致病基因的定位与克隆(上)
基因工程(李立家)小题目及答案
基因工程试题及答案1.标记（探针）（已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。
带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。
使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。
1）切口平移标记: 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH 末端（这条链即成为引物）。
DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)2）随机引物标记: 能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。
DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。
3) PCR标记: 针对目的片段，设计好引物，以标记号的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针4）末端核苷酸转移法:P32和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA。
先用碱性磷酸酶处理去除DNA 5’的磷酸基团，多核苷酸激酶用于对缺乏5'-磷酸的DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。
补充：1）常用的标记物包括：P32的同位素标记；荧光探针标记的dNTP；生物素；地高辛2）应用：定性（是否转入该基因）；定量（含量的高低）；定位；成分（配对的程度、是否同源）2.PCR技术（试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。
）（1）PCR的概念：又称为聚合酶链反应,能在体外特异快速扩增DNA片段。
组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）（2）PCR技术的原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
名词解释-分子生物学
1、转录（Transcription）：以某一DNA链为模板，按照碱基互补原则形成一条新的RNA链的过程，是基因表达的第一步。
2、编码链：与mRNA 有相同序列的DNA 链3、下游：沿着表达方向的序列。
例如，编码区是在起始区的下游。
4、上游：转录起点之前的序列，例如，细菌启动子在转录单位的上游，起始密码在编码区上游。
5、启动子：结合RNA 聚合酶并起始转录的DNA 区域。
6、RNA聚合酶：使用DNA作为模板合成RNA的酶(正式应为DNA-依赖性RNA 聚合酶)7、终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。
DNA分子中终止转录的核苷酸序列。
8、转录单位：指RNA聚合酶起始位点和终止位点间的距离，可能包括不止一个基因。
9、初级转录本：与一个转录单位相对应的未修饰的RNA 产物。
10、组成型表达constitutive expression：个体发育的任一阶段，在所有细胞中都持续进行的表达。
一般是生命过程必需的基因。
11、负调控：在没有任何调节蛋白或其失活的情况下，基因表达；存在repressor的时候基因表达受阻。
12、正调控：在没有任何调节蛋白或其失活的情况下，基因关闭；存在activator的时候基因表达开启。
一般原核生物偏向负调控，原核生物的DNA裸露无保护，很容易启动转录，并翻译。
因此其细胞内的基因可以说是基本全部默认开启，因此在正常情况下原核细胞内存在大量不同的reressor阻遏着大量基因的转录。
细胞必须根据不同的条件，对一些被阻遏的基因进行去阻遏的调控，或对一些基因的表达进行阻止。
13、顺式作用元件cis-acting element DNA分子上的一些与基因转录调控相关的特定序列。
14、反式作用因子trans-acting factor一些与基因表达调控有关的蛋白因子。
15、顺式调控cis-acting regulation 一段非编码DNA序列对基因转录的调控作用，顺式正调控（启动子、增强子）；顺式负调控（沉默子）16、反式调控trans-acting regulation 转录因子作用于顺式作用元件对基因转录的调控。
图位基因克隆
图位基因克隆在生命科学的广袤领域中，图位基因克隆技术宛如一颗璀璨的明星，为我们揭示基因的奥秘、理解生命的密码提供了强大的工具。
它是一项复杂而精妙的技术，涉及众多学科的知识和技术手段，让我们一同走进这个神奇的世界，探寻图位基因克隆的奥秘。
要理解图位基因克隆，首先得明白基因在染色体上的位置并非随机分布，而是有着特定的规律和秩序。
而图位基因克隆就是基于这种位置信息来定位和分离目标基因的方法。
想象一下，染色体就像是一条长长的道路，基因则是这条道路上的一个个站点。
我们要找到特定的那个“站点”——目标基因，就需要有一张详细准确的“地图”。
这张“地图”就是遗传图谱和物理图谱。
遗传图谱是通过分析不同基因之间的遗传连锁关系构建而成，它就像是给我们指明了各个“站点”之间的相对距离和大致方向。
物理图谱则更加精确，它能告诉我们基因在染色体上的具体位置和实际距离。
有了这两张“地图”，我们就可以开始寻找目标基因的征程了。
首先，我们需要找到与目标基因紧密连锁的分子标记。
这些分子标记就像是道路上的路标，能帮助我们逐渐靠近目标基因。
通过对大量的个体进行基因分析和遗传标记检测，我们可以确定这些标记与目标基因之间的距离和位置关系。
接下来，就是通过染色体步移或者染色体跳跃等技术，逐步缩小目标基因所在的区域。
这就好比我们沿着道路一步步前进，不断接近我们的目的地。
在这个过程中，需要进行大量的实验和数据分析，每一步都需要严谨细致，容不得半点马虎。
当目标基因所在的区域被缩小到一定程度后，就可以利用基因文库筛选或者 DNA 测序等技术来确定目标基因的具体序列。
基因文库就像是一个装满了基因片段的宝库，我们要在其中找到我们所需要的那一片“拼图”。
而 DNA 测序则能让我们直接读取基因的“密码”，最终确定目标基因的身份。
图位基因克隆技术在农业、医学等领域都有着广泛的应用。
在农业方面，它可以帮助我们培育出更加优良的作物品种。
比如，通过克隆与抗病虫害相关的基因，我们可以让农作物拥有更强的抵御病虫害的能力，从而减少农药的使用，提高农产品的产量和质量。
医学遗传名词解释
染色质（chromatin）是由DNA、RNA、蛋白质等组成的复合物，是核基因的载体，在真核细胞间期呈伸展状态。
染色体（chromosome ）细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质凝缩而成的棒状结构。
常染色质(euchromatin)：细胞间期核内纤维折叠盘曲程度小，分散度大，染色较浅且具有转录活性的染色质。
异染色质(heterochromatin)：细胞间期核内纤维折叠盘曲紧密，呈凝集状态，染色较深且很少有转录活性的染色质。
由于雌性细胞中的两条X染色体中的一条发生异固缩，失去转录活性，这保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上，这种效应称为X染色体的剂量补偿(dosage compensation)。
基因(Gene）：遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位；负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。
微卫星DNA（Microsatellite）、STR（Short Tandem Repeat）、DNA指纹是由2—6bp重复单位构成核心序列，也称短串联重复序列(STR)，是一种广泛分布在人类基因组中的DNA片段，主要由核心序列拷贝数目的变化产生长度多态性，其在人群中存在个体间的高度变化，是DNA指纹的形成基础。
指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性,在群体中的发生频率不小于1 %，就称为单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）。
外显子（exon）内含子（intron）突变(mutation)：遗传物质所发生的可被检测和可遗传的改变；通常对机体有害。
广义：包括染色体和DNA的改变；狭义：指基因组DNA分子的碱基组成或其顺序的改变。
转换（transition）颠换（transversion）错义突变（missense mutation）同义突变（same sense mutation）无义突变（nonsense mutation）动态突变（Dynamic Mutation）人类基因组中的短串联重复序列，尤其是基因编码区或侧翼序列的三核苷酸重复，在一代代传递过程中重复次数发生明显增加，从而导致基因功能改变而产生疾病。
基因定位常用的方法
HAT选择系统： HAT选择系统： 选择系统
人的突变细胞株：缺乏HGPRT 人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK TK酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT HAT培养基中 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： HAT培养基： 培养基 为次黄嘌呤， HGPRT的底物 的底物， DNA合成提 H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提 供原料（核苷酸旁路合成原料） 供原料（核苷酸旁路合成原料） 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP DNA合成 TMP合成受抑 A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑 制） 在胸苷激酶（TK） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核 苷酸， DNA合成提供原料 苷酸，为DNA合成提供原料
1）概念： 概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染 色体上呈直线排列， 色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成 连锁群的原理， 连锁群的原理，即应用被定位的基因与同 一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的 特点进行定位。 特点进行定位。
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2）重组值（recombination fraction） fraction） 重组值（ 是基因定位时两个基因间遗传图距的量 即基因间的遗传距离。 度，即基因间的遗传距离。如果两个基因 间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 1%的重组值 间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 centimorgan，cM） （centimorgan，cM） 遗传标记（ marker） 3）遗传标记（genetic marker） 用连锁分析发法进行基因定位需要已知 的记忆内作为遗传标记， 的记忆内作为遗传标记，这些标记按孟德 尔方式遗传，标记位点应是多态的。 尔方式遗传，标记位点应是多态的。
基因定位常用的方法
定位克隆鉴定的第一批基因利用了特定基因座的染色体畸变，Duchenne肌营养不良(DMD)基因的克隆是一个重要的例子。
假肥大型肌营养不良症(DMD/BMD)
由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)遗传性缺陷所致的进行性肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病,发病率为1/3500，XR遗传。 主要症状:通常3---5岁发病,开始走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难,Gower征阳性.进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大,10多岁下肢瘫,一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.
3）原位杂交的特点： 杂交在载玻片上的中期染色体上进行，而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探针杂交，通过放射自显影来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强度来确定探针的位置，从而准确地进行基因定位。
因此在HAT培养基上
人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍）
鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）
将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。
基因定位与克隆
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
TK－ HPRT－
HAT选择系统 HAT选择系统
体细胞杂交
TK: chromosome 17
杂种细胞克隆嵌板
Hybrid clone A B C Human chromosome 1 + + + 2 + + 3 + + 4 + 5 + + 6 + 7 + 8 -
体细胞杂交
微细胞融合( 微细胞融合(microcell fusion)
人工建立的仅含有一条人类染色体 的杂种细胞， 微细胞， 的杂种细胞 ， 即 微细胞 ， 再与啮齿类细 胞进行融合。 胞进行融合。
体细胞杂交
区域定位(regional 区域定位(regional assignment)
依据染色体结构畸变的特点， 依据染色体结构畸变的特点 ， 建立 只含有特殊的部分人类染色体的杂种细 胞，再与啮齿类细胞进行融合。 再与啮齿类细胞进行融合。
定位克隆
Met A A Met Val Ser Leu Gln Pro
T G G T C T C A C T G C A A C C G
T G G Val T C T Ser C A C Leu T G T Stop A A C C G
候选克隆
候选克隆(candidate cloning)是一种 候选克隆 是 用定位和非定位的信息相结合来克隆致病 基因，即根据一些基因的位置、表达、功 基因，即根据一些基因的位置、表达、 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。 能或同源性相结合鉴定候选基因的方法。
候选克隆
定位候选克隆
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
医学遗传学名词解释
1先天性代谢缺陷( inborn errors of metabolism) 也称遗传性酶病，指由于遗传上的原因(通常是基因突变)而造成的酶蛋白质分子结构或数量的异常所引起的疾病。
根据酶缺陷对机体代谢的影响不同，将先天性代谢缺陷分为糖代谢缺陷、氨基酸代谢缺陷、脂类代谢缺陷、核酸代谢缺陷、内分泌代谢缺陷、溶酶体沉积病、药物代谢缺陷和维生素代谢缺陷等。
2遗传异质性( genetic heterogeneity)-种遗传性状可以由多个不同的基因控制//某一种遗传疾病或表型可以由不同的等位基因或者基因座突变所引起的现象。
与之相对反的是基因多效性，是由某一个基因突变引显的神疾有或表型。
速传异质性分为等位基因异质性和基因座异质性。
基因座异质性病是由不同基因座的基因突变引起的；等位基因异质性是指某一遗传病是由同一基因座上的不同突变引起的.遗传印记( genetic imprinting)一基因组印记(genomicimprinting)是一种DNA甲基化介导的表观遗传调节形式，是指两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默,另一个亲本等位基因保持单等位基因活性( monoallelice activity)。
是生殖细胞系的一种表观遗传修饰，与DNA甲基化调节作用有关。
这种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心来协调。
基因组特定区域有成簇排列的富含CpG岛的基因表达调控元件动态突变( dynamic mutation)：串联重复的三核苷酸的重复次数可随着世代交替的传递而呈现逐代递增的累加突变效应，称为动态突变。
（1）延迟显性(delayeddomi-nance )：一些带有显性致病基因的杂合子(Aa)在生命的早期，因致病基因并不表达或表达不足没有引起明显的临床表现，只有达到一定的年龄后才表现出相应的疾病临床症状，称为延迟显性（2）外显率( penetrance)是在一定环境条件下，群体中某一基因型个体表现出相应表型的百分率，外显率等于100%时称为完全外显，低于100%时则为不完全外显或外显不全。
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用复习过程
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。
与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。
从最初第一代以San ger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年，以lllumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing NGS)的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。
其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。
2009年3月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Scienee〉杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。
同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3致病基因突变和《Nat Gene》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。
此后，通过NGS技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS技术已成为里程碑式的进步。
2010年，《Scienee》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。
近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。
同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。
目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。
0521定位克隆-路李(课外)
基因型和连锁分析
DNA样本采集和纯化 基因组DNA的PCR扩增 380个不同形态的微卫星标记 基于标记的Two-point Linkage分析
– Disease－gene frequency – Two-point Linkage LOD scores
LOD值
LOD scores 连锁分数：lg（连锁概率/不连 锁的概率）
ห้องสมุดไป่ตู้
单体型分析
Haplotype Analyis
对保守序列的判定
2号常染色体的长臂2q35－2q36 标记D2S2248－D2S360之间
分析结果
两个家系的疾病可能由同一个基因的突变 引起 两个家系非同源：不共享同一个单体型（ haplotype）
进一步分析
家系中22，23，35号个体将定位间隔缩小 到介于D2S2249 和D2S1242 (2q35-q36)间 的8.1cM 。 区段候选基因:
Figure 4 Figure and toe features of family 2. The pictures provide the numbers of the individuals. All the affected members had phenotypes similar to those of family 1. In most affected individuals examined by radiography, the middle phalanges were missing (e.g., individuals 5, 7, and 11). Individual 19 had shortened middle phalanges in digits 2, 3, and 4. The proximal phalanges of the thumbs and digit 5 were markedly shortened and broadened in most of the affected members (e.g., individuals 5, 7, and 11). The affected family members also have thin shafts and broad epiphyses of metacarpals and proximal phalanges. The clinodactyly of fingers 5 and 4 was present in some affected individuals (e.g., individual 18 had clinodactyly in finger 5, and individuals 5 and 19 had clinodactyly in finger 4). Most of the affected had the proximal phalanges of digit 5 shortened, broadened, or both (e.g., individuals 5, 7, 11, and 18). Distal phalanges and metacarpals were also shortened in two affected members of this family (e.g., in individual 5, the distal phalanges, metacarpal 3, and metacarpal 5 were shortened; in individual 7, the distal phalanges were severely shortened).
基因定位与克隆
染色体畸变法
• 畸变常涉及两个位点，如果这两个位点之一正好 是某一功能基因所在的位置，染色体的畸变则肯 破坏该基因的正常功能而引起疾病，根据染色体 畸变的位置和疾病发生的关系，则可将致病基因 定位于染色体的某一特定位置上。
染色体异常进行基因定位---睾丸决定因子
Testis determining factor
•
体细胞杂交基因定位示意图
Miller等运用体细胞杂交证明胸苷激酶（TK）位于人的17 号染色体，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。
原位杂交法（FISH）
• 如果一个基因或基因的某一部分已经被克隆，则 可将该基因用同位素或荧光标记和染色体原位的 分子杂交，在染色体上恒定出现信号的区域即该 基因在染色体上的位置。同一染色体上的多个不 同的基因可用不同的荧光标记来鉴别他们在染色 体上的相对位置，运用这一方法在中期染色体上， 可区分两个相隔约2Mb的基因；在间期染色体上， 据称可鉴别仅相隔50kb的两个基因。
基因克隆： 基 因 克 隆 通 常 涉 及 到 将 构 成 某 一 基 因 的 基 因 组 DNA (genomic DNA ， gDNA) 或互补 DNA(complemantary DNA, cDNA) 插入某一载体内，利用载体在宿主细胞 ( 通常用大肠杆 菌)中大量繁殖而获得该基因的足够量的拷贝，以便于进行基 因的结构和功能的分析，广义的基因克隆也包括任何使基因或 DNA片段扩增的操作 。
• 采用Touchdown程序结合多重PCR反应方法， 将5～12种不同引物混合,放入同一管中进行扩增， 总反应体积5μl
疾病位点和染色体 4q24-26 上 15 个标记之间的两点 LOD 值
LOCUS D4S1560 D4S2966 D4S1572 D4S1570 D4S1564 D4S2945 D4S2989 D4S1616 D4S406 D4S193 D4S1613 D4S1522 D4S1612 D4S402 D4S427
第二十章疾病相关基因克隆
连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法
根据基因在染色体上呈直线排列,不同基因相 互连锁成连锁群的原理,即应用被定位的基因 与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的 特点进行定位
三 利用生物信息数据库
电子克隆(in silico cloning)
通过已获得的序列与数据库中核酸序列及蛋白 质序列进行同源性比较,或对数据库中不同物 种的序列比较分析,拼接,预测新的全长基因等, 进而通过实验证实,从组织细胞中克隆该基因
(一)从已知蛋白质功能和结构出发克隆 疾病基因
1 依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆 疾病相关基因
如果疾病相关的蛋白质在体内表达丰富,可分 离纯化得到一定纯度的足量蛋白质,就可用质 谱或化学方法进行氨基酸序列分析,获得全部 或部分氨基酸序列信息.色体上的候选区域 绘制目的区域的物理图谱 疾病相关基因的确定
基因定位的基本方法
体细胞杂交法(somatic cell hybridization)
又称细胞融合(cell fusion) , 是通过融合细胞 的筛查定位基因. 将来源不同(人与鼠)的两种细胞融合成一个新 细胞,在融合过程中人类染色体逐渐丢失,最后 只剩一条或数条,即可定位基因.
一 不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆 策略 二常用策略---定位克隆 三 生物信息数据库的利用
一 不依赖染色体定位的疾病相关基因克 隆策略
功能克隆(functional cloning)
在掌握或部分了解基因功能产物蛋白质的基础 上,鉴定蛋白质相关基因,进而克隆该基因 采用从蛋白质到DNA的研究路线
2 用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因
获得少量低纯度的蛋白质
免疫动物获得特异性抗体
直接结合正翻译过程 中的新生肽链,获得同 中的新生肽链 获得同 时结合在核糖体上的 mRNA分子 最终克 分子,最终克 分子 隆未知基因 筛查可表达的cDNA文 文 筛查可表达的 库,筛选出可与该抗体 筛选出可与该抗体 反应的表达蛋白质的阳 性克隆,获得候选基因 性克隆 获得候选基因
医学遗传学名词解释(人类基因组学)
医学遗传学名词解释(人类基因组学)1、基因组（genome）指某生命体的全套遗传物质。
2、基因组学(genomics) 是从基因组层次上系统地研究各生物种群基因组的结构和功能及相互关系的科学。
3、比较基因组学(comparative genomics) 是在基因组层次上比较不同生物种群之间的异同，探讨其含义。
4、疾病基因组学(morbid genomics) 是从基因组中分离重要疾病的致病基因与相关基因，确定其致病机制。
5、蛋白质组学(proteomics) 是研究组织细胞中基因组所表达的全部蛋白质，尤其是不同生命时期、不同生命状态、及不同环境条件下全部蛋白质的变化。
6、生物信息学(bioinformatics) 是生物学与计算机科学和应用数学交叉的一门科学，对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而达到揭示所含的生物学意义有重要作用。
7、遗传标记(genetic marker) 可以是任何一种呈孟德尔式遗传的性状或物质形式，可以是基因，血型，血清蛋白等，确定其在基因组中的位置后，可作为参照标记用遗传重组分析。
8、CpG岛(CpG is1and) 是哺乳动物基因组DNA中长约1000bp的CG重复序列，在基因组中含量高，约占基因组总量的1%。
几乎所有管家基因及约40%的组织特异性基因的5'端均有CpG岛，它易于甲基化，从而影响基因的表达活性。
9、表达序列标签（EST）是长约200~300bp的cDNA片段，它在基因组中的定位是不明确的。
这是由特定组织细胞中提取到mRNA后，经反转录酶催化而合成的。
由它可用不同方法获得全长cDNA，再经FISH定位在染色体上。
10、基因定位(gene mapping) 是运用一定的方法将各个基因确定到染色体的实际位置。
11、连锁分析( linkage analysis)是基因定位的一种方法。
基因在染色体上呈线性排列，在减数分裂后，由于同源染色体重组，可结合家系分析进行不同座位的基因间重组的统计，依据待定位基因与已定位基因之间的重组值分析，可确定二者之间的连锁关系和遗传距离而达到基因定位。
医学遗传学名词解释
第一章绪论无第二章遗传的细胞学基础1.常染色质：间期核内纤维折叠盘曲程度小、分散度大、能活跃地进行转录的染色质。
2.异染色质：间期核内纤维折叠盘曲紧密、呈凝聚状态，一般无转录活性的染色质，又分为结构异染色质和兼性异染色质两大类。
3.兼性异染色质：是在特定细胞的某一发育阶段由原来的常染色质失去转录活性，转变成凝缩状态的异染色质，二者的转化可能与基因的表达调控有关。
4. Lyon假说：（1）雌性哺乳动物体细胞内仅有一条X染色体有活性，其他的X染色体在间期细胞核中螺旋化而呈异固缩状态的X染色质，在遗传上失去活性。
（2）失活发生在胚胎发育的早期（人胚第16天）；在此之前所有体细胞中的X染色体都具有活性。
（3）X染色体的失活是随机的，但是是恒定的。
5.剂量补偿：由于正常女性体细胞中的1条X染色体发生了异固缩，失去了转录活性，这样就保证了男女性个体X染色体上的基因产物在数量上基本一致，这称为X染色体的剂量补偿。
第三章遗传的分子基础1.外显子和内含子：真核生物的基因为断裂基因，即结构基因是不连续排列的，中间被不编码的插入序列隔开，编码序列称为外显子，编码序列中间的插入序列称为内含子。
2.单一序列和高度重复序列：单一序列是在一个基因组中只出现一次或少数几次，大多数编码蛋白质和酶类的基因即结构基因为单一序列。
重复序列是指在基因组中有很多拷贝的DNA序列，有些重复序列与染色体的结构有关。
3.基因突变：是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。
4.转换和颠换：转换是指一个嘌呤被另一个嘌呤所取代，或是一个嘧啶被另一个嘧啶所取代。
颠换指嘌呤取代嘧啶，或嘧啶取代嘌呤。
5.同义突变：是指碱基替换使某一密码子发生改变，但改变前后的密码子都编码同一氨基酸，实质上并不发生突变效应。
6.错义突变：是指碱基替换导致改变后的密码子编码另一种氨基酸，结果使多肽链氨基酸种类和顺序发生改变，产生异常的蛋白质分子。
7.无义突变：是指碱基替换使原来为某一个氨基酸编码的密码子变成终止密码子，导致多肽链合成提前终止。
植物抗病基因的克隆与功能分析
植物抗病基因的克隆与功能分析在农业生产中，植物病害一直是影响农作物产量和质量的重要因素之一。
为了有效地防治植物病害，科学家们致力于研究植物的抗病机制，并对植物抗病基因进行克隆和功能分析。
这一研究领域的不断深入，为开发新的抗病品种和制定更有效的病害防治策略提供了重要的理论基础和技术支持。
植物抗病基因的克隆是研究其功能的前提。
克隆植物抗病基因的方法多种多样，其中最常用的是图位克隆法。
这种方法首先需要构建一个包含大量个体的遗传群体，然后通过对这些个体的抗病性表现和遗传标记进行分析，逐步将抗病基因定位在染色体的特定区域。
接着，通过精细定位和测序，最终确定抗病基因的序列。
除了图位克隆法，还有基于同源序列的克隆法。
许多抗病基因在结构和功能上具有一定的相似性，因此可以根据已知抗病基因的序列设计引物，从待研究的植物中扩增出同源序列，再通过进一步的分析和验证来确定是否为真正的抗病基因。
还有一种比较新的方法是基于转录组测序的克隆法。
通过对植物受到病原菌侵染前后的转录组进行测序和分析，可以筛选出在侵染过程中表达量显著变化的基因，这些基因很可能与抗病反应有关，进而从中鉴定出抗病基因。
成功克隆出植物抗病基因后，接下来的关键任务就是对其功能进行分析。
这通常包括对基因的表达模式、编码蛋白的结构和功能以及在抗病反应中的作用机制等方面的研究。
在研究基因表达模式时，常用的技术有实时荧光定量 PCR 和 RNA 原位杂交等。
通过这些技术，可以了解抗病基因在不同组织、不同发育阶段以及在受到病原菌侵染后的表达情况。
比如，有些抗病基因在叶片中高表达，而有些则在根部特异性表达；有些抗病基因在病原菌侵染早期就迅速被激活，而有些则在后期发挥作用。
对于编码蛋白的结构和功能分析，通常会采用生物信息学的方法对其氨基酸序列进行预测和分析，确定其可能的结构域和功能位点。
同时，还可以通过体外表达和纯化蛋白，进行酶活性测定、蛋白质互作等实验，进一步明确其功能。
生物信息学序列分析利用生物信息学进行功能基因电子隆技术
在对目的基因进行克隆时所采取的策略十分重要， 其途径大致分为： 正向遗传学途径 反向遗传学途径 电子克隆(in silicon cloning)——一种全新的方法。
正向遗传学是指通过生物个体或细胞的基因组的自 发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变， 然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应 的突变基因，并揭示其功能。功能性克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)等，如：遗 传病基因的克隆。
2.6 cDNA微阵列或芯片(DNA microarray or chip)技术
近年发展起来的又一新的分子生物学研究技术，其实验 包括6个步骤：将cDNA克隆加工为可供点印的材料；将 cDNA克隆(或寡核苷酸)点印到载体上；样品RNA的分离 (总RNA或mRNA)；探针的制备(例如cDNA的合成和标 记)；标记的探针DNA与载体上的DNA杂交；杂交结果的 成像和图象分析。主要应用于：基因表达水平的检测； 通过比较组织细胞基因的表达谱差异，可以发现新的可 能致病基因或疾病相关基因；可进行基因点突变、多态 性检测及染色体结构研究。其最为主要的优点是：可自 动、高效、同时检测目的材料中大量基因的表达情况； 并几乎可用于所有核酸杂交技术的领域。
然后以该D于植物基因的克隆，由于可供利用的转座子 的种类太少，而转座子在不同的植物中转座的频 率和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来 鉴定转座子突变个体，限制了转座子标签法的应 用范围。
二、电子克隆基因 （In silico cloning）
1. 功能性克隆(functional cloning) 1.1 纯化后克隆 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备 了免疫 筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利 用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。
重组dna技术名词解释
重组dna技术名词解释易患性：在多基因遗传病中，由遗传基础和环境因素共同作用，决定一个个体患病可能性的大小，称为易患性。
易患性低，患病的可能性小；易患性高，患病的可能性大。
在一定的环境条件下，易患性代表个体所积累致病基因数量的多少。
重组DNA技术：通过体外操作将不同来源的DNA重新组合以获得新功能分子的技术。
就是将不同生物的DNA连在一起。
基因治疗：将缺陷基因的野生型拷贝引入患者细胞内以治疗疾病的方法。
包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。
就是基因水平上的治疗，将正常基因导入细胞达到治疗的目的。
同源染色体：一条来自父本，一条来自母本，且形态、大小相同，在减数分裂前期相互配对的染色体。
上面有等位基因。
人有46条染色体，有23对同源染色体。
表现度：具相同基因型的个体间基因表达的变化程度。
表现型是由基因和环境共同决定的，基因相同的个体间表达程度可能不同。
癌基因：能诱导它所存在的细胞发生癌变的基因。
就是说的原癌基因，原癌基因负责调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程。
它过度表达会使细胞不受控制地分裂，从而变成癌细胞。
RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）：RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
定位克隆：分析遗传家系，获得与特定性状(疾病)紧密连锁的遗传标记，并定位于染色体特定区域，借此得到目的基因的方法。
就是将致病基因定位，然后提取出来以便研究。
基因簇：基因家族中来源相同、结构相似和功能相关的在染色体上彼此紧密连锁的一组基因。
某一祖先基因由于重复和变异产生的一系列基因称为一个基因家族，有的基因家族含有完全相同的成员，家族成员可以成簇存在或分布在不同的染色体中，基因簇少则是由重复产生的两个相邻相关的基因组成，多则几百个。
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26
DMD基因的克隆
• X染色体隐性遗传
– 多为男性患者 – 家系隔代传递
• 女性患者（X-常染色体平衡易位）
一项对若干女性DMD患者的细胞遗传学研究发现： 每个病例受累的常染色体不同， 但在X染色体上的断裂点总是Xp21。
27
X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果
如果发生易位的X失活， 所以所有存活细胞 中失活的都是完整 则相当于有一条常染 色体也失活——致死。 的X染色体。
6
遗传标记
• 可用于鉴别细胞、个体或物种的一段DNA 序列，其在染色体上的位置为已知。 • 在群体中等位基因频率大体相当，可以被 普遍检出的变异(variation)。 • 包括：
– 碱基的变化（RFLP, SNP） – 一段序列重复数（STR, VNTR, CNV）
7
遗传标记——STR
3 2 1
疾病
性状 （疾病）
功能
蛋白质产 物（生物 学功能）
染色体定 位
列
16
功能克隆
• 绝大部分分子病、遗传代谢病（生化代谢 酶缺陷）都是采取的这一策略。
– 白化病（albinism） – 苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU） – 镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease） – ……
聚丙烯酰胺凝胶电泳区分STR标记的等位片段
1： (CA)19 2： (CA)25 3： (CA)278源自遗传标记——SNP9
基因定位的层次
• 确定某个（某一系列）表型相关的基因所 在染色体上的位置
– 染色体 – 染色体区带 – 遗传图 – 物理图
10
基因定位的发展
1911
•Wilson, 红绿色盲基因定位于X染色体上 •人类基因定位的先河 •Donahue, Duffy血型基因定位于1 号染色体上 •首次在常染色体上进行的基因定位 • 体细胞杂交、重组DNA、分子杂交和PCR等技术 • 基因定位的速度、数量明显加快
25
进行性肌营养不良症(DMD/BMD)
• 抗肌萎缩蛋白(dystrophin)遗传性缺陷所致的进行性 肌萎缩的致死性神经肌肉性遗传病
–发病率为1/3500 –XR遗传。
• 主要症状:
• 3---5岁发病 • 走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难 • Gower征阳性 • 进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大 • 10多岁下肢瘫 • 一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.
1968
1970~1990s
2000~
• 人类基因组计划的实施和完成 • 基因组水平 • 芯片技术、第二代测序技术的商用 • 全基因组水平
11
2005~
基因定位路线图
疾病 定位 功能
基因
12
基因克隆与定位技术路线
疾病 定位 功能 定位 基因 疾病 功能
基因
功能克隆
定位克隆
13
功能克隆和定位克隆的比较:
疾病
遗传标记， 染色体定位
•
•
基因 序列
基因
mRNA cDNA 蛋白质产物 生物学功能
23
功能
定位克隆
• 功能克隆——基因表达产物
• 定位克隆——染色体/基因组特征与表型的 关联性
染色体/基因组特征 染色体畸变
遗传标记——统计学分析
24
利用染色体畸变进行定位克隆
最早利用定位克隆方法鉴定的基因主要 是借助于特定基因座的染色体畸变，DMD基 因的克隆是一个重要的例子。
17
功能克隆的技术路线
蛋白质 mRNA/cDNA 基因组/染色体
1. 进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序 列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA 或 基因组中筛选对应的编码基因。
蛋白质抗体表达筛选2. 将异常蛋白质制成相应的DNA序 列分析确定导致疾病的分子缺陷。
18
功能克隆举例
• β珠蛋白基因的克隆
• 凝血因子VIII基因的克隆
19
β珠蛋白基因的克隆
• mRNA
• cDNA
已知
放射性标记
• 基因组
Southern 印记 原位杂交
20
凝血因子VIII基因的克隆
• • • • mRNA 部分蛋白序列 寡核苷酸探针 人基因组未知 已知 推测 拼接 筛选
3、复等位基因（multiple alleles）：在一个群体 中，一个特定的基因座上，可以有很多等位形式， 如 a1 、a2 、a3… an ，但对于每个人来说， 最多只能具有其中的两个。
5
基本概念
4、基因型（genotype）:是一个个体的遗传组成。一 般指一个特定的基因座上的等位基因。 5、表型（phenotype）：基因型和环境因素相互作 用所表达的、能够显示出的遗传性状。
① 通过女性患者X-常染色体易位，克 隆了该基因的一部分。 ② 使用有Xp21.1微小缺失的男孩的DNA， 利用消减技术，获得了这个男孩X染色体中 缺乏的DNA片段。
30
• 类似的策略：
– 粘多糖贮积症IVA型——GALNS基因
• AR，散发病例 • 一例新生突变患者，染色体缺失
31
遗传标记与连锁分析
放射性标记
Shouthern 印记 原位杂交
21
• mRNA • cDNA • 基因组
定位克隆
22
定位克隆
疾病
• 旧称为“逆向遗传学”，始 于20世纪80年代后期 利用遗传连锁或细胞遗传学 定位技术将致病基因定位于 染色体的特定区带。 定位：通过连锁分析找出与 目的基因紧密连锁的遗传标 记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段 内分离克隆所要的基因，并 进一步研究其功能。 •
在传统的功能克隆中,基因功能的研究 先于基因鉴定和定位。
在定位克隆中,基因定位在先,随后再 鉴定基因。基因已鉴定后,可以进行基 因功能的选择性研究。
14
功能克隆
15
功能克隆
• 从异常表型入手， 找出造成表型的基 因表达产物，比如 与代谢缺陷相关的 失活或缺失的酶， 异常的结构蛋白质 分子或mRNA等， 通过各种方法确定 基因，最后将相应 的基因定位。
1931, from Ger. allel, abbrev. of allelomorph (1902), coined from Gk. allel- "one another" (from allos "other;" see alias) + morphe "form" (see Morpheus)
(pl. loci), 1715, "locality," from L. locus "place," from tin stlocus, lit. "where something is placed,"
2、等位基因（allele）:位于一对同源染色体的相同 基因座上的DNA片段互称等位基因。
28
DMD基因的克隆
• X染色体隐性遗传
– 多为男性患者 – 家系隔代传递
• 女性患者（X-常染色体平衡易位） • 新生突变
一个无任何遗传缺陷家族史的男孩，患有DMD等4种X 连锁隐性遗传病。 细胞遗传学分析显示Xp21.1微缺失。
29
DMD基因的克隆
• 两个研究小组分别采用两种不同的方 法克隆了DMD基因：
• 更多的疾病未涉及到染色体变异
• 遗传标记与连锁分析
32
致病基因的定位与克隆
Nov.14, 2012 北京协和医学院 王铮
1
两个问题
• 什么是基因? • 基因在哪里?
2
基因和染色体
• 基因 ——国家
• 染色体——大陆
3
基因定位
• 确定基因在染色体/基因组上的真实位置。
• 目的：构建临床表型——基因突变的桥梁
个体化治疗
4
复习：基本概念
1、基因座（locus）: 指一条染色体上的特定位置。