致病基因的定位与克隆(上)

1968
1970~1990s
2000~
• 人类基因组计划的实施和完成 • 基因组水平 • 芯片技术、第二代测序技术的商用 • 全基因组水平
11
2005~
基因定位路线图
疾病 定位 功能
基因
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基因克隆与定位技术路线
疾病 定位 功能 定位 基因 疾病 功能
基因
功能克隆
定位克隆
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功能克隆和定位克隆的比较:
放射性标记
Shouthern 印记 原位杂交
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• mRNA • cDNA • 基因组
定位克隆
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定位克隆
疾病
• 旧称为“逆向遗传学”，始 于20世纪80年代后期 利用遗传连锁或细胞遗传学 定位技术将致病基因定位于 染色体的特定区带。 定位：通过连锁分析找出与 目的基因紧密连锁的遗传标 记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段 内分离克隆所要的基因，并 进一步研究其功能。 •
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功能克隆的技术路线
蛋白质 mRNA/cDNA 基因组/染色体
1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序 列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA文库 或 基因组文库中筛选对应的编码基因。
蛋白质
抗体
表达文库筛选
2. 将异常蛋白质制成相应的抗体，从cDNA表达文库 中筛选相应克隆。得到克隆后，就可以通过DNA序 列分析确定导致疾病的分子缺陷。
(pl. loci), 1715, "locality," from L. locus "place," from O.Latin stlocus, lit. "where something is placed,"
2、等位基因（allele）:位于一对同源染色体的相同 基因座上的DNA片段互称等位基因。
• 更多的疾病未涉及到染色体变异
• 遗传标记与连锁分析
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3、复等位基因（multiple alleles）：在一个群体 中，一个特定的基因座上，可以有很多等位形式， 如 a1 、a2 、a3… an ，但对于每个人来说， 最多只能具有其中的两个。
5
基本概念
4、基因型（genotype）:是一个个体的遗传组成。一 般指一个特定的基因座上的等位基因。 5、表型（phenotype）：基因型和环境因素相互作 用所表达的、能够显示出的遗传性状。
致病基因的定位与克隆
Nov.14, 2012 北京协和医学院 王铮
1
两个问题
• 什么是基因? • 基因在哪里?
2
基因和染色体
• 基因 ——国家
• 染色体——大陆
3
基因定位
• 确定基因在染色体/基因组上的真实位置。
• 目的：构建临床表型——基因突变的桥梁
个体化治疗
4
复习：基本概念
1、基因座（locus）: 指一条染色体上的特定位置。
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功能克隆举例
• β珠蛋白基因的克隆
• 凝血因子VIII基因的克隆
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β珠蛋白基因的克隆
• mRNA
• cDNA
已知
放射性标记
• 基因组
Southern 印记 原位杂交
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凝血因子VIII基因的克隆
• • • • mRNA 部分蛋白序列 寡核苷酸探针 人基因组文库
未知 已知 推测 拼接 筛选
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DMD基因的克隆
• X染色体隐性遗传
– 多为男性患者 – 家系隔代传递
• 女性患者（X-常染色体平衡易位）
一项对若干女性DMD患者的细胞遗传学研究发现： 每个病例受累的常染色体不同， 但在X染色体上的断裂点总是Xp21。
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X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果
如果发生易位的X失活， 所以所有存活细胞 中失活的都是完整 则相当于有一条常染 色体也失活——致死。 的X染色体。

在传统的功能克隆中,基因功能的研究 先于基因鉴定和定位。

在定位克隆中,基因定位在先,随后再 鉴定基因。基因已鉴定后,可以进行基 因功能的选择性研究。
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功能克隆
15
功能克隆
• 从异常表型入手， 找出造成表型的基 因表达产物，比如 与代谢缺陷相关的 失活或缺失的酶， 异常的结构蛋白质 分子或mRNA等， 通过各种方法确定 基因，最后将相应 的基因定位。
疾病
性状 （疾病）
功能
蛋白质产 物（生物 学功能）
染色体定 位
从氨基酸序列 出发设计 DNA引物，从 文库调取基因
基因
得到基 因序列
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功能克隆
• 绝大部分分子病、遗传代谢病（生化代谢 酶缺陷）都是采取的这一策略。
– 白化病（albinism） – 苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU） – 镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease） – ……
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DMD基因的克隆
• X染色体隐性遗传
– 多为男性患者 – 家系隔代传递
• 女性患者（X-常染色体平衡易位） • 新生突变
一个无任何遗传缺陷家族史的男孩，患有DMD等4种X 连锁隐性遗传病。 细胞遗传学分析显示Xp21.1微缺失。
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DMD基因的克隆
• 两个研究小组分别采用两种不同的方 法克隆了DMD基因：
聚丙烯酰胺凝胶电泳区分STR标记的等位片段
1： (CA)19 2： (CA)25 3： (CA)27
8
遗传标记——SNP
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基因定位的层次
• 确定某个（某一系列）表型相关的基因所 在染色体上的位置
– 染色体 – 染色体区带 – 遗传图 – 物理图
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基因定位的发展
1911
•Wilson, 红绿色盲基因定位于X染色体上 •人类基因定位的先河 •Donahue, Duffy血型基因定位于1 号染色体上 •首次在常染色体上进行的基因定位 • 体细胞杂交、重组DNA、分子杂交和PCR等技术 • 基因定位的速度、数量明显加快
1931, from Ger. allel, abbrev. of allelomorph (1902), coined from Gk. allel- "one another" (from allos "other;" see alias) + morphe "form" (see Morpheus)
① 通过女性患者X-常染色体易位，克 隆了该基因的一部分。 ② 使用有Xp21.1微小缺失的男Fra Baidu bibliotek的DNA， 利用消减技术，获得了这个男孩X染色体中 缺乏的DNA片段。
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• 类似的策略：
– 粘多糖贮积症IVA型——GALNS基因
• AR，散发病例 • 一例新生突变患者，染色体缺失
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遗传标记与连锁分析
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遗传标记
• 可用于鉴别细胞、个体或物种的一段DNA 序列，其在染色体上的位置为已知。 • 在群体中等位基因频率大体相当，可以被 普遍检出的变异(variation)。 • 包括：
– 碱基的变化（RFLP, SNP） – 一段序列重复数（STR, VNTR, CNV）
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遗传标记——STR
3 2 1
疾病
遗传标记， 染色体定位
•
•
基因 序列
基因
mRNA cDNA 蛋白质产物 生物学功能
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功能
定位克隆
• 功能克隆——基因表达产物
• 定位克隆——染色体/基因组特征与表型的 关联性
染色体/基因组特征 染色体畸变
遗传标记——统计学分析
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利用染色体畸变进行定位克隆
最早利用定位克隆方法鉴定的基因主要 是借助于特定基因座的染色体畸变，DMD基 因的克隆是一个重要的例子。
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进行性肌营养不良症(DMD/BMD)
• 抗肌萎缩蛋白(dystrophin)遗传性缺陷所致的进行性 肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病
–发病率为1/3500 –XR遗传。
• 主要症状:
• 3---5岁发病 • 走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难 • Gower征阳性 • 进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大 • 10多岁下肢瘫 • 一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.