克隆基因的检测和鉴定培训课件

18
不同克隆的酶切结果
克隆基因的检测和鉴定
19
筛选过程
A
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
克隆基因的检测和鉴定
20
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。
（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。
（3）电泳PCR产物。
3
第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:
Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
克隆基因的检测和鉴定
4
pBR322
克隆基因的检测和鉴定
5
2. pBR322抗菌素标记选择
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
克隆基因的检测和鉴定
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
克隆基因的检测和鉴定
14
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型 载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆中 分离质粒，电泳、比较 其分子量。
分子量 重组 载体
Marker 克隆基因的检测和鉴定 克隆
一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式：
克隆基因的检测和鉴定
31
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
15
二、酶切电泳筛选法
1. 原理：
根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱， 选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶 切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的 结果。
克隆基因的检测和鉴定
16
A
B
A或B
克隆基因的检测和鉴定
17
克隆基因的检测和鉴定
基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。
可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互
补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
克隆基因的检测和鉴定
10
2. 选择过程
克隆基因的检测和鉴定
11
-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。
克隆基因的检测和鉴定
12
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。 （只在特定条件下）。
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素 抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
克隆基因的检测和鉴定
9
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
半乳糖 +
-半乳糖苷酶
X-gal
半乳糖 +
1. 原理：
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝 深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段
（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌
一、原理：
1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌 株的突变型缺陷。
受体菌： his-
外源基因： his+
克隆基因的检测和鉴定
在不含组氨酸的 培养基中生长
13
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二 氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素 抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平 板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨 酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而 被环丝氨酸杀死。
克隆基因的检测和鉴定
7
无环丝氨酸培养基
克隆基因的检测和鉴定
8
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
22
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体）， 再用探针杂交。
只有带有插入片断的重组载体才能与探 针杂交，在底片上曝光显示。
克隆基因的检测和鉴定
23
酶切前
酶切后
载体
克隆基因的检测和鉴定
插入片断
24
Southern blot 筛选
（4）检查是否有PCR产物。
（5）PCR产物的长克隆度基因是的检测否和鉴与定 外源基因一致。
21
第四节 核酸杂交检测法
一、原理： 1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素
32P 或 125I 。
（2）非放射性标记
荧光素
克隆基因的检测和鉴定
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
克隆基因的检测和鉴定
6
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
克隆基因的检测和鉴定
28
缺点：需要电镜！
克隆基因的检测和鉴定
29
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样品。
主要检测插入片断 是否被转录。
从宿主细胞中提取 RNA，再用探针杂 交。
克隆基因的检测和鉴定
30Baidu Nhomakorabea
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且 表达出相应的蛋白质的外源基因。
克隆基因的检测和鉴定
第六讲 克隆基因的检测与鉴定
克隆基因的检测和鉴定
2
第六讲 克隆基因的检测与鉴定
第一节 载体表型选择法 第二节 根据插入基因的表型选择 第三节 DNA电泳检测法 第四节 核酸杂交检测法 第五节 免疫化学检测法 第六节 转译筛选法 第七节 真核生物重组基因选择方法
克隆基因的检测和鉴定
结果
克隆基因的检测和鉴定
25
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以 直接找出阳性菌落。
克隆基因的检测和鉴定
26
克隆基因的检测和鉴定
27
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时 候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳 定。电镜下可见一种R-环形结构。