药用植物组织培养与脱落酸_房慧勇
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药用植物组织培养的一个重要任务是通过离体方式保 存珍稀濒危物种，在进行短期至中期药用植物离体保存时， 通常应用特殊条件的组织培养方法以减慢植物细胞的生长 速度来实现。用于慢生长保存最常用的方法是改变培养条 件或者环境条件，例如降低环境温度、光照强度或氧的浓度， 也可以延长继代培养的间隔时间、添加生长抑制剂、渗透调 节物质或者使用生长速度最慢的培养基，此外，还可以通过 改变矿物质和蔗糖 的 浓 度 来 达 到 抑 制 生 长 的 目 的［31-32］ 。 脱 落酸具有显著抑制组培苗生长的作用，而且保存后的苗容易 恢复生长。近年来，研究人员开展了一系列关于脱落酸在药 用植物离体保存中的作用的研究。Silva 等研究表明，脱落酸 能够显著降低钩状胡椒 Piper aduncum 试管苗的生长速度，
药用植物
龙胆 Gentiana scabra 赤桉 Eucalyptus camaldulensis 石刁柏 Asparagus officinalis 芦苇 Phragmites communis 枸杞 Lycium barbarum 紫苜蓿 Medicago sativa 海枣 Phoenix dactylifera 芦苇 Phragmites communis 半夏 Pinellia ternata 番石榴 Psidium guajava 补骨脂 Psoralea corylifolia 银杏 Ginkgo biloba 铁皮石斛 Dendrobium candidum 西伯利亚百合 Lillium siberia 枸杞 Lycium barbarum
脱落酸在药用植物组织培养中还用于促进体细胞胚成 熟和胚胎成熟过 程 中 营 养 物 质 的 合 成 与 积 累［14］，同 时 也 是 体细胞胚萌发和休眠的重要控制因子，能诱导体细胞胚进入 休眠状态［15］ ，因此脱 落 酸 可 用 于 人 工 种 子 研 制［16］ 。 脱 落 酸 还可以充当内源信使调节植物水分利用，能关闭气孔，抑制 蒸腾［17］，在组培苗炼苗过程中阻止水分的散失，提高炼苗成活 率。脱落酸在药用植物组织培养中具有多种作用，近年来脱落 酸应用于药用植物组织培养情况及其发挥的作用见表 1。 2 脱落酸在药用植物离体保存中的应用
第 38 卷第 1 期 2013 年 1 月
Vol. 38，Issue 1 January，2013
表 1 脱落酸在药用植物组织培养中的应用及其作用 Table 1 The application and function of abscisic acid on the tissue culture of medicinal plant
［稿件编号］ 20120706001 ［基金项目］ 国家科技部支撑计划项目（ 2012BAI28B02） ； 河北省教 育厅科学技术研究计划项目（ 2010114） ； 贵州省中药现代化科技产业 研究开发专项（ 黔科合中药字［2011］5042 号） ； 河北大学医学学科专 项资金建设项目（ 2012A3004） ［通信作者］ * 房慧勇，E-mail： huiyongfang@ gmail. com； * 李旻辉， E-mail： li_minhui@ yahoo. cn
第 38 卷第 1 期 2013 年 1 月
Vol. 38，Issue 1 January，2013
药用植物组织培养与脱落酸
房慧勇1* ，朱虹2 ，尧建勋3 ，贾彩凤1 ，单高威1 ，李旻辉2*
( 1. 河北大学 中医学院，河北 保定 071002; 2. 内蒙古科技大学 包头医学院，内蒙古 包头 014060; 3. 贵州永昌中药发展有限公司，贵州 贵阳 550018)
2 mg·L － 1 的脱落酸预处理 7 d 后，细胞内水分下降变慢，不 经蔗糖和脱落酸处理的愈伤组织如果脱水到 25% 以下就会 死亡，而处理过的愈伤组织脱水到 20% 的时候，仍有 20% 左 右的愈伤组织能够成活［28］。
关于脱落酸提高植物细胞或组织成活率的确切机制尚 未被阐明，有待 深 入 研 究。根 据 已 有 研 究 结 果 分 析，可 能 的 机制为： 首先，用脱落酸预处理过的材料能显著减少水分的 散失，保持细胞的完整性； 其次，脱落酸能够提高细胞内淀 粉、蛋白质的含量，尤其是小分子蛋白质的大量积累，甚至诱 导产生多种新的蛋白质。因而，材料的耐脱水性和抗冻性得 以提高，在利用防冻剂进行玻璃化处理的过程中，对细胞的 损伤减小，超低温冷冻过程中，形成的冰晶大幅度减少，从而 使细胞保存后的活力显著增强，提高复活率［37，40］。 3 脱落酸对药用植物无菌苗炼苗的影响
超低温保存是目前适合中长期保存植物材料和种质资 源的常用技术，应用最为广泛的是玻璃化法超低温保存，此 法的一个关键步骤是在把植物材料投入液氮之前提高植物 组织的耐脱水性［28，37］。而获得耐脱水性的常用方法是把组 织培养材料在高浓度蔗糖中预培养 1 ～ 7 d，或者分为两步预 培养。例如对龙胆 Gentiana scabra 无菌苗的不定芽进行超低 温保存时，首先要应用 0. 1 mol· L － 1 低浓度的蔗糖处理 11 d，然后用 0. 4，0. 7 mol·L － 1 的高浓度蔗糖分别培养 1 d，这 样，不 定 芽 的 耐 脱 水 性 及 保 存 后 的 恢 复 能 力 明 显 增 强［18］。 如果预培养时应用脱落酸，植物组织的耐脱水性的提高更为 显著。例如将西洋参 Panax quinquefolius 的茎尖和子叶进行 低温预处理 15 d 时添加 0. 3 mol·L － 1 的蔗糖和 1 mg·L － 1 的脱落酸，并继续预处理 7 d，然后投入液氮中保存，冷冻成 活率大幅度提高［38］。秋海棠 Begonia x erythrophylla 的不定 枝对脱水和冷冻都非常敏感，单独使用蔗糖处理的效果不很 明显，但是，配合使用脱落酸进行预处理后，冷冻成活率能够 提高 50% 以上［39］。银杏 Ginkgo biloba 的愈伤组织用蔗糖和
脱落酸是植物正常生长所必须的生长调节剂且其含量 受多种因素控制［4-5］ ，在 组 织 培 养 中 通 常 作 为 生 长 抑 制 剂 使 用［6-7］ ，但有时也具 有 生 长 促 进 作 用。 当 脱 落 酸 单 独 做 外 源 激素使用时，可以抑制芽的再生，但是，当与其他外源激素配 合使用时，却具有极显著地促进芽再生的效果。相关研究表 明，添加脱落酸能使药用植物组织培养中的分化和再生能力 显著提高，例如混合激素配方（ 6-卞氨基腺嘌呤 1 mg·L － 1 +
体细胞胚通常 难 以 长 期 保 存，即 使 在 低 温 环 境 下，也 会 因为生理成熟而发芽，使保存时间缩短［35］。研究表明，合子 胚的休眠能够大 大 延 长 离 体 保 存 时 间［35］，由 此 推 测 体 细 胞 胚在休眠状态下亦能延长保存时间。已有实验表明，利用高 浓度蔗糖诱导的西伯利亚人参 Siberian ginseng 休眠体细胞 胚中内源脱落酸 的 含 量 大 幅 度 升 高［36］，由 此 推 断 脱 落 酸 具 有诱导体细胞胚进入休眠状态的作用。因此，应用脱落酸有 望实现体细胞胚的长期保存或应用于人工种子的研制［16］。
［摘要］ 脱落酸在植物的许多生理过程中起着至关重要的作用，而且它在药用植物生物技术领域研究中的地位不断提 升。文章对脱落酸在药用植物组织培养和种质离体保存、改变药用植物次级代谢物的积累等方面的各种作用进行了综述。
［关键词］ 脱落酸； 组织培养； 炼苗； 超低温保存； 次级代谢
调控植物器官生长发育的主要因素有光照、温度、湿度、 土壤肥力等外在因素和植物激素等内在因素。不同生态条 件下生长的药用植物，其药效不同，原因在于外在的生态因 子影响次级代谢产物的积累，尤其是药用植物在受到外在因 素的胁迫时，其细胞和组织发生多途径相互协调的代谢途径 的改变，从而影响次级代谢产物的生成量［1］。药用植物在组 织培养时，其生长环境为包含植物生长调节剂、有机、无机元 素的合成培 养 基，与 母 体 差 别 很 大，因 此，在 这 种 极 端 条 件 下，体细胞的逆分化能力产生作用，细胞和组织的生长发育 发生适应性改变，已有研究表明，植物在离体条件下调控发 育方向的最重要因素是植物生长调节剂［2］，比如生长素、细 胞分裂素、赤霉 素、脱 落 酸 和 乙 烯 等 内 源 激 素。脱 落 酸 能 够 调节植物的生长和控制气孔的开闭，尤其在植物受到环境或 生物胁迫时发挥作用，因此，近几年来脱落酸以其独特的作 用和高活性受到了科学家们越来越多的重视，对其研究深度 与广度不断增加［3］。本文主要针对脱落酸在药用植物组织 培养方面的研究成果进行综述并展望其应用前景。 1 脱落酸在药用植物组织培养中的功能及应用
研究发现，炼苗期间，白及 Bletilla striata 无菌苗在合适 的基质和光照条件下，内源脱落酸含量大幅度升高［44］，这可
脱落酸作用
脱落酸预处理提高超低温保存的成活率 体细胞胚的成熟 改善体胚的发育、提高体胚转化为植株的能力 提高愈伤组织的耐热性 促进胚性愈伤组织及体胚的发生 在体胚发生过程中调节乙烯的合成 体细胞胚储存蛋白的积累 外源脱落酸减缓高温胁迫对愈伤组织的伤害 加快 PLBs 的增殖 诱导人工种子的体胚休眠及成熟 胚胎愈伤组织的诱导及体胚的发育和萌发 提高愈伤组织可溶性糖含量及超低温保存成活率 诱导原球茎分化为花芽 抑制鳞片叶的形成，促进鳞茎休眠 降低膜脂过氧化，增强膜的稳定性和细胞耐盐性
参考文献
［18］ ［19］ ［20］ ［21］ ［22］ ［23］ ［24］ ［25］ ［26］ ［16］ ［27］ ［28］ ［11］ ［29］ ［30］
Baidu Nhomakorabea
经过 6 个月的保存后，试管苗能够恢复生长能力，成为健壮 植株［33］。黄和平等研究也表明，添加 1. 0 mg·L － 1 的脱落酸 能够延 缓 盾 叶 薯 蓣 Dioscorea zingiberensis 试 管 苗 的 生 长 速 度［34］。
·14·
萘乙酸 0. 2 mg·L － 1 + 脱落酸 0. 5 mg·L － 1 ） 能够促进防风 Saposhnikovia divaricata 愈伤组织的分化，并且只有在添加脱 落酸时才能获得正常分化的胚状体［8］。还有学者研究发现， 单独使用脱落酸就能够明显促进细胞再分化进程，缩短再生 时间，提高再生率［9］。在黄独 Dioscora bulbifera 试管苗培养 基中添加低浓度的脱落酸（ 低于 1. 6 mg·L － 1 ） ，试管苗可以 正常生长，而添加高浓度的脱落酸却对试管苗生长有一定的 抑制作用［10］。脱落酸还能够诱导铁皮石斛 Dendrobium candidum 原球茎分化为花芽，经脱落酸诱导后，花芽形成率明显 高于不经过脱落酸 诱 导 的 原 球 茎［11］。 适宜浓度的脱落酸还 能够促进延胡索 Corydalis yanhusuo 试管苗根茎的形成［12］以及 丹参 Salvia miltiorrhiza 毛状根的生长［13］。
药用植物组织培养和快速繁殖商业化应用受限的主要 原因在于无菌苗难以度过炼苗期，在炼苗时大量死亡，导致 应用成本大幅度升高。植物在组培瓶中培养时，由于光照强 度低、湿度大、低 CO2 、大气压力均衡、矿质营养丰富、糖浓度 高，因而使药用植物苗几乎处于异养生长状态。这种苗转到 自然界后，因为 对 外 部 环 境 的 不 适 应，大 部 分 苗 会 死 亡［41］。 为了提高无菌苗成活率，需进行炼苗，在此过程中，无菌苗的 形态特征发生 变 化，茎 叶 表 面 的 蜡 质 层 增 厚，气 孔 关 闭［42］。 炼苗过程中植物体内发生复杂的生理生化及信号传导过程， 多种酶活性增强，比如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、莽草酸脱氢酶、 肉桂醇脱氢酶、多酚氧化酶、β-糖苷酶等，从而导致细胞壁的 厚度增加、细胞防御机制被激活、细胞损伤被修复，因此，使 苗得以成活［43］。
药用植物
龙胆 Gentiana scabra 赤桉 Eucalyptus camaldulensis 石刁柏 Asparagus officinalis 芦苇 Phragmites communis 枸杞 Lycium barbarum 紫苜蓿 Medicago sativa 海枣 Phoenix dactylifera 芦苇 Phragmites communis 半夏 Pinellia ternata 番石榴 Psidium guajava 补骨脂 Psoralea corylifolia 银杏 Ginkgo biloba 铁皮石斛 Dendrobium candidum 西伯利亚百合 Lillium siberia 枸杞 Lycium barbarum
脱落酸在药用植物组织培养中还用于促进体细胞胚成 熟和胚胎成熟过 程 中 营 养 物 质 的 合 成 与 积 累［14］，同 时 也 是 体细胞胚萌发和休眠的重要控制因子，能诱导体细胞胚进入 休眠状态［15］ ，因此脱 落 酸 可 用 于 人 工 种 子 研 制［16］ 。 脱 落 酸 还可以充当内源信使调节植物水分利用，能关闭气孔，抑制 蒸腾［17］，在组培苗炼苗过程中阻止水分的散失，提高炼苗成活 率。脱落酸在药用植物组织培养中具有多种作用，近年来脱落 酸应用于药用植物组织培养情况及其发挥的作用见表 1。 2 脱落酸在药用植物离体保存中的应用
第 38 卷第 1 期 2013 年 1 月
Vol. 38，Issue 1 January，2013
表 1 脱落酸在药用植物组织培养中的应用及其作用 Table 1 The application and function of abscisic acid on the tissue culture of medicinal plant
［稿件编号］ 20120706001 ［基金项目］ 国家科技部支撑计划项目（ 2012BAI28B02） ； 河北省教 育厅科学技术研究计划项目（ 2010114） ； 贵州省中药现代化科技产业 研究开发专项（ 黔科合中药字［2011］5042 号） ； 河北大学医学学科专 项资金建设项目（ 2012A3004） ［通信作者］ * 房慧勇，E-mail： huiyongfang@ gmail. com； * 李旻辉， E-mail： li_minhui@ yahoo. cn
第 38 卷第 1 期 2013 年 1 月
Vol. 38，Issue 1 January，2013
药用植物组织培养与脱落酸
房慧勇1* ，朱虹2 ，尧建勋3 ，贾彩凤1 ，单高威1 ，李旻辉2*
( 1. 河北大学 中医学院，河北 保定 071002; 2. 内蒙古科技大学 包头医学院，内蒙古 包头 014060; 3. 贵州永昌中药发展有限公司，贵州 贵阳 550018)
2 mg·L － 1 的脱落酸预处理 7 d 后，细胞内水分下降变慢，不 经蔗糖和脱落酸处理的愈伤组织如果脱水到 25% 以下就会 死亡，而处理过的愈伤组织脱水到 20% 的时候，仍有 20% 左 右的愈伤组织能够成活［28］。
关于脱落酸提高植物细胞或组织成活率的确切机制尚 未被阐明，有待 深 入 研 究。根 据 已 有 研 究 结 果 分 析，可 能 的 机制为： 首先，用脱落酸预处理过的材料能显著减少水分的 散失，保持细胞的完整性； 其次，脱落酸能够提高细胞内淀 粉、蛋白质的含量，尤其是小分子蛋白质的大量积累，甚至诱 导产生多种新的蛋白质。因而，材料的耐脱水性和抗冻性得 以提高，在利用防冻剂进行玻璃化处理的过程中，对细胞的 损伤减小，超低温冷冻过程中，形成的冰晶大幅度减少，从而 使细胞保存后的活力显著增强，提高复活率［37，40］。 3 脱落酸对药用植物无菌苗炼苗的影响
超低温保存是目前适合中长期保存植物材料和种质资 源的常用技术，应用最为广泛的是玻璃化法超低温保存，此 法的一个关键步骤是在把植物材料投入液氮之前提高植物 组织的耐脱水性［28，37］。而获得耐脱水性的常用方法是把组 织培养材料在高浓度蔗糖中预培养 1 ～ 7 d，或者分为两步预 培养。例如对龙胆 Gentiana scabra 无菌苗的不定芽进行超低 温保存时，首先要应用 0. 1 mol· L － 1 低浓度的蔗糖处理 11 d，然后用 0. 4，0. 7 mol·L － 1 的高浓度蔗糖分别培养 1 d，这 样，不 定 芽 的 耐 脱 水 性 及 保 存 后 的 恢 复 能 力 明 显 增 强［18］。 如果预培养时应用脱落酸，植物组织的耐脱水性的提高更为 显著。例如将西洋参 Panax quinquefolius 的茎尖和子叶进行 低温预处理 15 d 时添加 0. 3 mol·L － 1 的蔗糖和 1 mg·L － 1 的脱落酸，并继续预处理 7 d，然后投入液氮中保存，冷冻成 活率大幅度提高［38］。秋海棠 Begonia x erythrophylla 的不定 枝对脱水和冷冻都非常敏感，单独使用蔗糖处理的效果不很 明显，但是，配合使用脱落酸进行预处理后，冷冻成活率能够 提高 50% 以上［39］。银杏 Ginkgo biloba 的愈伤组织用蔗糖和
脱落酸是植物正常生长所必须的生长调节剂且其含量 受多种因素控制［4-5］ ，在 组 织 培 养 中 通 常 作 为 生 长 抑 制 剂 使 用［6-7］ ，但有时也具 有 生 长 促 进 作 用。 当 脱 落 酸 单 独 做 外 源 激素使用时，可以抑制芽的再生，但是，当与其他外源激素配 合使用时，却具有极显著地促进芽再生的效果。相关研究表 明，添加脱落酸能使药用植物组织培养中的分化和再生能力 显著提高，例如混合激素配方（ 6-卞氨基腺嘌呤 1 mg·L － 1 +
体细胞胚通常 难 以 长 期 保 存，即 使 在 低 温 环 境 下，也 会 因为生理成熟而发芽，使保存时间缩短［35］。研究表明，合子 胚的休眠能够大 大 延 长 离 体 保 存 时 间［35］，由 此 推 测 体 细 胞 胚在休眠状态下亦能延长保存时间。已有实验表明，利用高 浓度蔗糖诱导的西伯利亚人参 Siberian ginseng 休眠体细胞 胚中内源脱落酸 的 含 量 大 幅 度 升 高［36］，由 此 推 断 脱 落 酸 具 有诱导体细胞胚进入休眠状态的作用。因此，应用脱落酸有 望实现体细胞胚的长期保存或应用于人工种子的研制［16］。
［摘要］ 脱落酸在植物的许多生理过程中起着至关重要的作用，而且它在药用植物生物技术领域研究中的地位不断提 升。文章对脱落酸在药用植物组织培养和种质离体保存、改变药用植物次级代谢物的积累等方面的各种作用进行了综述。
［关键词］ 脱落酸； 组织培养； 炼苗； 超低温保存； 次级代谢
调控植物器官生长发育的主要因素有光照、温度、湿度、 土壤肥力等外在因素和植物激素等内在因素。不同生态条 件下生长的药用植物，其药效不同，原因在于外在的生态因 子影响次级代谢产物的积累，尤其是药用植物在受到外在因 素的胁迫时，其细胞和组织发生多途径相互协调的代谢途径 的改变，从而影响次级代谢产物的生成量［1］。药用植物在组 织培养时，其生长环境为包含植物生长调节剂、有机、无机元 素的合成培 养 基，与 母 体 差 别 很 大，因 此，在 这 种 极 端 条 件 下，体细胞的逆分化能力产生作用，细胞和组织的生长发育 发生适应性改变，已有研究表明，植物在离体条件下调控发 育方向的最重要因素是植物生长调节剂［2］，比如生长素、细 胞分裂素、赤霉 素、脱 落 酸 和 乙 烯 等 内 源 激 素。脱 落 酸 能 够 调节植物的生长和控制气孔的开闭，尤其在植物受到环境或 生物胁迫时发挥作用，因此，近几年来脱落酸以其独特的作 用和高活性受到了科学家们越来越多的重视，对其研究深度 与广度不断增加［3］。本文主要针对脱落酸在药用植物组织 培养方面的研究成果进行综述并展望其应用前景。 1 脱落酸在药用植物组织培养中的功能及应用
研究发现，炼苗期间，白及 Bletilla striata 无菌苗在合适 的基质和光照条件下，内源脱落酸含量大幅度升高［44］，这可
脱落酸作用
脱落酸预处理提高超低温保存的成活率 体细胞胚的成熟 改善体胚的发育、提高体胚转化为植株的能力 提高愈伤组织的耐热性 促进胚性愈伤组织及体胚的发生 在体胚发生过程中调节乙烯的合成 体细胞胚储存蛋白的积累 外源脱落酸减缓高温胁迫对愈伤组织的伤害 加快 PLBs 的增殖 诱导人工种子的体胚休眠及成熟 胚胎愈伤组织的诱导及体胚的发育和萌发 提高愈伤组织可溶性糖含量及超低温保存成活率 诱导原球茎分化为花芽 抑制鳞片叶的形成，促进鳞茎休眠 降低膜脂过氧化，增强膜的稳定性和细胞耐盐性
参考文献
［18］ ［19］ ［20］ ［21］ ［22］ ［23］ ［24］ ［25］ ［26］ ［16］ ［27］ ［28］ ［11］ ［29］ ［30］
Baidu Nhomakorabea
经过 6 个月的保存后，试管苗能够恢复生长能力，成为健壮 植株［33］。黄和平等研究也表明，添加 1. 0 mg·L － 1 的脱落酸 能够延 缓 盾 叶 薯 蓣 Dioscorea zingiberensis 试 管 苗 的 生 长 速 度［34］。
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萘乙酸 0. 2 mg·L － 1 + 脱落酸 0. 5 mg·L － 1 ） 能够促进防风 Saposhnikovia divaricata 愈伤组织的分化，并且只有在添加脱 落酸时才能获得正常分化的胚状体［8］。还有学者研究发现， 单独使用脱落酸就能够明显促进细胞再分化进程，缩短再生 时间，提高再生率［9］。在黄独 Dioscora bulbifera 试管苗培养 基中添加低浓度的脱落酸（ 低于 1. 6 mg·L － 1 ） ，试管苗可以 正常生长，而添加高浓度的脱落酸却对试管苗生长有一定的 抑制作用［10］。脱落酸还能够诱导铁皮石斛 Dendrobium candidum 原球茎分化为花芽，经脱落酸诱导后，花芽形成率明显 高于不经过脱落酸 诱 导 的 原 球 茎［11］。 适宜浓度的脱落酸还 能够促进延胡索 Corydalis yanhusuo 试管苗根茎的形成［12］以及 丹参 Salvia miltiorrhiza 毛状根的生长［13］。
药用植物组织培养和快速繁殖商业化应用受限的主要 原因在于无菌苗难以度过炼苗期，在炼苗时大量死亡，导致 应用成本大幅度升高。植物在组培瓶中培养时，由于光照强 度低、湿度大、低 CO2 、大气压力均衡、矿质营养丰富、糖浓度 高，因而使药用植物苗几乎处于异养生长状态。这种苗转到 自然界后，因为 对 外 部 环 境 的 不 适 应，大 部 分 苗 会 死 亡［41］。 为了提高无菌苗成活率，需进行炼苗，在此过程中，无菌苗的 形态特征发生 变 化，茎 叶 表 面 的 蜡 质 层 增 厚，气 孔 关 闭［42］。 炼苗过程中植物体内发生复杂的生理生化及信号传导过程， 多种酶活性增强，比如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、莽草酸脱氢酶、 肉桂醇脱氢酶、多酚氧化酶、β-糖苷酶等，从而导致细胞壁的 厚度增加、细胞防御机制被激活、细胞损伤被修复，因此，使 苗得以成活［43］。