小鼠胚胎干细胞的培养
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞
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重庆医科大 学学报 ２ ０ ０ ９年第 ３ ４卷第 ４期 （ｏ ｒａ ｏ ｈ ｎ ｑｎ ｄｃ ｌ ｎｖ ｒｉ ０ ９ ＶＯ．４Ｎｏ４） Ｊ ｕｎ ｌ ｆ ｏ ｇ ｉ Ｍｅ ｉ ｉｅｓｔ ２ ０ ． １ ． Ｃ ｇ ａＵ ｙ ３
一
３３ 一 ９
基础研 究
文 编 ０ ３ ６ （ ０） — ９ ０ 章 号： ５ ３ ６ ０ ０ ０ ３ ４ ２— ２２ ９４ ３ —
Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ． ｌ ｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｈ ｄ ｉ ｐ ｃ ｌ ｒ ｈ ｌｇｃ ｌ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｓｓ ｃ ｓ ｎ ｓｌ ｅ ｃ ｌｎ ｅ ，ｏ ｎ ｒｅｌ ｔ ， ｉ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ：１ ａ ｌ ｈ Ｓ ｃ ｌ ａ ｔ ｔ ｉａ ｐ ｏｏ ｉａ ａａ ｔｒｓ ｃ ｕ ｈ ａ ｅ ｔｋ ｏｏ ｉｓ ｒ ｕ ｄ ｏ ｌ ｐ ｉ ｗ ｔ ｓ ｓ ｓｙ ｍｏ ｃ ｉ ｉ ｉ ｃ ｈ ｃｅ ｒ ｄ ｅ ａ ｄ ｓ ｏ ｈ ｓ ｒａ ｅ，ｔ ｎ ｅｒ ｃｉ ｎ ，ｉ ｎｆ ａ ｔ ｗｅｌ ｇ ｇ ｏ ｈ， ｏ ａ ｔｅ ｓ ｆ ｅｌ ｇ ｒｇ ｔ ｎ ａ ｄ ｉ ｄｓｉ ｃｉｎ ｂ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｌａ ｇ ｎ ｍｏ ｔ ｕ ｆ ｃ ｓｒ ｇｒ ｆ ｔ ｅ ｏ ａ ｏ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｌ ｎ ｒｗｔ ｃ ｍｐ ｃ ｎ ｓ ｌ ａ ｇａ ａ ｉ ｎ ｉｔ ｔ ｅ ｗ ｅ ｉ ｓ ｉ ｏｃ ｏ ｎ ｎ ｏ ｗ ｅ ｇ ｓｏ ｅｇ ｂ ｕ ｅｌ ｗｉ ｉ ｏｏ ｙ ｒ ｌｔ ｅｙｂ ｇ ｅ ｕ ｌａ ｏ ａ ｅ ｔ ｉ ｌ ｃ ｔｐ ａ ｍ ，．．ｈ ｇ ａｉ ｆ ｈ ｕ ｌａ － ｙｏ ｌｓ ； ｄ ｅ ｆ ｉｈ ｏ ｒｃ ｌ ｔ ｎ ａｃ ｌｎ ，ｅａｉ ｌ ｉｇ ｒ ｃ ｅ ｒｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉ ｌ ｔ ｙｏ ｌｓ ｉ ， ｉｈ ｒ ｔ ｏ ｅ ｎ ｃｅ ｒ ｃ ｔｐ ａ ｍ ｎ ｓ ｈ ｖ ｎ ｈ ｔｅ ｅ ｏ ｔ ２ ａｔｒｔｅ ＡＫＰ ｓａｎ ｎ ａｌ ｆ ｈ ｅｌ ｈ ｗｅ ｔｏ ｇ ＡＫＰ ａ ｔ ｉ ｓ ｓ ｍｅａ ｈ Ｓ ｃ ｌ ｆＦ ａ ｄ ｏ ｅｃ ｎ ｒ ｒ ｔ ｅｅ ｒ ｏ ｉ ． ｅ ｆ ｈ ｔｉ ｉｇ， ｌ ｏ ｅＥＳ ｃ ｌ ｓ ｏ ｄ ｓｒ ｎ ｔ ｓ ｃｉ ｔ ａ ａ ｓｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｏ ０， ｎ ｎ ｔ ｏ ｔａｙ， ｍｂ ｎ ｃ ｖｙ ｓ ｈ ｈ ｙ
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。
方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。
结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。
结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。
[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。
用小鼠胚胎干细胞制备拟胚体
细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(6): 887 用小鼠胚胎干细胞制备拟胚体分化培养液: 高糖Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco 12430); 15%胎牛血清(Biochrom S0615); 0.1 mmol/L非必需氨基酸(Gibco 11140-050);2 mmol/L谷氨酰胺(Gibco 25030); 0.1 mmol/L β-巯基乙醇(Gibco 21985)。
胚胎干细胞(embryonic stem cells)在一定的培养条件下可以长期维持其自我更新能力和多向分化潜能; 同时也可以在一定条件下自发分化, 形成具有内、中、外3胚层结构的拟胚体(embryoid bodies)。
拟胚体被认为再现了胚胎从原肠运动前到早期原肠运动这段时间的发育过程, 而这个阶段的胚胎处于刚着床于子宫壁的阶段, 技术上很难获得。
因此拟胚体被广泛用于研究胚层间相互诱导、器官空腔化形成等胚胎早期发育事件, 已成为干细胞研究领域不可或缺的技术手段。
目前已经报道的拟胚体制备方法有多种, 在技术方法上差异较大, 结果也不尽相同。
这一期专题中,我们将向读者介绍一种拟胚体的形成方法, 我们已经证明, 以出现节律性搏动的心肌样细胞为指标, 用这种方法形成的拟胚体出现搏动心肌的比例达90%, 且结果稳定, 重复性高。
1小鼠胚胎干细胞的培养小鼠胚胎干细胞培养的具体方法可参照本刊第31卷第3期的专题介绍, 在此不再赘述。
2 去除饲养层细胞的干扰利用小鼠胚胎成纤维细胞和胚胎干细胞贴壁速率的差异, 去除培养物中绝大多数的成纤维细胞。
方法是:(1) 正常培养的小鼠胚胎干细胞继上次传代满48 h后, 将细胞从培养器皿上消化下来, 吹打成单细胞悬液。
(2) 以小于5×104个/cm2的密度接种到细胞培养皿上, 放入培养箱静置30 min。
小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立
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用 畸 胎 瘤试 验 检 测 其 多 向分 化 能 力 。 果 结
该 细 胞 株 为孤 雌 来 源 ， 现 为 正 常二 倍 体 核 型 ， 达 Ａ Ｋ， 面标 载 体 Ａ ３ ８ ２ １ ７和
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６ Ｄ Ｐ化 学激 活 小 鼠卵母 细胞 ， 以得 到 具 有胚 胎 干 细 胞 特性 的细 胞 株 。 － ＭＡ 可
【 键 词 】 孤 雌激 活 胚 胎 干 细胞 钙 离 子 载 体 Ａ ３ ８ ６ 二 甲基 氨 基 嘌 呤 关 ２ １７ － 【 中图 分 类 号 】 Ｑ １．＋ 【 献标 识 码 】 Ａ 【 章 编 号 】 １７ — ３４ ２ １ ）３ ０ ３ — ４ ８ ３１ ｌ 文 文 ６ ３ ０ ６ （０ ００ — １２ ０
昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定
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昆 明 种 小 鼠胚 胎 干 细 胞 的 分 离 、 养 与 鉴 定 培
陈 明玉（ 大连铁 路 卫生 学校 辽 宁 大连 １６ ０ ） １０ １
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小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
长期培养小鼠胚胎干细胞拟胚体(EB)的观察
ｃ ｒ ｆ ｌ ｏ ｔ ｌ ｄ ｈ ｕ ｔ ｒ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｆ ｒ Ｅ ｆ ｒ ａｉｎ ｎ ｈ ｒ ｅ ｏ ｔ ａ ｆｉｉｎ ｒ ｔ ｃ ｌ ｂ ｉ ｈ ｕ ｉ ｒ ｙ ａ ｅ ｌ ｃ ｎ ｒ ｌ ｔｅ ｃ ｌ ｅ ｏ ｄ ｔ ｎ Ｂ ｏ ｕ ｙ ｏｅ ｕ ｉ ｏ ｍ ｔ ．ａ ｄ ｅ ｅ ｗｅ ｒ ｐ ｒ ｎ ｅ ｆ ｅ ｔ ｐ ｏ ｏ ｏ ｙ Ｗｈ ｃ ｎｆ ｍｌ ｏ ｃ ｏ
利用 Ｅ Ｂ做进一 步的药物 筛选及 分化研 究， 格规 范了形成 Ｅ 严 Ｂ的条件 ，得到 了分化 状 态均 一性很 高的 Ｅ 利用这一 条 Ｂ。 件，观 察到在 分化 条件 下长期培 养（ 达 ６ ） Ｅ 长 ０ｄ的 Ｂ中仍 有表达各 项多能性指 标的细胞 集落 有 关这一 现 象的进一 步分
摘 要 ：胚 胎 干 细 胞 在 体 外 培 养 条 件 下 能 够 维 持 自我 更 新 ，并 具 有 向 多 种 细胞 类 型 分 化 的 能 力 ，因 此 被 广 泛 用 于研 究
细胞 分化 的分子机 理以及 药物 师 选 。形成拟胚体（ ｍｂｙ 试ｂ ｄ ， Ｂ） ｘ ｚ － Ｅ ｒｏ ｏ ｙ Ｅ 是胚 胎干细胞分化 常用的技 术手段 。为 了便于今后
小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠iPS细胞培养Protocol
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养ProtocolMEF细胞铺制：1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15min以上。
2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。
一般地，一个T25培养瓶中加入5ml MEF完全培养液。
3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-rP3 MEF，复苏MEF细胞若干支。
将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1 × 106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后至于37℃细胞培养箱。
24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中是之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞，小鼠iPS细胞完全培养液的15ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免起泡。
5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
第41讲 动物细胞工程(练习)(原卷版)
第41讲动物细胞工程1．（2023·全国·高二课堂例题）克隆猴“中中”和“华华”登上学术期刊《细胞》封面，表明我国的克隆技术再次走在世界前列。
“中中”和“华华”的诞生成功证明了（）A．动物细胞的全能性B．动物细胞的再生能力C．动物细胞核的全能性D．动物细胞的分化能力2．（2023秋·湖北·高三荆州中学校联考阶段练习）小鼠作为一种与人类基因组序列相似度较高的哺乳动物，常用于人类某些疾病的研究。
小鼠胚胎干细胞的培养过程如图所示，下列叙述错误的是（）A．胚胎干细胞具有分化为成年动物体内的任何一种类型细胞的潜能B．体外培养胚胎干细胞需提供的气体环境是95%的CO2和5%的空气C．图中胚胎干细胞分化后的组织移入小鼠替代病变器官属于治疗性克隆D．图中重组细胞重编程、分裂、分化最终产生的小鼠与患病鼠性状相似3．（2023秋·辽宁·高三校联考开学考试）精准爆破肿瘤细胞的“生物导弹”——ADC（抗体偶联药物）能对肿瘤细胞进行选择性杀伤，该物质由抗体（导弹体）、药物（核弹头）和接头三部分组成，ADC的作用机制如图。
下列相关叙述错误的是（）A．ADC的制备过程运用了细胞培养和细胞融合技术B．获得制备ADC中足够数量的抗体需经过多次筛选C．ADC能精准地识别肿瘤细胞，进入癌细胞需要消耗ATPD．癌细胞的凋亡是由于溶酶体中水解酶的水解作用4．（2023秋·江西·高三校联考阶段练习）下列有关细胞工程的叙述，正确的是（）A．动物细胞融合可以直接用PEG处理，植物细胞不能直接用PEG处理B．细胞产物的工厂化生产可提高单个细胞初生代谢物的含量C．茎尖组织培养得到的脱毒苗可以抵抗病毒侵染D．动植物组织经胰蛋白酶处理成为单个细胞后才能进行培养5．（2023春·全国·高二课堂例题）Ca2+水平升高可直接或通过激活重构胚使处于MII期的卵母细胞恢复分裂周期。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
干细胞的培养条件和培养基
干细胞的培养条件1. 培养条件1. 环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。
要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
2. 设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
3. 实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。
4. 试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
5. 试剂的配制：1. DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO32. MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素3. ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子4. D-Hank's：0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红5. 0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶6. ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO7. MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO8. Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO9. 丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制2. 培养步骤常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。
我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
1. 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。
小鼠实验胚胎技术知识分享
核移植法流程图
目的基因克隆、纯化 胚胎干细胞或体细胞转染
阳性细胞筛选 阳性细胞提供核，进行去核卵母细胞核移植
胚胎体外培养至双细胞期 胚胎体内移植
产生克隆阳性个体 阳性个体的培育和建群
核移植法特点：
• 优点：可以进行基因定点的敲除和导入
后段工作相对简单
• 缺点：技术难度大
需要昂贵仪器
感谢：
感谢陈系古教授和马芸老师提 供部分的图片!!
Thanks！ 谢谢!
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
小鼠实验胚胎技术
小鼠实验胚胎技术
• 超数排卵：给予发情间期的母鼠一定量的
促进卵泡成熟和卵子排放的激素，母鼠可 以同时段排放比正常排卵数多一倍以上的 成熟卵子。
PMSG（孕马血清促性腺激素）：促进卵泡 成熟。
HCG（人绒毛膜促性腺激素）：促进卵泡成 熟和卵子排放。
• 假母：性成熟的母鼠在与结扎公鼠交配后，
克隆目的基因 构建载体
精子 载体法
雄原核 注射法
胚胎 感染法曲细精管 注射法胚胎 干细胞法核移植 法
目的基因随机整合入动物个体基因组
目的基因转录、翻译 产生蛋白和表现功能
转基因动物
构建的载体通过同源重组方式 整合入动物个体基因组的特定位点
靶基因被删除或灭活
靶基因不能转录、翻译，不能产 生蛋白和表现功能
2. 胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期~桑椹 期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝 素的作用下，形成一个融合胚胎，移植 后发育成一个个体。 聚合法的特点：不需要昂贵仪器，但成 功率低。
二、显微注射法
1. 成体细胞：将成体细胞显微注射入囊胚期胚胎 囊腔，移植后发育成一个个体。
利用小鼠胚胎干细胞进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧
利用小鼠胚胎干细胞进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧在生物学研究中，利用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，简称mESCs）进行活体动物模型的构建是一项重要的技术手段。
通过这种方法，科研人员可以研究不同疾病的发生机制、治疗方法以及新药的筛选等。
接下来，我们将介绍利用mESCs进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧。
首先，需要获取小鼠胚胎干细胞。
通常，科研人员会选择小鼠的早期胚胎作为胚胎干细胞的来源。
在实验室条件下，将小鼠受精卵取出放入培养皿中，培养合适的时长，使其发育到内细胞团阶段。
随后，将内细胞团取出，并经过适当的处理，分离出胚胎干细胞。
接下来，将获得的胚胎干细胞进行扩增。
通过在适当的培养条件下给予合适的培养基和生长因子，可以促进胚胎干细胞的增殖。
这个阶段需要控制好培养基的组分和培养条件，以确保胚胎干细胞的健康生长。
一旦胚胎干细胞经过扩增达到足够数量，就可以开始进行活体动物模型的构建了。
首先，需要选择合适的小鼠品系作为宿主动物。
常用的小鼠品系有裸鼠和免疫缺陷小鼠等。
这些小鼠具有较弱的免疫力，能够更好地接受外源细胞的移植。
将胚胎干细胞进行基因编辑后，将其注射或移植到选择的宿主小鼠体内。
注射的部位可以根据具体实验需要来确定，常见的有皮下注射和体腔注射等。
如果是构建特定器官的模型，可以将胚胎干细胞移植到对应的器官内。
注射或移植完成后，需要对小鼠进行适当的后续处理。
这包括观察小鼠的行为、收集样本进行分析和实验等。
需要注意的是，由于注射或移植过程对小鼠可能产生一定的创伤，因此需要进行必要的护理和监测，确保宿主小鼠的健康状况。
除了基本的操作步骤外，在利用mESCs进行活体动物模型构建的过程中，还有一些技巧和注意事项。
例如，在选择胚胎干细胞时，可以根据实验的需要选择具有特定基因突变的胚胎干细胞，以模拟特定疾病的发生机制。
此外，需要控制合适的细胞数量和注射或移植的时间点，以确保实验的准确性和稳定性。
小鼠实验胚胎技术
整理版ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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LIM1基因敲除无脑小鼠
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震颤小鼠与多发性硬化
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震颤小鼠与多发性硬化
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转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理
克隆目的基因 构建载体
精子 载体法
雄原核 注射法
胚胎 感染法
• 缺点：相对复杂
存在生物安全性问题 形成嵌合体 后期工作量大
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曲细精管注射法：
将外源基因注射入雄性动物的曲细精 管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随 机整合入受体基因组，再通过精卵受精产 生带有外源基因的个体。
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曲细精管注射法流程图
目的基因克隆、纯化
逆转录病毒载体的构建
雄性个体曲细精管注射
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嵌合体动物制作方法：
一、聚合法 1. 胚胎-胚胎：两个8细胞期~桑椹期的胚
胎去透明带后，在植物血凝素的作用下， 互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎， 移植后发育成一个个体。
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2. 胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期~桑椹 期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝 素的作用下，形成一个融合胚胎，移植 后发育成一个个体。
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胚胎干细胞法特点：
• 优点：可以进行基因定点的敲除和导入
• 缺点：环节多、过程复杂
需要昂贵仪器
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小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展郑晨光生科091 学号090304109(河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018)摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。
通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。
鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。
关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。
在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。
目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。
小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。
2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。
近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。
本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。
1 原始生殖细胞的发育雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。
大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。
PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。
对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。
也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。
在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。
2 生殖细胞分化的基因标记PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。
且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段的基因标记也不同。
ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细胞分化过程中的特异性标志。
2.1 减数分裂前生殖细胞分化的基因标记减数分裂前的基因标记包括O C T 4 、N A N O G 、S t e l l a 、G D F 3 、P U M 1 、P U M 2 、NANOS1, 其中NANOG 和PUM1 对果蝇和蠕虫的生殖细胞的形成有重要作用。
还有一些基因, 如c-kit、VASA、DAZL 从减数分裂前PGCs 阶段一直表达到生殖细胞分化完成, 是分化中的关键基因。
c-kit 在PGCs 的表达水平较高, 在PGCs 和造血细胞中, c-kit的表达活性和单个DNase I的高敏感位点相关。
c-kit原癌基因的2种产物在控制雄鼠的生育力方面发挥了双重作用。
c-kit的第1种产物是干细胞因子(stem cell factor, SCF)的跨膜酪氨酸激酶受体, 它表达于出生后睾丸组织中分化的精原细胞, 并发挥其功能。
第2 种是一种胞内蛋白tr-kit, 当通过选择基因启动子使精子发生时, 它有明显的聚集。
当它被注射到鼠的II 期卵中时, 可以触发卵的激活。
在减数分裂的起始, c-kit停止表达, 而tr-kit则在精子发生的减数分裂后期表达。
干细胞因子/kit配子的跨膜受体由白斑基因编码, 它在PGCs 的正常扩增、存活和移行中发挥重要作用。
雌激素刺激Steel基因转录, 增加kit配子的产物, 最终促使PGCs 的正常生长。
在原肠胚后期, OCT4 仅在PGCs 上表达, 且在其全能性上有重要作用。
用基因打靶的技术可以证实, OCT4 的缺失会引起PGCs 的凋亡。
OCT4在不同性别的生殖细胞中表达不同, 雌性胎儿在出生后,OCT4在生殖腺中的表达迅速降低, 在卵子进入第一次减数分裂时就不再表达, 在雄性则一直表达到生殖母细胞的形成和婴儿期的精原细胞中。
DAZ (deleted in azoospermia, DAZ) 基因家族的成员也可用来作为生殖细胞鉴定的标志, 因为它们只在生殖细胞中表达。
D A Z 基因的同系物D A Z L(DAZ-like, DAZL) 的蛋白质产物在大部分雄性和雌性的生殖细胞中都表达, 且对于PGCs 的发育和PGCs来源的生殖细胞的成熟和分化都是必需的。
基因fragilis和Stella在生殖细胞的发育中起到了重要的作用, 它们是PGCs和减数分裂前生殖细胞的特异基因, 在生殖细胞的特化中发挥作用。
fragilis是一种跨膜蛋白, 也是一种干扰素诱导蛋白。
它的表达在PGCs的移行期增加, 它还有抗增殖作用, 可用来延长PGCs中细胞周期的时间。
fragilis和Stella在ESCs和胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG)中亦有表达, 说明它和上述细胞的全能性有关; Stella和染色体重组及RNA 转录后加工相关。
将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP) 作为Stella基因的报告基因制成转基因小鼠, 可以精确地显示PGCs 的发育过程。
2.2 减数分裂和减数分裂后生殖细胞分化的基因标记减数分裂和减数分裂后阶段特异的基因标记有VASA、联会复合体1, 3( SCP-1, 3), TEKT1等, 经过减数分裂后就可形成单倍体精子细胞。
VASA从减数分裂前就开始表达, 它一直表达到减数分裂后生殖细胞的形成。
VASA 是一种细胞质蛋白, 它只在卵巢和睾丸中表达, 是生殖细胞高度特异的标志。
VASA 同源基因Mvh 的表达产物由生殖嵴的体细胞诱导产生。
Mvh 基因的变异将会导致PGCs 分化和扩增的缺陷。
Toyooka 等将ESC 分化后表达阳性Mvh 的细胞植入小鼠的睾丸中, 最后形成了具有精子形态学特征的细胞。
SCP3 的表达对于第一次减数分裂的启动具有重要作用, 是联会复合体轴侧成分的一部分, 是检测哺乳动物发生减数分裂转变的高度特异性标志。
TEKT在小鼠精母细胞和圆形精子细胞中可检测到,随着精子发生, TEKT1消失, 在变长的精子尾侧端检测到TEKT1 强阳性, 推测TEKT1 与中心体有关,可能参与成熟精子鞭毛轴丝的核化和基体组装,因此TEKT1 是精子细胞分化后期的特异标志。
2.3 其它分子标志物除了这些基因的表达, 还有一些其它的标志物:非特异性碱性磷酸活性、阶段特异性胚胎抗(stage-specficembryonicantigen, SSEA)、1和6抑制素及骨形态发生蛋白等。
通过以上这些标志物, 研究者可以从胚胎干细胞形成的拟胚体中分离出GSCs, 并进一步分化为精子细胞。
PGCs具有较高的AKP活性, 但是现在还并不清楚该酶的活性对于这些细胞的生存是否必需。
在PGCs分化为GSCs的过程中, AKP活性降低, c-kitSSEA-1 的表达降低。
在GSCs 阶段又有新的表面标志, 如1和6抑制素, c-kit在分化为A型精原细胞时再次出现。
BMP 是转化生长因子超家族的成员, 它和PGCs 的特化有协同效应。
其胚外胚层分泌BMP-4 和BMP-8b的功能最重要, 它们单独并不能诱导外胚层分化为PGCs, 二者一起和受体复合物结合, 可将信号传递给转录因子, 进而导致目的基因的表达。
BMP-4 通过PGCs 和卵原细胞上的Alk3 和R-Smad 受体影响这些细胞, 所以将它添加到ESCs 和GSCs 培养体系中, 将促使ESCs 分化为生殖细胞[4]。
细胞分化是基因调控选择性表达的结果, 上述基因在ESCs、PGCs 和GSCs 阶段的关闭和开放, 初步观察了精子细胞诱导过程中的基因表达, 为进一步研究人类生殖细胞的发育提供了非常有价值的参考。
3 人类应用和展望2006年, Nagernia等已成功地从小鼠的ESCs中分化出不成熟的精子细胞。
然后把这些细胞注射到小鼠的卵子中, 结合后的胚胎被移植到雌鼠体内。
最终分娩出小鼠并长成成年小鼠[6]。
但是, 目前在ESCs分化为精子细胞上的研究还仅停留在动物实验阶段。
ESCs 培养与分化的研究不但可以促进对人和动物生精机制的理解, 还为生精功能阻滞的患者提供了一条解决生育难题的途径, 为众多不孕不育患者带来了新的希望。
近40 年来, 国内外大量研究者在体外诱导生精细胞减数分裂以及减数分裂后分化上做了大量工作[27], 但由于对生精细胞发育分化微环境缺乏足够的了解以及分离纯化各级生精细胞存在困难等原因, 到目前为止,成熟的生精细胞体外培养分化系统仍未建立。
十余年来, ESCs研究成果巨大, 名列十大科学进展首位, ESCs向精子细胞的定向分化对于充分理解精子细胞发育中的调控具有特别重要的意义, 对解决上述问题也有借鉴之处。
由于鼠和人的ESCs 有种属差异, 影响鼠ES 细胞分化为精子细胞的基因调控是否也会对人ESCs的分化产生影响？如何才能提高ESCs 诱导为生殖细胞的效率? 雄性配子和雌性配子在分化上的共性和差异在哪里? 在体外将胚胎干细胞分化为精子细胞并进一步形成胚胎, 对后代有无影响? 通过对这些问题的研究, 我们将会对生殖细胞的发育分化的分子潜能有更深的认识, 从而促进核移植技术的发展并进一步发掘其潜在的治疗价值。