020细胞工程-第二章 清洗与消毒

2.化学消毒 ：
消毒剂：2%来苏尔（煤酚皂）、甲醛、环氧乙烷、氯已定、
戊二醛、碘伏、 0.5%过氧乙酸、 0.1%新洁尔灭（常用） 、
70％（或75％）酒精 （常用）。
3.抗生素消毒：青霉素、链霉素。 4. 气体消毒： 37％甲醛加热沸腾后，加适量高锰酸钾，关门 窗1～3天。
（三）消毒剂的主要种类及应用
• 一般玻璃器皿的清洗分为4个步骤。 • A：浸泡：首先清水浸泡，用以软化和溶解；再采 用5%盐酸浸泡过夜； • 新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性， 并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，采用 酸处理可消除。
• B:刷洗：一般多用毛刷和洗涤剂或洗衣粉
洗涤，以去除器皿内外表面的杂质（防止
• 3.胶塞、盖子等杂物：
•
清洗过程中，初次使用的胶塞因带有滑石粉，
应先用自来水冲洗于净，再进行常规清洗；
• 使用后的胶塞、盖子应及时浸泡在清水中，然后
用洗涤剂刷洗。
• 用蒸馏水漂洗2—3次,最后三蒸水漂洗1次。晾干
备用。
• 4.塑料器皿：
• 用后立即以流水冲洗干净或浸入清水中，防止干涸。
• 超声波清洗机内加入少量洗涤剂清洗30 min,流水彻
二、消毒
玻璃培养瓶，移液管，试管等玻璃器皿？ 超净工作台台面？
金属手术器械？
不耐热的液体培养基和胰蛋白酶等？ 橡胶塞和塑料瓶盖等？ 细胞培养室？ 操作人员的手部？
实验室桌面、地面等？
消毒与灭菌
（一）重要概念 1.消毒：杀死物体上病原微生物的方法；并不 一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物
2.灭菌：杀死物体上所有微生物的方法。
3.防腐：防止或抑制微生物生长繁殖的方法。
4.无菌：不存在活的微生物。
5.无菌操作：防止微生物进入机体或局部环境
的操作技术。
培养用品的消毒灭菌
• （二）消毒灭菌的方法
根据材料的要求可采用不同的消毒灭菌方法。
总的说来有物理方法及化学方法两大类。
1.物理消毒
a.火焰 ：可直接用酒精火焰加热的实验器械。
构。中间央有一层石棉制成的一次性纤维
滤板。滤板有一定的厚度，可承受一定的
压力，因此是过滤血清等粘稠液体较理想
的滤器。
◆培养液过滤除菌装置
• ②玻璃滤器；这种滤器为玻璃结构，以烧结
玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上，可用于过滤
除血清等粘稠液体以外的各种培养液体，只 能采用抽滤式。根据滤板孔径的大小，分 G1-G6六种规格型号，其中只有G5及G6可用 以滤过除菌，一般都使用G6型。其缺点是速 度较慢。
b.射线消毒（电离辐射消毒）：钴60（60Co）；量大和不适用 高压和过滤的培养用品；用于牛血清、塑料制品、玻璃制品； 不适用于活的生物材料。 c.紫外线消毒：空气、操作台表面。紫外灯距地面2.5米 。作 用原理。
d.干热消毒：玻璃器皿； 160度保持2小时
e.湿热消毒： 布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿某些液体; 物 品不宜过满；液体和橡胶制品10磅（65KPa115℃）10分钟； 布类、金属器械、玻璃器皿15磅（101.3KPa121.3℃）20分钟 。 f.滤过消毒：培养用液；0.22 μm微孔滤膜
损伤器皿表面，不留死角）。
• C:浸酸：清洁液由浓硫酸、重铬酸钾及蒸
馏水配制而成。具有很强的氧化作用，去 污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。 • 清洁液：红棕色（有效）--绿色（失效）
• D：冲洗：玻璃器皿wenku.baidu.com浸泡后，第一步，使
用流水彻底冲洗，每个器皿用流水灌满、
倒掉，须重复十次以上，直至清洁液全部
底冲洗干净；
• 清洁液浸泡过夜，流水彻底将残留清洁液冲洗干净，
蒸馏水漂洗2—3次．三蒸水漂洗2次，晾干备用。
• 5.包装： • 一般用皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布等作 为包装材料； • 对培养瓶、滤器、存放培养液用贮液瓶、吸管和 胶塞(或培养瓶盖子)等物品的容器瓶口部分做局 部包装密封，再用牛皮纸、玻璃纸或布包起来备 用。
将产生热量，因此配制的容器宜用陶瓷或 塑料器皿。一般浸泡过夜，或至少为6h以 上。
• 2.玻璃滤器： • 玻璃滤器以烧结玻璃为滤板，固定在玻璃 漏斗上。主要用于各种培养用液的过滤除 菌，不宜单独过滤血清等粘稠液体，容易 堵塞滤板小孔。 • 此种滤器只能连接真空泵在负压条件下抽 滤，不能施加正压。
a．自来水漂洗：用洗衣粉掠洗(不得使用毛刷)过夜。 b．自来水抽滤3—5遍至无白沫，水滴滤过夜。 c ．清洁液抽滤1遍，清洁液滴滤过夜。 d．自来水漂洗抽滤5遍，水滴滤过夜。 e . 蒸馏水抽滤3遍，蒸馏水滴滤过夜。 f ．二蒸水抽滤2遍，三蒸水滴滤过夜，漂洗。 g．烤干备用。
（四）影响消毒灭菌效果的因素
（1）消毒剂的性质、浓度与作用时间
（2）微生物的污染程度 （3）微生物的种类和生活状态 （4）环境中有机物 （5）温度、湿度、酸碱度 （6）化学拮抗物
三、过滤除菌法
用于遇热易发生变性而失效的试剂或培养用液
负压？正压？
过滤除菌装置
常用的滤器有以下几种
• ①zeiss滤器：这种滤器为不锈钢的金属结
洗，目前使用最为广泛。
滤膜的选择是效果好坏的关键。常用的滤膜孔径为
0.6um、0.45um、0.22um。
消毒方法的选择
第二章 清洗与消毒
培养用品的清洗和消毒灭菌
• 一、清洗： • 在组织培养中细胞对任何有害物质都十分敏感， 因此对新的或用过的培养器皿均需严格清洗。 • 有害成分大多为：微生物、细胞碎片、非营养 性化学成分。
方法：物理灭菌法+化学消毒法
1.物理灭菌法：
A：紫外线法：无菌室、超净工作台大面积消毒。
B：高压蒸汽法：玻璃器皿、滤器、胶塞、解剖用
具及耐热液体。
C：过滤除菌法：含不耐热成分培养基、试剂等。
2.化学消毒法：实验室、无菌室、物体表面消毒。
• 1.玻璃器皿清洗： • 玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的 存放等。提供细胞生长的玻璃表面不但要清洗干 净，而且要带适当的电荷。 • 苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞 附着。需以HCl或H2SO4中和。
• 微孔滤膜滤器：这种滤器的基本结构与
Zeiss滤器相同， • 其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂 滤膜。 • 滤膜的规格很多，主要根据滤器的直径大
小而划分其型号，可按待滤过的液体的量
来选择适当的型号。
微孔滤膜滤器可为加压式（正压式）或抽滤式，由于
加压式微孔滤膜滤器过滤效果好、使用方便、易清
冲洗干净，不留任何残迹为止。
清洁液配制比例
• 细胞培养物品清洗所需配制的清洁液强度 通常为次强液。新配制的清洁液呈棕红色， 经多次使用、水分增多或遇有机溶剂时变 为绿色，此时表示清洁液已失效，应废弃
而重新配制。
• 安全：配制过程中，应先将重铬酸钾完全
溶解于蒸馏水中(必要时可加热帮助溶解)，
然后缓慢加入浓硫酸。由于加入浓硫酸时