皿（离心管、吸头等）、眼科剪刀、眼科镊、金属饭盒、报纸等。
主要试剂：75%乙醇、盐酸、0.2%的新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸、次氯酸钠(NaClO)、洗涤剂、蒸馏水、去离子水等。
4．试验方法4.1 玻璃器皿的清洗（1）浸泡：初次使用和培养用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，水要完全进入器皿中，不要留有气泡。
清洗与消毒PPT课件
消毒
物理方法
加熱
加熱會使微生物的蛋白質分解而將其殺滅，可分 為乾熱及溼熱
溼熱的蒸氣的效果比乾熱效果好 美國規定將餐具浸於77 oC以上的熱水並維持30
秒以上，以完成消毒的程序 我國餐飲良好衛生規範(GMP)中規定須以80 oC
以上的熱水維持2分鐘以上
8
以沸水、蒸氣、熱水、乾熱或日光等物 理方式做消毒與化學消毒法比較具有下 列優點
6
清潔劑的施用方法
浸泡 噴灑 定位洗滌(clean-in-place, PIC)
定位洗滌是指部分機械或設備無法拆卸清洗，只能利用此方 法將清潔劑通過與食品接觸面而發揮清洗的功能
擦拭
清潔劑施用完畢後，應用清水(一般用溫熱水)將 清潔劑徹底沖洗乾淨，因其殘留除造成衛生安 全問題外，亦會降低消毒效果
18
細菌檢驗
總菌數 大腸桿菌及大腸桿菌群
19
20
21
12
碘系消毒劑
優點：具性質穩定且效期長、遇到泥土不易失去 活性，不刺激皮膚
缺點：價格較其他消毒劑高，且可能會造成銅、 銀材質餐具表面有斑點
四級銨化合物
優點：性質穩定且效期長，對大部分微生物都有 殺滅效果，不具腐蝕性
缺點：遇硬水會影響作用力，對細菌殺滅效果有 選擇性，濃度超過200 ppm使用後會殘留，且不 能用於消毒碗盤或食品接觸面
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酒精
優點：揮發性強、殘留量低。若採用食用酒精， 可用於食品作業環境、人員手部、食品接觸表面 的等的殺菌
缺點：揮發後有酒味，若用多量對密閉包裝的食 品不合適
大部分細菌的殺菌效果以濃度70 ~75%為佳
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影響化學消毒劑效力的因素
护理学基础_清洁、消毒和灭菌 PPT课件
1、干热由空气导热，传热的速度慢。 2、湿热由空气和水蒸气导热，传热的速度 快，同时，湿热具有潜热能迅速提高消毒 物品的温度。
煮沸消毒法
要求
适用 方法 注意
经 5～10分钟可杀灭繁 适用于耐湿、耐高温的 将物品刷洗干净，全部 煮前 煮时 煮后
殖体，达到消毒效果。 物品 浸没在水中，然后加热煮 将碳酸氢钠加入水中， 如金属、搪瓷、玻璃和 沸 应将物品刷洗干净 根据物品性质决定放入水的时 配成 1% ～2%的浓度时， 水的沸点受气压影响，海 应用无菌器械将物品及时 间及消毒时间 有轴节的器械或带盖的容器应 橡胶类等 消毒时间从水沸后计算 取出 拔高的地区气压低，水 玻璃器皿应用纱布包裹好后， 将轴节或盖打开再放入水中 可提高沸点达 105℃，增 的 从冷水或温水中放入，消毒时 空腔导管须先在腔内灌水 如中途加入物品，则在 置于无菌容器内 沸点也低，需适当延长 强杀菌作用，还可去污、 间为10～15min 物品不宜放置过多，大小相同 消毒时间；海拔每增高 第二次水沸后重新计时 橡胶制品用纱布包好，待水沸 防锈。 的碗、盆不能重叠，要保证物
光照消毒法
又称辐射消毒，主要利用紫外线的杀 菌作用，使菌体蛋白质发生光解、变 性而致细菌死亡。 其特点对杆菌杀菌能力强，对球菌较 弱，对生长期细菌敏感，对芽孢敏感 性差。
日光曝晒法
原理
适用
方法
常用于 方法是将物品 由于日光具有 床垫 放在直射阳光下 热、干燥和紫外线 毛毯 曝晒 6h， 的作 用 衣服 定时翻动， 有一定的杀菌力 书籍 使物品各面均能 等物品的消毒 受到日光照射。
谢谢聆听！
是热力消毒灭菌中效果 临床广泛应用于
原理 适用
2-1 洗刷、灭菌、发酵、病毒培养 (2)
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同一温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果好 湿热中细菌菌体蛋白较易凝固 湿热的穿透力比干热大 湿热的蒸汽有潜热
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指药液通过无菌滤器，除去活的和死的微生物而得 到无菌滤液的方法。
特点：
（1)适用于很不耐热的药物溶液的除菌 （2)必须无菌操作（滤球 、容器 、药液、环境无 菌等过程）。
体药物等
环氧乙烷灭菌法（制药设备、注射器、生物制品） 甲醛蒸汽熏蒸灭菌法（车间、制药设备） 其他蒸汽熏蒸灭菌法
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化学消毒：气体灭菌法
环氧乙烷：车间、制药设备、注射器、生物制品 甲醛溶液：车间、制药设备 醋酸、乳酸 丙二醇 臭氧
气体灭菌法:环氧乙烷灭菌法 （对空气进行灭菌）
减压 灭菌
促进菌体蛋白质变性凝固（酚、醇、醛、酸碱 类等）
干扰细菌酶系统和代谢（氧化剂、重金属盐类等） 损伤细菌细胞膜，增加其通透性（表面活性剂、
脂溶剂等） 菌体成分氧化、水解或结构改变（氧化剂、卤素、
醛、酚等）
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使用能形成气体或蒸汽的化学药品 适用于不耐热又不能过滤的药品（混悬液、固
（一）玻璃器皿的洗刷
1、旧细胞培养瓶的洗刷
步骤：浸泡、刷洗、烘干
2、新细胞培养瓶的洗刷
步骤：2%的盐酸或洗涤液浸泡、清水冲洗、浸泡、刷洗、烘干
3、其他玻璃器皿的刷洗
步骤：清洁液刷洗、磷酸三钠浸泡过夜、自来水冲洗、纯水和注射 用水分 别冲三次、烘干
4、玻璃移液管的清洗
步骤：含消毒剂的清洗液浸泡过夜、自来水冲洗、纯水冲洗、注射液冲洗、 烘干、棉花塞口、待灭菌
学习内容二 灭菌技术
一、物理灭菌法 二、化学灭菌法
灭菌－杀灭或除去所有微生物的繁殖体和芽胞。 消毒－杀灭或除去病原微生物。 防腐－抑制微生物的生长与繁殖。抑菌剂或防腐剂。 除菌：用冲洗、过滤等机械手段除去微生物的方法 化疗：用对病原菌有毒力但对机体无害的化学物质杀灭或
细胞工程作业
细胞工程作业《细胞工程》作业第1章细胞培养的设施与基本条件1、细胞培养实验室与一般实验室的结构区别是什么？2、净化工作台分几类？它们的特点各是什么？第2章清洗与消毒1、细胞培养室常见的消毒方法有哪些？2、干热消毒和湿热消毒的区别有哪些？第3章细胞培养的基本方法1、无菌操作技术2、培养细胞的观察，细胞计数法、细胞生长曲线、细胞分裂指数、细胞贴壁率、MTT比色法测定细胞活力3、细胞培养中常用的染色方法：碱性活性染料和酸性活性染料、台盼蓝、中性红、EB和AO双染4、细胞培养的污染和检测：污染种类、途径、影响、检测及排除第4章细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？2、常用的组织分离方法有哪几种？3、什么是原代培养和传代培养？4、原代细胞培养有哪些方法？各自的适应范围是什么？5、什么是细胞系、细胞株？6、细胞同步化培养有哪些主要方法？7、培养液中为何要添加一定量的血清？血清使用时为何要进行灭活？8、简述克隆培养法的基本原理。
第5章细胞融合与单克隆抗体1、细胞融合2、HAT的选择原理是什么？3、论述单克隆抗体技术的主要原理，制备过程，在临床和生物学研究中的应用现状，预测期发展前景。
第6章胚胎工程1、体外受精、胚胎移植技术、胚胎分割技术、动物的性别控制2、什么叫发育阻滞？3、就“一父两母”技术及其可能的应用及伦理学方面等问题展开讨论。
第7章干细胞与组织工程1、什么是干细胞？它有哪些主要类型？2、组织工程3、追踪了解ES细胞的研究进展（如诱导多能干细胞），分析讨论其应用前景及其面临的问题。
第8章核移植技术与动物克隆1、细胞核移植技术2、讨论核移植技术的应用现状及其发展前景。
3、分析动物克隆所带来的社会及伦理问题。
第9章转基因动物与动物生物反应器1、转基因动物2、追踪转基因动物研究的发展，并预测其应用前景。
3、讨论转基因动物的安全问题，谈谈个人的认识。
第11章植物组织培养1、植物细胞全能性理论2、植物组织培养基的组成成分有哪几类？在离体培养中的功能是什么？它与动物细胞培养基在组成上有什么异同？3、总结植物组织培养的主要操作步骤，指出无菌操作应注意的问题。
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d.干热消毒：玻璃器皿； 160度保持2小时
e.湿热消毒： 布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿某些液体; 物 品不宜过满；液体和橡胶制品10磅（65KPa115℃）10分钟； 布类、金属器械、玻璃器皿15磅（101.3KPa121.3℃）20分钟 。 f.滤过消毒：培养用液；0.22 μm微孔滤膜
• 微孔滤膜滤器：这种滤器的基本结构与
Zeiss滤器相同， • 其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂 滤膜。 • 滤膜的规格很多，主要根据滤器的直径大
小而划分其型号，可按待滤过的液体的量
来选择适当的型号。
微孔滤膜滤器可为加压式（正压式）或抽滤式，由于
加压式微孔滤膜滤器过滤效果好、使用方便、易清
（四）影响消毒灭菌效果的因素
（1）消毒剂的性质、浓度与作用时间
（2）微生物的污染程度 （3）微生物的种类和生活状态 （4）环境中有机物 （5）温度、湿度、酸碱度 （6）化学拮抗物
三、过滤除菌法
用于遇热易发生变性而失效的试剂或培养用液
负压？正压？
过滤除菌装置
常用的滤器有以下几种
• ①zeiss滤器：这种滤器为不锈钢的金属结
• 一般玻璃器皿的清洗分为4个步骤。 • A：浸泡：首先清水浸泡，用以软化和溶解；再采 用5%盐酸浸泡过夜； • 新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性， 并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，采用 酸处理可消除。
• B:刷洗：一般多用毛刷和洗涤剂或洗衣粉
洗涤，以去除器皿内外表面的杂质（防止
冲洗干净，不留任何残迹为止。
清洁液配制比例
• 细胞培养物品清洗所需配制的清洁液强度 通常为次强液。新配制的清洁液呈棕红色， 经多次使用、水分增多或遇有机溶剂时变 为绿色，此时表示清洁液已失效，应废弃
而重新配制。
• 安全：配制过程中，应先将重铬酸钾完全
溶解于蒸馏水中(必要时可加热帮助溶解)，
然后缓慢加入浓硫酸。由于加入浓硫酸时
具及耐热液体。
C：过滤除菌法：含不耐热成分培养基、试剂等。
2.化学消毒法：实验室、无菌室、物体表面消毒。
• 1.玻璃器皿清洗： • 玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的 存放等。提供细胞生长的玻璃表面不但要清洗干 净，而且要带适当的电荷。 • 苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞 附着。需以HCl或H2SO4中和。
3.防腐：防止或抑制微生物生长繁殖的方法。
4.无菌：不存在活的微生物。
5.无菌操作：防止微生物进入机体或局部环境
的操作技术。
培养用品的消毒灭菌
• （二）消毒灭菌的方法
根据材料的要求可采用不同的消毒灭菌方法。
总的说来有物理方法及化学方法两大类。
1.物理消毒
a.火焰 ：可直接用酒精火焰加热的实验器械。
损伤器皿表面，不留死角）。
• C:浸酸：清洁液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸
馏水配制而成。具有很强的氧化作用，去 污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。 • 清洁液：红棕色（有效）--绿色（失效）
• D：冲洗：玻璃器皿经浸泡后，第一步，使
用流水彻底冲洗，每个器皿用流水灌满、
倒掉，须重复十次以上，直至清洁液全彻底将残留清洁液冲洗干净，
蒸馏水漂洗2—3次．三蒸水漂洗2次，晾干备用。
• 5.包装： • 一般用皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布等作 为包装材料； • 对培养瓶、滤器、存放培养液用贮液瓶、吸管和 胶塞(或培养瓶盖子)等物品的容器瓶口部分做局 部包装密封，再用牛皮纸、玻璃纸或布包起来备 用。
• 3.胶塞、盖子等杂物：
•
清洗过程中，初次使用的胶塞因带有滑石粉，
应先用自来水冲洗于净，再进行常规清洗；
• 使用后的胶塞、盖子应及时浸泡在清水中，然后
用洗涤剂刷洗。
• 用蒸馏水漂洗2—3次,最后三蒸水漂洗1次。晾干
备用。
• 4.塑料器皿：
• 用后立即以流水冲洗干净或浸入清水中，防止干涸。
• 超声波清洗机内加入少量洗涤剂清洗30 min,流水彻
2.化学消毒 ：
消毒剂：2%来苏尔（煤酚皂）、甲醛、环氧乙烷、氯已定、
戊二醛、碘伏、 0.5%过氧乙酸、 0.1%新洁尔灭（常用） 、
70％（或75％）酒精 （常用）。
3.抗生素消毒：青霉素、链霉素。 4. 气体消毒： 37％甲醛加热沸腾后，加适量高锰酸钾，关门 窗1～3天。
（三）消毒剂的主要种类及应用
洗，目前使用最为广泛。
滤膜的选择是效果好坏的关键。常用的滤膜孔径为
0.6um、0.45um、0.22um。
消毒方法的选择
将产生热量，因此配制的容器宜用陶瓷或 塑料器皿。一般浸泡过夜，或至少为6h以 上。
• 2.玻璃滤器： • 玻璃滤器以烧结玻璃为滤板，固定在玻璃 漏斗上。主要用于各种培养用液的过滤除 菌，不宜单独过滤血清等粘稠液体，容易 堵塞滤板小孔。 • 此种滤器只能连接真空泵在负压条件下抽 滤，不能施加正压。
a．自来水漂洗：用洗衣粉掠洗(不得使用毛刷)过夜。 b．自来水抽滤3—5遍至无白沫，水滴滤过夜。 c ．清洁液抽滤1遍，清洁液滴滤过夜。 d．自来水漂洗抽滤5遍，水滴滤过夜。 e . 蒸馏水抽滤3遍，蒸馏水滴滤过夜。 f ．二蒸水抽滤2遍，三蒸水滴滤过夜，漂洗。 g．烤干备用。
二、消毒
玻璃培养瓶，移液管，试管等玻璃器皿？ 超净工作台台面？
金属手术器械？
不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等？ 橡胶塞和塑料瓶盖等？ 细胞培养室？ 操作人员的手部？
实验室桌面、地面等？
消毒与灭菌
（一）重要概念 1.消毒：杀死物体上病原微生物的方法；并不 一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物
2.灭菌：杀死物体上所有微生物的方法。
构。中间央有一层石棉制成的一次性纤维
滤板。滤板有一定的厚度，可承受一定的
压力，因此是过滤血清等粘稠液体较理想
的滤器。
◆培养液过滤除菌装置
• ②玻璃滤器；这种滤器为玻璃结构，以烧结
玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上，可用于过滤
除血清等粘稠液体以外的各种培养液体，只 能采用抽滤式。根据滤板孔径的大小，分 G1-G6六种规格型号，其中只有G5及G6可用 以滤过除菌，一般都使用G6型。其缺点是速 度较慢。
第二章 清洗与消毒
培养用品的清洗和消毒灭菌
• 一、清洗： • 在组织培养中细胞对任何有害物质都十分敏感， 因此对新的或用过的培养器皿均需严格清洗。 • 有害成分大多为：微生物、细胞碎片、非营养 性化学成分。
方法：物理灭菌法+化学消毒法
1.物理灭菌法：
A：紫外线法：无菌室、超净工作台大面积消毒。
B：高压蒸汽法：玻璃器皿、滤器、胶塞、解剖用