骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体修复犬股骨头坏死模型的实验研究

骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体修复犬股骨头坏死模型的实验研究目的探索骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体在骨坏死修复中的效果。

方法制备骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体，取23只杂种犬建立双侧股骨头坏死动物模型，随机分为三组。

空白组不做任何治疗；单纯纳米骨植入组植入纳米骨；纳米骨+骨髓间充质干细胞组植入复合了干细胞的纳米骨。

对植入后4、8、12w的股骨头行影像学观察以及组织学观察。

结果X射线检查：植入后12w，空白组犬股骨头有塌陷；单纯纳米骨植入组充填区与周围组织区别不明显，周边有新生骨小梁；纳米骨+骨髓间充质干细胞复合体植入组充填区近似周围组织，充填区分布有骨小梁。

组织学观察：4w时，空白组股骨头坏死区无明显变化，其他两组植入物降解和新骨替代；8w时，空白组股骨头负重区软骨面部分缺损，其他两组坏死区初步修复，可见成骨和材料降解；12w时，空白组坏死区仍未修复，部分股骨头有塌陷，其他两组坏死区修复，纳米骨+骨髓间充质干细胞植入组骨小梁结构形成。

结论单纯纳米骨植入组和纳米骨+骨髓间充质干细胞植入组在股骨头坏死成骨方面效果优于空白组，纳米骨+骨髓间充质干细胞植入组成骨更佳。

骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体对早期股骨头坏死的治疗有较好的应用前景。

标签：骨髓间充质干细胞；纳米晶胶原基骨；股骨头坏死；犬股骨头坏死是一种对髋关节具有特殊破坏性的退行性病变，病程长且致残率高，严重危害人民的健康。

对于成人早期股骨头坏死，行人工关节置换尚为期过早，因此如何有效地防止疾病的进一步发展，保护股骨头，延缓髋关节置换的手术时间，是值得关注的问题。

股骨头坏死早期病程长，在进展至退行性髋关节病变晚期的3～5年间是可以逆转的，早期发现并给予一种安全、有效、微创的治疗是医患双方共同追求的目标。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一类存在于骨髓基质中的多能成体干细胞，大量研究证明BMSCs不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性，还可分化成为软骨细胞、脂肪细胞等多种间叶组织细胞。

另外BMSCs具有获取方便，易于体外纯化扩增，易于基因修饰，不存在免疫排斥问题等优点。

因此，BMSCs 是目前骨组织工程的最佳种子细胞[1]。

骨坏死的病理转归中，血液供应的中断是最终引起临床改变的决定因素。

清除坏死病灶并尽可能重建血供是治疗骨坏死的重要手段。

在缺血坏死区，当病灶清除后，骨修复区的血供重建则依赖于毛细血管网的新生。

但由于患者从病变侵害形成至骨坏死出现均已经过长期的病程，局部的修复环境已发生了改变，缺乏利于血管形成的微环境，从而造成了患者即使充填了有效植骨材料，仍无法迅速及早期建立血供，进而影响其最终的疗效[2]。

实验利用现代分子生物学、组织工程学的研究进展，针对骨坏死病理学特点：局部骨组织血供中断、BMSCs成骨分化能力减退，构建适于骨坏死治疗的骨移植替代物，提高早期骨坏死的治疗效果。

在分离纯化犬BMSCs基础上，将BMSCs与纳米晶胶原基骨（nHAC）修复材料复合构建组织工程骨，为组织工程技术治疗骨坏死提供理论与实验依据，探索提高髓芯减压植骨术治疗骨坏死成功率的新途径。

1 资料与方法1.1一般资料健康成年杂种犬23只，18～24月龄，体质量（17.0±0.5）kg，雌11只雄12只，来源于连云港市东海县种犬养殖场，普通环境。

随机对照动物实验过程中对动物处置符合科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2方法BMSCs与纳米骨复合体的制备：取实验杂种犬骨髓分离培养BMSCs。

nHAC在PBS中漂洗30min共3次，在95%的乙醇中浸泡2h，用无菌滤纸吸去多余液体。

取第3代BMSCs长满后，消化细胞并将细胞配成2×109/L 细胞悬液，D-Hanks液冲洗后，用2.5 g/L的胰酶+0.01%的EDTA消化，吹打后离心，以1500r/min转速离心10min，去上清，加入少量培养液，振荡后计数，制成浓度为1×109/L的细胞悬液。

将材料放于96孔板内，1粒/孔，复合于2.5mm×2.5mm×2.5mm纳米骨上。

每孔接种上述细胞悬液200μL进行BMSCs与nHAC的复合培养，37℃体积分数为5%CO2恒温培养箱继续培养，2～3d换液1次，备用[3]。

1.3动物分组取造模成功后的股骨头坏死模型犬23只（骨膜部分剥离+髓腔破坏法成形左、右后肢股骨头坏死模型），隨机分为空白组11只、单纯纳米骨植入组11只、纳米骨+BMSCs复合体植入组11只。

造模及治疗方法：术区备皮后以30g/L戊巴比妥钠麻醉，取俯卧位，常规消毒、铺巾，髋关节后侧切口，从臀大肌与阔筋膜张肌之间进入，切断外旋肌群，暴露关节囊，外旋股骨，显露股骨头，不切断圆韧带，髋关节不脱位，保护周围组织，从股骨颈内后侧向股骨头内钻孔。

用直径为3mm钻头向股骨头内钻入约5.5mm，到达关节软骨下。

空白组不做任何治疗，常规关闭伤口；单纯纳米骨植入组在所钻空内植入一2.5mm×2.5mm×2.5mm纳米骨，常规关闭伤口；纳米骨+BMSCs组在所钻孔内植入一2.5mm×2.5mm×2.5mm复合了干细胞的纳米骨，常规关闭伤口。

术后给予青霉素钠肌注3d，6×104U/kg，1次/d，预防感染。

1.4检测指标①大体观察：实验动物术后一般情况观察。

普通X射线成像观察：各组实验动物术后4、8、12w的股骨头摄X射线片，观察股骨头外形变化情况。

②组织学观察：术后12w，空气栓塞法处死动物，标本经处理后进行苏木精-伊红染色、Massion染色和免疫组织化学检测VEGF。

③主要观察指标：①犬术后大体观察。

②各组犬术后X射线观察。

③各组犬术后组织学观察。

2 结果2.1实验动物数量分析实验选用健康成年杂种犬23只，造模成功23只，分为3组，术后无死亡，进入结果分析23只。

2.2犬术后大体观察结果实验动物麻醉清醒后正常饲养。

术后6h即正常饮水进食、正常活动，无跛行或瘫痪。

其中5例术后出现伤口红肿，后自行愈合，其他犬切口均Ⅰ期愈合。

2.3各组犬术后X射线观察空白组：4w股骨头无明显变化，8w股骨头负重区软骨面部分缺损，12w部分犬股骨头有塌陷。

单纯纳米骨植入组：术后4w充填区材料与周围组织结合松散，周边有反应带；8w后，充填材料与周围组织边界模糊；12w充填区与周围组织区别不明显，界限不清楚，周边有新生骨小梁。

纳米骨+BMSCs复合体植入组：术后4w充填区界限清楚，周边有一明显的反应带；8w周边反应带基本消失，开始有骨小梁长入充填区；12w充填区近似周围组织，无明显界限，整个充填区已分布有骨小梁，且排列基本规则。

2.4各组犬术后组织学观察结果空白组：术后4w，骨小梁稀疏变细，结构紊乱，有碎片出现，骨小梁骨细胞陷窝空疏；8w后，骨小梁进一步萎缩，结构紊乱并出现大量断裂骨小梁，偶可见骨小梁缺如，无新生骨小梁出现。

12w，骨小梁大量崩解，可见较大范围骨小梁缺失区域，无新生骨组织充填，骨髓纤维化变性，可见到股骨头塌陷现象，塌陷股骨头周围纤维组织包裹。

纳米骨植入组：术后4w，周边有少量成骨反应，新生组织向中心部长入；8w，周边有一定量骨形成，周边为骨形成带；12w，材料与周围组织边界模糊，材料中骨组织长入，材料少量降解，骨小梁替代，偶有新生骨髓腔形成。

纳米骨复合BMSCs植入组：术后4w，充填区周围有肉芽组织形成，间充质细胞大量增生，新生组织开始呈网状长入充填物，周边有明显的成骨反应，有较多的新骨形成，纤维肉芽样组织向nHAC长入；8w时，周边新骨带明显增宽，成骨反应向中心部推进，材料降解速度远快于纳米骨植入组；12w时，部分充填区为幼稚的骨小梁所占据，表面有较多的成骨细胞，部分充填区广布相对较成熟的骨小梁，但较正常骨小梁粗、排列不够规则，大量板层骨和新生骨髓腔形成，材料大部分降解。

3 讨论干细胞治疗股骨头坏死应严格掌握适应证，一般选择病变早期患者，早期病例指具有完好外形的股骨头，根据ARCO分期，应为I期II期病例”不应该有明显的囊性改变，III期病例由于有股骨头的塌陷，即使手术后有成骨表现，也难以阻止病变进一步发展至骨关节炎。

目前对于骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死机制的研究还仅限于由多能干细胞向成骨细胞或血管内皮细胞分化这一环节上，对于坏死各阶段的病理过程还可以在干细胞水平做更为深入的探索。

BMSCs是骨组织工程最佳的种子细胞本实验采用BMSCs作为种子细胞构建组织工程骨，并移植到骨坏死区域治疗骨坏死，具有明显优势。

BMSCs不仅可以促进血管形成，还可旁分泌多种细胞因子促进血管再生。

从而建立血管形成的良性循环，促进组织工程骨的快速血管化，同时阻断因缺血造成的骨坏死病理转归。

对于骨坏死的诊断，普通X射线检查是常规方法，但对其早期诊断价值不大。

本实验中普通X射线主要用于观察股骨头坏死晚期的塌陷情况和局部骨小梁形成情况。

实验采用的支架材料为nHAC，是在仿生的思路下和既有胶原-钙磷盐复合材料的基础上制备的一种新型纳米复合骨材料。

在微结构和成分两方面都与天然骨有相似性，纳米级的羟基磷灰石为主要矿物相；矿物与胶原分子自组装成周期排列结构；材料的孔隙结构与松质骨相同，孔隙率70%以上；分级结构与天然骨相同.该材料化学性能和物理性能均符合人体内环境要求，具有良好的生物相容性。

本实验组织学结果显示，nHAC在股骨头局部病理环境中有诱导成骨活性的能力，不断长入充填区的新生组织含有大量具有成骨潜能的细胞，作用于新骨，随着逐渐的降解，nHAC被形成的新骨所替代，说明这种nHAC不仅能有效地提高骨坏死病理条件下股骨头的骨修复能力，同时适宜新生组织的长入并能很好地完成材料的骨替代过程。

因此，nHAC具有较好的生物相容性和生物可降解性，有可能成为组织工程的优良载体。

复合BMSCs的nHAC在成骨方面更强。

术后4w即有明显的成骨反应和新骨形成，比单纯植入nHAC组成骨反应出现早且成骨能力明显提高。

随着活组织的长入和材料的逐渐降解，新骨形成不断向中心部延伸，12w基本修复了股骨头的骨缺损区。

临床上采用BMSCs复合nHAC将为股骨头坏死”保留股骨头”治疗提供新的材料、思路和方法，对早期股骨头坏死的治疗有较好的应用前景。

随着分子生物学和细胞生物学的迅速发展，骨髓间充质干细胞的研究也会更加深入，促进、支持骨髓间充质干细胞生长分化成熟的各种生物因子，模拟体内微环境的细胞外基质，将骨髓间充质干细胞有效的分布在股骨头坏死局部等均将成为研究热点，并将取得重大突破，从而为股骨头坏死的微创治疗开辟新的纪元。

参考文献：[1] Kerachian MA，Harvey EJ，Cournoyer D，et al. Avascular necrosis of the femoral head：vascular hypotheses.Endothelium.2006；13（4）：237-244.[2]Jiang F，Huang CL，Cheng X. Jiefangjun Yixue Zazhi.2007；32（12）：1232-1235.[3]Fukuchi Y，Nakajima H，Sugiyama D，et al. Human placent aderivedcell shave mesenchymal stem progenit or cell potential.Stem Cells.2004；22（5）：649-658.編辑/许言。