高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
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用于评价色谱峰的对 称性。为保证分离效 果和测量精度,应检查 待测峰的拖尾因子是 否符合各品种项下的 规定。
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积来自百度文库V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
高效液相色谱法基本 知识培训-化验员入门
培训
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
重复性
用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重 复性能。采用外标法时,通常取各品种项下 的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外, 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时,通常配制相当于80%、 100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内 标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少 进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏 差应不大于2.0%。
溶质的色谱保留行为主要是由该溶质 在固定相和流动相中的平衡分配系数K所决 定的,而K是溶质在两相间达到平衡分配时 性质上的度量。其定义为,溶质在两相间达 到平衡时在固定相和流动相中的浓度比。
K= 溶质在固定相中的浓度(ms/Vs) = ms ・Vm 溶质在流动相中的浓度(mm/Vm) mm Vs
式中,ms、mm分别为溶质在固定相和流 动相中的质量。
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出
所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。
不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减
调整保留时间和调整保留体积
扣除死时间或死体积的保留值,定义为调整保 留时间(t’R)和调整保留体积来自百度文库V’R),如下式所示。
t’R =tR-tM V’R =VR-VM 保留值是色谱过程热力学的重要参数。当色谱 操作条件一定时,不同物质的有其特定的保留值。 这是色谱定性分析的基本依据。在液相色谱中,由 于流动相参与了溶质分配过程,因此,样品组分的保 留值不仅与固定相的性质有关,而且受流动相性质 变化的影响很大。因此研究液相色谱中流动相组成 对保留值的影响,是分离条件最佳化的基础。
高效液相色谱法基本 知识培训-化验员入门
培训
第一节 高效液相色谱 的定义及基本参数
定义
高效液相色谱法系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱， 对供试品进行分离测定的色谱方法。注入 的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组 分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器， 由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
基本参数
（一）保留值 保留值是用来描述样品组分在色谱柱
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
2.分离度（R）
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离
物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能 的关键指标。可以通过测定待测物质与已 知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分 与某一添加的指标性成分(内标物质或其他 难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品 用适当的方法降解,通过测定待测组分与某 一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价 与控制。
少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快
速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
拖尾因子T
容量因子(k’)
容量因子是色谱法中广泛采用的保留值参数, 它是样品组分的质量在两相中分配的比值,定义为
k’=固定相中溶质的质量(ms) = k・Vs
流动相中溶质的质量(mm)
Vm
VR=Vm+k’(Vm/Vs)·Vs= Vm+k’Vms = Vms·(1+k’)
式两边除以冲洗剂流速Fc则得
tR = tM(1+k’)
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为: