克隆基因的检测和鉴定培训课件
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基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
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G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
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G
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TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
基因的克隆与表达PPT课件
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
专题八第一讲基因工程和克隆技术课件
本 DNA 连接酶构建的表达载体中仍存在限制酶Ⅱ的识别位点；
讲 栏
用限制酶Ⅱ切割后，编码控制细胞分裂素合成的物质就不能合
目 开
成了。
关
答案 D
专题八第一讲基因工程和克隆技术 课件
网络构建·自我诊断
第1讲
2.家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导 入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。
高频考点·命题示例
第1讲
必考点 1 基因工程 1.对基因工程基本工具的思考 本 (1)限制酶、DNA 连接酶、载体的化学本质一样吗？
讲
栏 答案 不一样。限制酶和 DNA 连接酶的化学本质是蛋白质，
目
开 载体的化学本质是核酸。
关
(2)限制酶和解旋酶有怎样的区别？
答案 限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条 链中特定的位置断开；而解旋酶是将 DNA 的两条链间的氢 键断开，从而形成两条单链。
第1讲
[自我诊断]
1.质粒是常用的基因工程载体。如图是某种天然土壤农杆菌 Ti
质粒结构示意图(标示了部分基因及部分限制酶作用位点)，据
图分析下列说法正确的是
本 讲 栏 目 开 关
()
专题八第一讲基因工程和克隆技术 课件
网络构建·自我诊断
第1讲
A.图中的终止子是由三个相邻碱基组成的终止密码
B.用农杆菌转化法可将该质粒构建的表达载体导入动物细胞
本
讲 C.用限制酶Ⅰ和 DNA 连接酶改造后的质粒无法被限制酶Ⅱ
栏
目
切割
开
关 D.用限制酶Ⅱ处理能防止该质粒构建的表达载体引起植物
疯长
专题八第一讲基因工程和克隆技术 课件
网络构建·自我诊断
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
37
⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
基因克隆的基本理论及实验技术ppt课件
基因克隆的基本理论及实验技术
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
人类基因定位与克隆PPT课件
-
3
物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠 序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基 对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。
以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布 于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定 位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的 cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设 计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较 并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂 交，使每隔100kb就有一个标志；
-
41
DNA指 纹
基因组中存在着多种重复序列，拷贝数从几个
到数十万个，可分为串联重复序列和分散重复序
列。根据个体重复序列拷贝的位置和数目的差异， 使 用 限 制 性 内 切 酶 ， 获 得 具 有 个 体 特 异 性 的 DNA 片段。可以作为亲缘关系或个人身份的鉴定。
绘制遗传连锁图的方法有很多，随着DNA多态性的开发， 使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态 性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随 机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)； 80年代后出现的有SSR(短串联重复序列，又称微卫 星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷 酸的多态性)分析。
2. 将以通过DNA序列分析确定导
致疾病的分子缺陷。
3.
绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白
化病（albinism）、苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU）
和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采取
《基因克隆操作过程》PPT课件
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
基因克编隆辑操pp作t 过程
GGATC CCTAG 5'
c)目的产物中 对应位置的序 5' 列不再是原来 的酶切位点
5'
14
（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接
CTGCAGNNNNNNNNNGGATCC GACGTCNNNNNNNNNCCTAGG
PstI
BamHI
GGATCC CCTAGG
BamHI
CTGCA G
a)连接产物中 目的基因的方 向是确定的。
2011-10-23
GATCC G
退火
GATCC G
CTGCA G G ACGTC
G GATCC CCTAG G
T4-DNA ligase
CTGCAG GACGTC
GGATCC CCTAGG
Takara网站提供的同尾酶信息
编辑ppt
12
2011-10-23
基因克隆操作过程
12
5'
TGATCA
ACTAGT
5'
BclI
5'
GGATCC
CCTAGG
BamHI
GGATCC
CCTAGG
5'
5'
T
5' GATCA
ACTAG 5'
T
5'
a)获得连接方 向不同的两种
5'
产物；
退火
T GATCC ACTAG G
DNA ligase
切
接
转
增 检
2011-10-23
基因克编隆辑操pp作t 过程
目的基因的克隆PPT课件(模板)
A ＝ 1 : ( 1~3 )
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
分钟，9000g×1分钟。备用。
载体和目标基因的连接反应
重组 DNA 技术的一般流程
重组子的筛选 （2）受体菌的选择与改造
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.
次选匹配粘端，载体脱磷
5ml离心管中，在吸附膜中央加入30 lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。
耐药性基因 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。
荧光质粒转染观察
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
载体摩尔数
目标基因片段碱基数×载体重量
目标DNA摩尔数
目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
➢ 如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
➢ 连接反应在灭菌的0.5ml离心管中进行。15 l体积反
应体系中：
加ddH2O使终体积为 Liner vector
15 l 50-100 ng
Target gene fragment
15- 30 ng
10×Ligase Buffer (已含有ATP) T4 DNA Ligase
1.5 l 1.O l
➢ 轻轻混匀，稍加离心, 14-16℃或4℃,O/N 。
分钟，9000g×1分钟。备用。
载体和目标基因的连接反应
重组 DNA 技术的一般流程
重组子的筛选 （2）受体菌的选择与改造
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.
次选匹配粘端，载体脱磷
5ml离心管中，在吸附膜中央加入30 lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。
耐药性基因 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。
荧光质粒转染观察
重组 DNA 技术的一般流程
➢ 目的DNA的获得 ➢ 目的DNA与载体的连接 ➢ 重组子导入受体细胞 ➢ 重组子的筛选和鉴定
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
NGF 基因的克隆(T-A克隆)
NGF-sense: NGF-antisense:
a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg
第6讲克隆基因的检测与鉴定
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。 1. 原理
抗原——抗体凝集反应。 2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入 基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时， 就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆中 分离质粒，电泳、比较 其分子量。
分子量 Marker
重 组 克 载体 隆
二、酶切电泳筛选法
1. 原理：
根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱， 选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶 切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的 结果。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素 抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平 板培养基选择重组克隆。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选过程
A
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
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基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。
可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互
补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
克隆基因的检测和鉴定
10
2. 选择过程
克隆基因的检测和鉴定
11
-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。
克隆基因的检测和鉴定
12
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。 （只在特定条件下）。
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
克隆基因的检测和鉴定
14
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型 载体分子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆中 分离质粒，电泳、比较 其分子量。
分子量 重组 载体
Marker 克隆基因的检测和鉴定 克隆
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
克隆基因的检测和鉴定
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素 抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平 板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨 酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而 被环丝氨酸杀死。
克隆基因的检测和鉴定
7
无环丝氨酸培养基
克隆基因的检测和鉴定
8
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素 抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
克隆基因的检测和鉴定
9
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
半乳糖 +
-半乳糖苷酶
X-gal
半乳糖 +
1. 原理：
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝 深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段
（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌
克隆基因的检测和鉴定
28
缺点：需要电镜！
克隆基因的检测和鉴定
29
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样品。
主要检测插入片断 是否被转录。
从宿主细胞中提取 RNA，再用探针杂 交。
克隆基因的检测和鉴定
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第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且 表达出相应的蛋白质的外源基因。
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不同克隆的酶切结果
克隆基因的检测和鉴定
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筛选过程
A
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
克隆基因的检测和鉴定
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三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。
（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。
（3）电泳PCR产物。
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二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体）， 再用探针杂交。
只有带有插入片断的重组载体才能与探 针杂交，在底片上曝光显示。
克隆基因的检测和鉴定
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酶切前
酶切后
载体
克隆基因的检测和鉴定
插入片断
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Southern blot 筛选
结果
克隆基因的检测和鉴定
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（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以 直接找出阳性菌落。
克隆基因的检测和鉴定
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克隆基因的检测和鉴定
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（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时 候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳 定。电镜下可见一种R-环形结构。
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第一节 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:
Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
克隆基因的检测和鉴定
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pBR322
克隆基因的检测和鉴定
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2. pBR322抗菌素标记选择
（4）检查是否有PCR产物。
（5）PCR产物的长克隆度基因是的检测否和鉴与定 外源基因一致。
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第四节 核酸杂交检测法
一、原理： 1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素
32P 或 125I 。
（2）非放射性标记
荧光素
克隆基因的检测和鉴定
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
克隆基因的检测和鉴定
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3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
克隆基因的检测和鉴定
第六讲 克隆基因的检测与鉴定
克隆基因的检测和鉴定
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第六讲 克隆基因的检测与鉴定
第一节 载体表型选择法 第二节 根据插入基因的表型选择 第三节 DNA电泳检测法 第四节 核酸杂交检测法 第五节 免疫化学检测法 第六节 转译筛选法 第七节 真核生物重组基因选择方法
克隆基因的检测和鉴定一、原：1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌 株的突变型缺陷。
受体菌： his-
外源基因： his+
克隆基因的检测和鉴定
在不含组氨酸的 培养基中生长
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2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二 氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
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二、酶切电泳筛选法
1. 原理：
根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱， 选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶 切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的 结果。
克隆基因的检测和鉴定
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A
B
A或B
克隆基因的检测和鉴定
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克隆基因的检测和鉴定
一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式：
克隆基因的检测和鉴定
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固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗