生物工程下游技术
生物工程下游技术
d. 对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应 加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋 白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目 标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫 键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。 e. 同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或 EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以 防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。
优点： ① 一定的选择性； ② 细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一 步分离过程 缺点：（只能用于实验室） ① 产物抑制造成效率低下； ② 溶酶价格高； ③ 通用性差， 不易确定最佳条件；
6、微波加热法
• 机理：微波加热导致细胞内极
性物质，尤其是水分子吸收微波 能，产生大量热量，使胞内温度 迅速上升，液态水汽化产生的压 力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成 微小孔洞，进一步加热可导致细 胞内部和细胞壁水分减少，细胞 收缩，表面出现裂纹。
缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分
离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的
分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大 ；
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体； 超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。
2、高蛋白浓度下的复性方法：
（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍
能得到较高的复性率。）
①缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到 复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或 加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。 因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠 的蛋白一起聚集。
团状、丝状真菌、 几乎所有的微生物 较小革兰阳性菌不 细胞，包括含有包 宜，包含体不宜 含体的基因工程菌 的破壁
X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却 至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上
生物工程下游技术
生物工程下游技术生物工程下游技术生物工程下游技术的定义指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。
实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。
1.生化工程分离技术预处理结晶干燥离心法：离心过滤、离心沉降、超离心萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换膜分离：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗透2.生物物质常用的分离技术氨基酸：结晶和离子交换法蛋白质和多肽：离子交换层析、电泳糖类：吸附层析脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析抗生素：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析3. 生物分离方法的选择与评价原则：步聚少，次序合理，产品规格（注射，非注射），生产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理4.浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor)表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。
浓缩率为m，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。
5.分离因子：分离因子又称分离系数。
产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。
6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比例回收, 回收率R：生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。
1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？5 分离纯化指标有哪些?简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。
答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。
生物工程下游技术1-15章复习
第一章绪论下游技术:对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物源料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，通常称为下游技术，也称为下游工程或下游加工过程。
清洁生产(Cleaner Production)：是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。
它包括三方面内容，即清洁生产工艺(技术)、清洁产品、清洁能源。
清洁生产工艺是生产全过程控制工艺，包括节约原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全部排放物和废物离开生产过程以前，尽最大可能减少它们的排放量和毒性，对必须排放的污染物实行综合利用，使废物资源化。
第二章下游技术的理论基础利用物质性质上的差异，可以区分不同的物质，并可对包含多种成分的混合物进行分离和精制。
分类：以物理学过程为基础的分离操作，大致可分为以下三类，（1）平衡分离过程（2）拟平衡(速度差)分离操作（3）非平衡分离操作流体在分离场内的传递现象可用经典流体力学中动量（通量）传递，热量（通量）传递，和质量（通量）传递规律和作用于分离场外的外加势能来描述。
下游技术中的生物学过程（一)特异性相互作用(锁钥关系）生物分离过程的作用特征是生物高分子的特异性相互作用。
生物高分子能分辨特定物质，再与其可逆性结合，这种现象是非常排他性的、特异性的结合。
有时也被称为生物亲和力。
具有特异性相互作用的高分子主要有：酶、抗体、植物凝血素、抗生物素蛋白等结合性蛋白、肝素、明胶、核苷酸等。
（1）离子间的相互作用：氨基酸侧链的电荷引起的静电作用（2）氢键结合：配体含或原子，能和结合部位之间形成氢键（3）硫水性相互作用：配体上的非极性基团与结合部位侧面的非极性部分存在硫水性相互作用（4）对金属原子配位：结合部位的一部分和配体的一部分在同一金属上配位（5）弱共价键结合：醛基和羟基间形成半缩醛可逆性结合作用（除共价结合外）（二）亲和色谱（Affinity Chromatography）利用某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的色谱技术。
生物工程下游知识点总结
生物工程下游知识点总结一.名词解释1.清洁生产（cleaner production）：是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。
它包括三个方面的内容，即清洁生产工艺（技术）、清洁产品、清洁能源。
2.凝聚作用：向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。
3.絮凝作用：絮凝剂通过静电引力范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，就形成了较大的絮团。
4.下游工程（下游技术，下游加工过程，downstream processing）:对于由自然界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术5.协萃:两种或两种以上的萃取剂同时萃取某一溶质或其它化合物时，萃取性能优于它们各自萃取性能之和的效应。
6.萃取因数:萃取平衡后，溶质在萃取相与萃余相中数量（质量或物质的量）的比值。
（E=DR）7.带溶剂：在纯气体溶剂中，加入被萃取物亲和力强的组分以提高其对被萃取组分的选择性和溶解度的一类物质。
8.离子交换带:溶液的组成和树脂的组成达到平衡时所对应的树脂层的高度。
9.反胶团（reversed micelles）:两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水基团自发地向内聚集而成，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合性胶体。
10.浓差极化:当溶剂透过膜而溶质留在膜上因而使膜面浓度增大，并高于主体浓度的现象。
（指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。
在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。
生物工程下游技术
生物工程下游技术第五章1、目标产物分离基本的两个阶段：产物的初级分离和产物的纯化精制阶段。
（1）初级分离：位于生物反应之后，其任务是分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除大部分杂物等。
（2）纯化精制：在初级分离的基础上，用各种高选择手段（主要是各种色谱层析）将目标产物和干扰杂物尽可能的分离开，达到产物的高纯度，最后储藏运输和使用产品。
（1）机械破碎（高压匀浆、高速研磨）—离心法提取包含体—加变性剂溶解—除变性剂复性特点：利用了包含体与细胞碎片的密度差，离心法可获得干净的包含体，再对其复性。
这样首先摆脱了大量的杂质，使后面的分离纯化简单了，缺点是需要经过几次离心，加工时间较长（2）机械破碎—膜分离除可溶性蛋白—变性剂溶解包含体—除变性剂复性特点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片与包含体一起被膜挡住，难以分开，其次膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白的滞留，优点是封闭式操作，不污染环境也不受污染，能量也消耗少（3）化学破碎（加变性剂）—离心除细胞碎片—除变性剂复性特点：化学法破菌，试剂既可以破菌又可以溶解包含体，这样节约了时间和设备，缺点是所有的可溶性杂质都没有被除去，混杂在产物中间，给后面的分离带来困难。
第六章1、膜分离技术：是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分从而达到分离目的技术。
优点：1）处理效率高，设备易于放大2)可在室温或低温下操作，适宜于热敏感物质分离浓缩3）化学与机械强度小，减少失活4）无相转变，省能5）有相当好选择性，可在分离、浓缩的同时达到部分纯化目的6）选择合适膜与操作参数，可得到较高回收率7）系统封闭循环，防止外来污染8）不外加化学物，减少了成本，也减少了对环境的污染2、膜的清洗：物理方法和化学方法。
物理方法一般是指用高速水冲洗，海绵球机械擦洗和反洗等，他们的特点是简单易行。
化学清洗通常是用化学清洗剂，如碱、酸、酶表面活性剂、络合剂和氧化剂等。
生物工程下游技术简答题
答案仅供参考1.从生物工程概念及学科分支着手，分析生物工程下游技术的概念。
生物工程是分子遗传学、微生物学、细胞生物学、生物化学、化学工程和能源学等各学科的结合，应用于医药、食品、农林、园艺、化工、冶金、采油、发酵罐新技术和新底物的环保等方面的工程技术；生物工程下游技术就是研究，应用和设计生物产品的提取、分离、纯化、精制及加工工艺，使其变为产品的一门学科。
2.谈谈生物工程下游技术课程主要研究哪些问题？在整个生物工程技术领域的地位如何？有何作用？研究生物工程产品的提取、分离、纯化、精制加工等技术的基本原理和方法。
下游技术是生物制品产业化的必经之路和关键所在，直接影响产品的质量和成本。
作用是可以培养对生物产品的分离，纯化技术的掌控和应用能力，以及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。
3.生物工程下游技术处理对象有哪些特点？目标物质浓度低、组分复杂、产物稳定性差、质量要求高（纯度、卫生和生物活性）4.原料中目的物的浓度与产品价格是否有关联？目的物浓度越低，产品的价格就越高5.提取步骤数及各步收率对总收率有何影响？提取步骤数越多，最终的总收率就越低6.通过查阅资料，介绍生物工程发展史。
第一阶段：古代酿造业，不存在下游技术一说，主要产品是酒、酱油、醋之类的发酵产品。
第二阶段：近代酿造业，可以进行过滤、蒸馏、精馏等简单的单元操作，主要产品是丙酮、丁醇等无活性的小分子物质。
第三阶段：可以进行目前大部分的化工单元操作，主要产品是抗生素、多糖、蛋白质等具有一定生物活性的大分子物质。
第四阶段：现代生物工业，可以进行各种新型分离技术（色谱、萃取等），主要产品是基因工程的高附加值产品。
7.介绍生物下游技术的一般流程，划分依据是什么？1.预处理（固体细胞与液体发酵液）2.提取（初步分离）3.精制（高度纯化）4.成品制作（最后加工，层析、电泳等）划分依据一般是分离产物的物相，分离物的大小，难度，方法等。
8.生物下游分离与化工分离有何区别？生物下游分离常无固定操作方法可循，生物材料组成非常复杂，分离操作步骤多，不易获得高收率，培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高，分离进程必须保护化合物的生理活性，生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏，基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。
生物工程下游技术
5.
基因工程产品，生物安全(biosafety)问题
即要停止菌体扩散。
10
13· 4 生物技术下游加工过程的一般 流程和单元操作
13.4.1 —般工艺流程
1. 2. 3. 4.
培养液(发酵液)预
处理和固液分离
初步纯化(提取)； 高度纯化(精制); 成品加工。 工艺过程决定于产
品的性质和要求达
到的纯度。
生物工艺学
第十三 章
生物工艺下游加工过程概论
1
主要内容
下游加工过程在生物技术中的地位
传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较
生物技术下游加工过程的特点
生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作 生物技术下游加工过程的发展趋向
2
13.1 下游加工过程在生物技术中的地位
下游加工过程：生物化工产品系通过微生物发酵
过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得。 从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有 关产品的过程称为下游加工过程(Down stream processing)。
化学工程的单元操作，但生物物质的特性有其特 殊要求
3
下游加工过程在生物技术中的地位
发酵生产中，分离和精制过程所需费用占成本很大部分。
杂质：当进行转移时，杂质不能或较少地随着转移，因而 能达到浓缩和提纯的目的。 二次萃取：有时一次转移并不能将杂质充分除去，例如红 霉素提炼采用二次萃取。
22
反应萃取法(Reactive extraction)
溶剂萃取法常遇到困难是分 配系数较低。
一种解决的方法是利用反应 萃取法(Reactive extraction) ， 即利用一种溶剂(通常是有机 磷化合物或脂肪胺)，能按一 定化学计量关系与生物物质 形成特异性的溶剂化键或离 子对化合物。
生物工程下游技术 重点
一、绪论1.生物下游加工过程的几个阶段：①预处理和固液分离；主要技术：过滤和离心②提取（初步分离）；目的：除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件；技术：盐析法、有机溶剂沉淀、化学沉淀、大孔吸附树剂、膜分离技术③精制（高度纯化）；目的：除去与产物性质差异较小的杂质；技术：色谱分离技术、结晶、重结晶④成品制作；喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥，结晶2.评价分离效果的重要参数浓缩率（m）；回收率；纯度二、发酵液预处理和固液分离名解：凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。
絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
1.改变发酵液过滤特征的方法物理化学方法：调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加絮凝剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻—解冻、添加助滤剂（——降低液体粘度（加热法、加水稀释法），调整PH，凝聚与絮凝，加入助滤剂，加入反应剂）2.发酵液的相对纯化⑴高价无机离子的除去方法①Ca2+—草酸、草酸钠，形成草酸钙沉淀（回收草酸）②Mg2+—三聚磷酸钠，形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物③Fe2+—黄血盐，普鲁士兰沉淀⑵杂蛋白的去除方法①沉淀法：酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。
②变性法：加热；大幅度调节PH值；加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
③吸附法：吸附剂或沉淀剂吸附除去杂蛋白—活性炭、硅胶、氧化铝3．常用固液分离的方法⑴离心：在液相非均一系统中，利用离心力达到液－液、液－固、液－液－固分离的方法，统称为离心分离。
离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机⑵过滤：根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
过滤机种类：板框压滤机、真空转鼓过滤机、硅藻土过滤机三、细细胞破碎的主要方法和适用对象，了解基本机理。
（见P65图）细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
生物工程下游技术
生物工程的下游技术上游：菌种，基因工程，分子生物学，遗传学中游：微生物发酵工程，动植物细胞，海洋生物培养下游：生物分离工程生物下游加工过程是指目标产物的分离纯化过程，包括产物提取，产物浓缩，产物纯化，成品化。
生物反应器：生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。
直接测定法细胞干重法：测量细胞浓度的最基本方法。
显微计数法：显微镜和血球计数器。
平板计数法：生理盐水稀释，记录菌斑。
浊度法：波长600-700nm范围测量。
微生物的浓度即菌体浓度的表示方法。
（g/l,kg/m3)间接测定法测定构成细胞的大分子物质来确定细胞浓度。
动物细胞形态成纤维细胞型；上皮细胞型；游走细胞型；多形性细胞型，均属于贴壁依赖型细胞，培养这类细胞时，常需贴附在支持物上生长。
但由于培养环境的变化，细胞形态常发生改变。
悬浮型细胞这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。
如血液细胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞。
培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。
动物细胞培养的环境：温度、PH值、营养成分、溶氧、气体环境、渗透压以及其他因素。
固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。
由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。
常用的细胞固定化的方法1、吸附：选择适当的条件，将细胞和支持物混合，细胞便贴附在支持物的表面。
2、共价贴附：细胞和支持物通过化学键结合，减少了细胞泄露。
3、离子/共价交联：如果用聚合物（聚氨等）处理细胞悬液，则会在细胞之间形成桥使之絮结。
4、包埋：此法步骤简单，条件温和，细胞和高聚物或单体混合，随着凝胶的形成，细胞嵌入到高聚物网络中。
下游技术
名词解释：生物工业下游技术:下游技术是生物工程的一个组成部分，生物化工产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，从上述发酵液、反应液或培养液中提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，称为下游技术。
特异性相互作用：主要以蛋白质为代表的生物高分子（另外含有肝素、明胶、核苷酸等）（亲和介质），能分辨特定的物质（目标物），再与其可逆性结合。
这种现象是非常排他性的、特异性的结合，故称为特异性相互作用（或生物亲和力）。
疏水性相互作用：在水性介质中，分子和分子的疏水性部分相互作用的凝聚力，即疏水性基团有尽可能避免和水接触，自身相互之间聚集起来的趋势。
这就是疏水性相互作用的本质。
盐析：在发酵液中加入中性盐能破坏蛋白质或酶的胶体性质，消除微粒上的电荷及水化层，促使蛋白质或酶沉淀。
凝聚：凝聚作用就是向发酵液胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。
絮凝：当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时．就形成了较大的聚团，这就是絮凝作用。
膜的截留率：对一定相对分子量的物质，膜能截留的程度。
截断分子量：相当于一定截留率的（90%/95%）相对分子量。
分离膜的污染：固体或溶质在膜面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜通量变小与分离性能恶化的暂时性不可逆变化的现象。
分离膜的浓差极化：溶剂透过膜，而溶质留在膜上，导致膜面上溶质浓度增大，并高于主体中的浓度的现象。
结晶：利用物理的方法将溶质从溶液中以规则的形状析出的分离方法叫结晶。
沉淀：从溶液中得到无定型的溶质的分离方法叫沉淀。
清洁生产：清洁生产是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以减少对人类和环境的风险。
生物下游工业常用的膜分离过程：微滤，超滤，纳滤，反渗透。
生物工业常用的细胞破碎方法：改变发酵液过滤特性的方法过饱和溶液的获得方法：(1)将热饱和溶液冷却（冷却结晶）(2)将部分溶媒蒸发（恒温蒸发结晶）(3)将热饱和溶液冷却和将部分溶媒蒸发(冷却蒸发结晶)（4）加入晶种（5）加入化学反应剂超临界流体萃取中常用的萃取剂：二氧化碳盐析沉淀法所得蛋白质中的盐的去除：饱和溶液法；添加固体硫酸铵溶剂萃取操作中萃取剂需满足的条件：(1)有很大的萃取容量，即单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物；(2)有良好的选择牲，理想情况是只萃取产物而不萃取杂质；(3)与被萃取的液相(通常是水相)互溶度要小，且粘度低，即界面张力小或适中，这样有利于相的分散和两相分离；(4)溶剂的回收和再生容易；(5)化学稳定性好，不易分解，对设备腐蚀性小；(6)经济性好，价廉易得；(7)安全性好，闪点高，对人体无毒性或毒性低。
生物工程下游技术
生物工程下游技术课程名称：生物工程下游技术课程代码：6705第一部分课程性质与目标一、课程性质与特点生物工程下游技术这门课程适合于理工科专业生物工程专业进行学习。
本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术是关于由生物界自然产生的生物体或者由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应、微生物转化等各类生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，也称之下游工程或者下游加工过程，是生物技术产品产业化的必经之路。
目前所指的下游技术大多数属于“物质分离”范畴。
要紧研究的是物质分离的方法原理及有关的仪器设备。
生物工程下游技术这门课程涉及到物理，化学，生物化学，发酵工程，生物工程与设备等多门学科。
二、课程目标与基本要求通过学习生物工程下游技术这门课程应掌握下列基本知识点：1.生物工程下游技术的研究对象与进展历程2.下游技术的理论基础3.发酵液预处理，微生物细胞破碎方法与设备4.溶剂萃取与浸取，超临界流体萃取，双水相萃取，反胶团萃取，膜分离过程，液膜分离，离子交换法，色谱法等要紧分离单元操作技术及分离过程的特点，工艺设计与设备选型通过学习熟悉各类分离方法的原理，适用范围，熟悉常用分离设备的操作，在实际应用中能够选择合适的分离方法对仪器进行操作达到分离的目的。
通过学习，具备对生物产品的分离、纯化技术的应用能力，及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。
三、与本专业其他课程的关系本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术对各类生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
在生物工程专业课程的学习中，是一门将生物工程上游技术应用到实际生产中所需要借助的手段。
《物理学》，《无机化学》，《有机化学》，《物理化学》等基础课是这门课程的基础，《微生物学》，《生物化学》，《酶工程》，《发酵工程》，《生物工程与设备》等专业课的知识也会运用到这门课程中，其后继课程有《发酵工厂设计》等。
生物工程下游技术
优点:(1)对产物释放具有一定选择性.(2)细胞外形保持完整,碎片少,浆液粘度低,易于固液分离和进一步提取.
优点:操作参数少,适合于大规模操作,
缺点:不适合于丝状真菌及含有包涵体的基因工程菌.破碎率较低,往往需循环2-4次才能达到较高的破碎率,容易引起产物的失活的可能性,需配备换热器进行级间冷却.
3）超声破碎法:通常采用的超声破碎机在15—25kHz的频率下操作.
优点:操作简便,液量损失少,适合实验室规模.
缺点:易引起温度的剧烈上升,在大规模操作中,声能传递和散热困难,产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活.
4)酶溶法:利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键,从而达到破壁的目的.
优点:选择性释放产物,条件温和,核酸泄漏量少,细胞外形完整.
不足:价格高,限制了大规模应用,通用性差,不同菌种需选择不同的酶,不易确定最佳的溶解条件;产物抑制的存在.
倾析式离心机靠离心力和螺旋的推进作用自动连续排渣,所以也称为螺旋卸料沉降离心机.特别适用于含固形物较多的悬浮液的分离.优点:操作连续;适应性强;应用范围广;结构紧凑和维修方便缺点:分离有数较小,不适用于细菌;酵母等微生物悬浮液的分离,液相澄清度也较差.
过滤:使悬浮液通过过滤介质,让液体通过,而把固体颗粒截留,从而达到固液分离的目的.
管式离心机:分离效率很高.用于液液分离和固液分离.当用于液液分离时为连续操作,而用于固液分离时则为间歇操作.适于微生物细胞;细胞碎片;细胞器;病毒;蛋白质;核酸等生物大分子的分离.优点:设备简单,操作稳定,分离效率高.在生物工业中,特别适合于一般离心机难以分离而固形物含量＜1％的发酵液的分离.缺点:生产能力较小,转速相对较低的管式离心机最大处理量也就是10m3/h,且不适用于固形物含量较高的发酵液.
生物工程下游技术复习
第三章 细胞破碎、蛋白质复性及固液分离
*包含体? 主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物,产 物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，故 无活性。通常为固体颗粒。 泡沫分离法? 是一种基于溶液中溶质（或颗粒）间表面活性的 差异进行分离的一种方法，表面活性强的物质优 先吸附于分散相（气相）与连续相（液相）的界
面处，被气泡带出连续相而达到分离。
稀释复性? 将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，蛋白 质开始复性。 透析复性? 将溶液对水或缓冲液透析，变性剂透过膜被 除去，里面的蛋白开始复性。时间较长，易 形成蛋白质沉淀。 临界胶团浓度? 表面活性剂在水溶液中形成胶团的最低浓度。
包含体的成分及形成的原因?
• 包含体（inclusion body）：重组蛋白质的高效表达 常常导致其在胞内发生错误折叠和聚集，形成包含 体。 • 包含体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达 产物；产物的一级结构是正确的，但立体结构是错 误的，故无活性。 • 一般认为包含体的形成主要原因是蛋白质本身具有 易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境 （如温度、离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因 子（如分子伴侣）的作用。 • 在大多数情况下，包含体的形成是蛋白质过量表达 的结果，而与蛋白质的种类和表达系统无关。
①加热。不仅使蛋白质变性，同时降低液体粘度， 提高过滤速率。 ②调PH； ③加有机溶剂如酒精、丙酮等。
（3）吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸 附杂蛋白而除去。
*发酵液预处理的目的是什么？主要有那几 种方法？ 预处理的目的： • 分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞 碎片、核酸和蛋白质的沉淀物）， • 除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质， 以利于后继各步操作。 调酸（等电点）、热处理、电解质处理、 添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加 反应剂及添加助滤剂等。
生物工程下游技术
1.请描述生物工程下游技术的一般工艺流程，并分析各步可采用方法及其原理按生产过程分，下游技术工艺过程大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（纯化）、成品制作。
发酵液→预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩调PH 离心研磨法双水相吸附离子交换干燥絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌加工超滤膜分离成型结晶（1）预处理和固液分离加热法：加热可降低液体黏度，只适用于产物对热较稳定的发酵液。
在适当的温度和受热时间下可使菌体或蛋白质凝聚形成较大颗粒的凝聚物，改善发酵液固液分离特性。
加热是蛋白质变性凝固的有效方法。
调节PH法：PH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，调节PH可以改变菌体和蛋白质的带电性质，从而改变其过滤特性。
蛋白质属于两性电解质，两性电解质在溶液中的PH处于等电点时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加溶解度最小。
因此，调节溶液的PH，可使蛋白质溶解度下降而析出，这是除去蛋白质的有效方法。
改变PH，还能使蛋白质变性凝固。
絮凝：在某些高分子絮凝剂的存在下。
基于桥架的作用，使胶粒形成絮凝团的过程。
（2）提取（初步分离）沉淀：在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。
原理：沉淀分离就是通过沉淀，在固-液分相后，除去留在液相或沉积在固相中的非必要成分。
吸附：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。
吸附的原理：固体部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。
向的一面受部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。
萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。
原理：利用各物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理来达到将目标产物分离纯化的目的。
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1.请描述生物工程下游技术的一般工艺流程，并分析各步可采用方法及其原理按生产过程分，下游技术工艺过程大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（纯化）、成品制作。
发酵液→预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩调PH 离心研磨法双水相吸附离子交换干燥絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌加工超滤膜分离成型结晶（1）预处理和固液分离加热法：加热可降低液体黏度，只适用于产物对热较稳定的发酵液。
在适当的温度和受热时间下可使菌体或蛋白质凝聚形成较大颗粒的凝聚物，改善发酵液固液分离特性。
加热是蛋白质变性凝固的有效方法。
调节PH法：PH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，调节PH可以改变菌体和蛋白质的带电性质，从而改变其过滤特性。
蛋白质属于两性电解质，两性电解质在溶液中的PH处于等电点时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加溶解度最小。
因此，调节溶液的PH，可使蛋白质溶解度下降而析出，这是除去蛋白质的有效方法。
改变PH，还能使蛋白质变性凝固。
絮凝：在某些高分子絮凝剂的存在下。
基于桥架的作用，使胶粒形成絮凝团的过程。
（2）提取（初步分离）沉淀：在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。
原理：沉淀分离就是通过沉淀，在固-液分相后，除去留在液相或沉积在固相中的非必要成分。
吸附：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。
吸附的原理：固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。
向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。
萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。
原理：利用各物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理来达到将目标产物分离纯化的目的。
超滤：超滤是利用膜的透过性能，在静压差的推动力作用下，达到分离离子、分子及其某种微粒目的的膜分离技术。
原理：超滤是一种筛分过程，在一定的压力作用下，含有大小分子溶质的溶液流过超滤膜表面时，溶剂和小分子物质（如无机盐类）透过膜，作为透过液被收集起来；而大分子溶质（如有机胶体）则被膜截留而作为浓缩液被回收。
结晶：将形成晶型物质的过程称为“结晶”。
原理：通过结晶溶液中的大部分杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤即可得到纯度高的晶体。
（3）精制（纯化）（重）结晶：重结晶原理是利用混合物各组分在某种溶剂中溶解度不同或在同一溶剂中不同温度时的溶解度不同而使它们分离。
离子交换：离子交换技术是以圆球形树脂(离子交换树脂)过滤原水,水中的离子会与固定在树脂上的离子交换。
常见的两种离子交换方法分别是硬水软化和去离子法。
硬水软化主要是用在反渗透(RO)处理之前,先将水质硬度降低的一种前处理程序。
软化机里面的球状树脂,以两个钠离子交换一个钙离子或镁离子的方式来软化水质。
色谱分离：色谱分离过程是被分离的样品（混合物），在两相间进行分配，其中一相固定不动的，称为固定相。
另一相是流动的，称为流动相或移动相。
混合物借助流动相的推动，顺流动相的流向而迁移。
混合物各组分迁移的速度取决于各组分在固定相和流动相之间的分配系数（对气-液分配色谱）或吸附能（气-固吸附色谱）。
分配系数大的或吸附能大的组分停留在固定相中时间长，从色谱柱中流出的时间晚。
分配系数或吸附能小的组分在固定相中停留时间短，先从柱中流出。
从而使混合物中各个组分得以分离。
膜分离：膜是具有选择性分离功能的材料，利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程称作膜分离。
它与传统过滤的不同在于，膜可以在分子范围内进行分离，并且这过程是一种物理过程，不需发生相的变化和添加助剂。
（4）成品制作浓缩：指使溶剂蒸发而提高溶液的浓度，泛指不需要的部分减少而需要部分的相对含量增高。
原理：浓缩从溶液中除去部分溶剂(通常是水)的操作过程，也是溶质和溶剂均匀混合液的部分分离过程。
通过浓缩可除去食品中大量的水分，减少质量和体积，降低食品包装、贮存和运输费用；浓缩可以提高制品浓度，增大渗透压，降低水分活度，抑制微生物生长，延长保质期；浓缩可作为干燥、结晶或完全脱水的预处理过程；通过浓缩可以降低食品脱水过程中的能耗，降低生产成本；浓缩还可以有效除去不理想的挥发性物质和不良风味，改善产品质量。
干燥：在干燥过程中，水分从物料内部移向（扩散）表面，再由表面扩散到热空气中。
干燥过程得以进行的必要条件：是被干燥物料中的水分所产生的水蒸气分压大于热空气中水蒸气分压。
若二者相等，表示蒸发达到平衡，干燥停止；若热空气中水蒸气分压大，物料反而吸水。
所以为了使物料干燥，必须控制热空气的相对湿度RH（饱和空气RH=100﹪，未饱和空气RH﹤100﹪，绝干空气RH=0﹪）2.请分析表面活性物质在生物工程下游中可以有哪些应用反胶团萃取：正向胶团(normal micelle)是表面活性剂分子在极性溶剂, 如水中形成的一种亲水基团(头)朝外,而疏水基团(尾)朝内的具有非极性内核的多分子聚集体。
洗涤剂中的表面活性剂分子在水中形成的就是这种胶团, 其非极性内核可以溶解各种油污。
从而达到去污的效果。
与此相反, 表面活性剂在非极性溶剂如某些有机溶剂中就会形成亲水头向内和疏水尾向外的具有极性内核(polar core)的多分子聚集体(aggregates),由于其表面活性剂的排列方向与一般的正向胶团相反, 因此, 称为反胶团, 反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质, 而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质, 即所谓二次加溶原理。
例如, 反胶团的极性内核在溶解了水后, 在内核形成了“水池”(water pool), 可以进一步溶解蛋白质、核酸、氨基酸等生物活性物质。
由于胶团的屏蔽作用, 使这些生物物质不与有机溶剂直接接触, 而水池的微环境又保护了生物物质的活性,达到了溶解和分离生物物质的目的。
这种技术既利用了溶剂萃取的优点, 又实现了生物物质的有效分离, 成为一种新型的生物分离技术。
（1）三种蛋白质的相互分离：利用反胶团的方法萃取分离蛋白质的研究中,首先采用AOT/异辛烷反胶团体系, 通过调节水相的pH 和离子强度, 分别将α-核糖核酸酶、细胞色素C 和溶菌酶从三者的混合液中分离开来。
它们的相对分子质量相近, 但等电点有一定的差别。
作者利用pH 值和离子强度对反胶团萃取这三种蛋白质的影响的差别建立了这三种蛋白质分离的流程。
当pH >某个蛋白质的pI 时, 蛋白质带负电荷, 相反时蛋白质带正电荷。
首先在pH =9 和较低的离子强度下, α-核糖核酸酶带负电荷不被反胶团萃取, 留在水相中, 但细胞色素C 和溶菌酶都带正电荷, 可萃入有反胶团的有机相中;第二步,利用提高离子强度,可将细胞色素C 从反胶团反萃到水相中; ;最后, 再提高pH 值和离子强度, 可将溶菌酶也反萃到水相中。
这样就成功地分离了这三种蛋白质。
日本学者利用此体系萃取分离了牛血清蛋白、α-胰蛋白酶和细胞色素C 。
还利用此体系成功地分离了溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。
（2）从复杂混合体系中分离蛋白质在实际应用中往往遇到的是复杂的混合体系, 例如:其中既含多种蛋白质, 又含有发酵底物、细胞碎片、细胞组织或血液成分, 从中分离某种蛋白质是很困难的。
不少研究者对此进行了尝试, 取得了一定的进展。
例如, 用AOT/异辛烷体系, Aries -Barros 从细菌发酵液中提取了2 种脂肪酶;Leser 从大豆和向日葵中分离了蛋白质、油脂和多酚。
Giovenco 利用表面活性剂可以破坏细胞壁的特点, 用反胶团体系直接提取了胞内酶。
（3）反胶团萃取的过程开发Dekker 利用混合-澄清槽萃取器将反胶团萃取和反萃取结合在一起, 使反胶团溶液在两个单元间循环, 实现了过程的连续化操作。
如图7 所示。
其反胶团体系为:TOMAC/异辛烷+非离子型表面活性剂RewopalHV5 , 控制值和离子强度, 萃取和反萃取α-淀粉酶, 可使酶的浓度提高17 倍, 收率达85 %, 每个循环表面活性剂的损失< %。
3.电泳和层析都是产品高度纯化的方法，请分析他们在进行生物产品分离时的适用性和异同（1）适用性：色谱和电泳是目前所知最好的两种物质分离方法。
（2）不同点：①电泳：电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。
电泳具有灵敏度高、重复性好、测定范围宽、适应性强、操作容易、结果直观、设备简单、兼备分析、鉴定、分离功能等特点。
②层析法：层析法是利用混合物中各组成部分物理化学性质的差异(如吸附力,分子形状及大小,分子亲和力,分配系数等),使各组成部分在两相(一相为固定的,称为固定相;另一相流过固定相,称为流动相)中的分布程度不同,从而使各组成部分以不同的速度移动而达到分离的目的。
但是电泳目前不能用于生产规模的生物大分子的分离和纯化，所以人们把分离和纯化生物大分子（包括蛋白质、酶、核酸和多糖等，简称蛋白）的研究重点一般都放在色谱上。
（3）相同点：都是高效分离技术，操作均可自动化，且有多种不同的分离模式。
4.请设计一种你认为生物工程下游纯化虾青素的纯化流程，（绘制流程图，说明原理及操作步骤）原料预处理→总类胡萝卜素提取→虾青素酯的皂化→虾青素的纯化（1）提取。
用溶剂萃取法从新鲜海虾虾壳中提取虾青素。
溶剂萃取法原理：溶剂萃取是基于有机溶剂对不同的金属离子具有不同的溶解因而对溶液中的金属离子可以进行富集与分离。
操作步骤：将一定量新鲜虾壳放入塑料桶中,不断搅拌下,加入5%的稀盐酸,至不冒气泡(PH=,虾壳再浸泡,水洗至中性。
将虾壳敲碎,尽量去除水分。
将经预处理的新鲜虾壳放入广口瓶中,加入丙酮,丙酮用量为浸没虾壳的量的倍,室温,暗处、密封浸泡24小时。
过滤。
虾壳继续用新丙酮浸泡,滤液先加石油醚,再加水萃取。
石油醚层在低于40℃下真空浓缩得粗色素油,水层蒸馏回收丙酮。
提取过程重复三次,虾壳几乎无颜色,滤液颜色为微黄色,滤饼结束浸泡。
粗色素油中虾青素含量用高效液相色谱分析,粗色素油用二氯甲烷一甲醇配制。
（2）皂化。
强碱条件下皂化虾青素。
原理：藻类和天然植物中的虾青素主要以虾青素单酯和双酯的形式存在，酯化形式的虾青素生物利用度较低，且虾青素酯组分复杂，纯化和检测都较困难，因此需要将提取的虾青素酯皂化水解成游离虾青素来提高虾青素的纯度和生物利用度。