血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验
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6.漂洗：
将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂 洗3次，每次5 min,直至背景蓝色脱尽，条 带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹 风机冷风吹干或者自然晾干。
8.记录和分析实验结果
透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大 小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的 薄膜可作扫描或照相。
4.电 泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点 样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴 滤纸桥并绷直，中间不能下垂。
连接好电泳仪。在室温下电泳，恒压110V，打开电 源开关，电泳时间60 min。电泳后，调节旋钮使电压为零， 关闭电泳仪切断电源。
5.染色：
电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑 10B染色液的培养皿中浸泡5min，染色时 可置于摇床，均匀摇晃。
4、点样应点在薄膜的粗糙面上，点样量要适量，不宜过多 或过少。
5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样 面向下。
6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太 短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进 行复染。
思考题
1.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？
2.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？
实验二（P124）
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）
实验目的
1、掌握电泳法分离蛋白质的原理
2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法
3、学习蛋白质染色的方法
分离蛋白质的方法
❖ 缓冲液pH=8.6
❖ pI＜pH
血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动
醋酸纤维薄膜电泳
• 醋酸纤维薄膜作为支持介质
• 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯， 溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度 为0.1～0.15mm
染色剂
• 一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽 春红
• 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂
以蛋白质为例：
COO-
H＋
Pr
NH2
OH－
pH>pI
COO-
H＋
Pr
OH－
NH3+
pH=pI
COOH
Pr
NH3+
pH<pI
影响电泳迁移率的因素：
1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、 蛋白的大小和形状
2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象
血清中几种主要蛋白组分：
正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白ห้องสมุดไป่ตู้2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样 原点
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。
2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜 吸水量以不干不湿为宜。
3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜 或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
血清蛋白质 清蛋白
α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白
等电点 4.64 5.00 5.06 5.12 6.85～7.3
分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～150,000 156,000～950,000
占总蛋白的％ 57～72 2～5 4～9 6.5～12 12～20
分离方法
沉淀法 层析法 电泳法
盐析法 有机溶剂沉淀法
薄膜电泳 等电聚焦电泳 聚丙烯酰胺电泳
离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析
实验原理
电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相
反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不
同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的 电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它 们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。
• 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色
3.点样：
点样前，将薄膜粗糙面朝上，距一边1.5cm处用 铅笔划一条平行线作为点样标志区。
点样时，用点样器毛吸取血清，在薄膜粗糙 面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴 极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。
1.5cm
6.5cm
点样区
醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）
小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病 骨髓瘤 肾病综合症 肾炎 肝硬化 急性肝坏死 传染性肝炎 急性感染初期 慢性炎症/感染后期 低球蛋白血症
清蛋白 α1球蛋白
↓
↓
↓*
↑
↓
↑*
α2球蛋白
↑* ↑*
↑ ↑* ↑*
β球蛋白
↑* ↑
γ球蛋白
↑*
↑ ↑* ↑ ↑* ↑* ↑* ↓*
将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂 洗3次，每次5 min,直至背景蓝色脱尽，条 带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹 风机冷风吹干或者自然晾干。
8.记录和分析实验结果
透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大 小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的 薄膜可作扫描或照相。
4.电 泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点 样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴 滤纸桥并绷直，中间不能下垂。
连接好电泳仪。在室温下电泳，恒压110V，打开电 源开关，电泳时间60 min。电泳后，调节旋钮使电压为零， 关闭电泳仪切断电源。
5.染色：
电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑 10B染色液的培养皿中浸泡5min，染色时 可置于摇床，均匀摇晃。
4、点样应点在薄膜的粗糙面上，点样量要适量，不宜过多 或过少。
5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样 面向下。
6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太 短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进 行复染。
思考题
1.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？
2.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？
实验二（P124）
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）
实验目的
1、掌握电泳法分离蛋白质的原理
2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的 原理和操作方法
3、学习蛋白质染色的方法
分离蛋白质的方法
❖ 缓冲液pH=8.6
❖ pI＜pH
血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动
醋酸纤维薄膜电泳
• 醋酸纤维薄膜作为支持介质
• 醋酸纤维薄膜：将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯， 溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度 为0.1～0.15mm
染色剂
• 一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽 春红
• 糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂
以蛋白质为例：
COO-
H＋
Pr
NH2
OH－
pH>pI
COO-
H＋
Pr
OH－
NH3+
pH=pI
COOH
Pr
NH3+
pH<pI
影响电泳迁移率的因素：
1、内在因素：蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、 蛋白的大小和形状
2、外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离 子强度和电渗现象
血清中几种主要蛋白组分：
正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白ห้องสมุดไป่ตู้2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样 原点
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。
2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜 吸水量以不干不湿为宜。
3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜 或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
血清蛋白质 清蛋白
α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白
等电点 4.64 5.00 5.06 5.12 6.85～7.3
分子量 69,000 200,000 300,000 90,000～150,000 156,000～950,000
占总蛋白的％ 57～72 2～5 4～9 6.5～12 12～20
分离方法
沉淀法 层析法 电泳法
盐析法 有机溶剂沉淀法
薄膜电泳 等电聚焦电泳 聚丙烯酰胺电泳
离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析
实验原理
电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相
反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不
同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的 电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它 们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。
• 脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色
3.点样：
点样前，将薄膜粗糙面朝上，距一边1.5cm处用 铅笔划一条平行线作为点样标志区。
点样时，用点样器毛吸取血清，在薄膜粗糙 面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴 极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。
1.5cm
6.5cm
点样区
醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）
小知识：血清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病 骨髓瘤 肾病综合症 肾炎 肝硬化 急性肝坏死 传染性肝炎 急性感染初期 慢性炎症/感染后期 低球蛋白血症
清蛋白 α1球蛋白
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α2球蛋白
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β球蛋白
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γ球蛋白
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