毛细管电泳及其应用

毛细管电泳及其应用

摘要：毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis, CE)，是近二十年来发展最为迅速的新型液相分离分析技术之一。CE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是继高效液相色谱之后的又一重大进展，具有分离效率高、简单、经济、快速和微量、自动化程度高等优点。毛细管电泳这些特点使其成为一种极为有效的分离技术，目前已是生命科学及其它学科中一种常用的分析手段，已广泛应用于蛋白质、氨基酸、无机离子、有机化合物等的分离分析。关键词：毛细管电泳，分离效率高，生命科学

引言

毛细管电泳是在传统电泳技术的基础上逐步发展起来的。电泳技术的出现可以追溯到100多年前[1]。1807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。起初电泳只是作为一种物理化学现象来研究。电泳真正意义上进入分析化学被视为一种重要意义的技术，是在瑞士化学家Tiselius[2]公布了移动界面电泳技术的细节之后。他首先将电泳现象成功的应用于人血清的分离，获得了多种血清蛋白，他制成第一台电泳仪，并进行自由溶液电泳。Tisedius对电泳技术的发展和应用所做的巨大贡献，使他获得了1948年诺贝尔化学奖。但是传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。1967年Hjerten[3]最先使用慢速旋转的内径为3 mm的石英玻璃管进行自由溶波电泳，以UV进行检测，成功地分离了蛋白质、多肽、无机离子、有机离子等，Hjerten最早证明可以把高电场用于细内径的毛细管电泳，但他没有完全克服传统电泳的弊端。1974年Virtanen提出使用细毛细管提高分离效率，阐明电渗流就像泵一样可以驱动液体流过毛细管，并说明了使用更细内径的毛细管做毛细管电泳的特点。1979年Everaerts和Mikkers[4]使用内径为200μm聚四氟乙烯毛细管，提高了毛细管的分离效率，成功分离了16种有机酸。1981年Jorgenson和Luckas[5]发表了划时代的研究工作，采用内径为75μm 石英毛细管进行实验，采用高电场电迁移进样，以灵敏的荧光检测器进行检测，使丹酞化氨基酸高效、快速分离，首次获得理论塔板数高达4x105/m的柱效。Jorgenson和Lucas等人的开创性工作，使CE发生了根本性的变革，标志着CE从此跨入高效毛细管电泳时代。

1983年Hjerten[6]将毛细管的内壁填充聚丙烯酰胺凝胶并将其用于毛细管电泳分离，发展了毛细管凝胶电泳(CGE)。CGE具有极高的分辨本领。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，可用于蛋白质碎片的分离及DNA序列的快速分析。

1984年Terabe等[7]将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支—胶束电动毛细管色谱(MECC)。他首次将表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)加入缓冲液中，在溶液中形成离子胶束作假固定相，实现了中性离子的分离，目前，MEKC己成为应用非常广泛的电泳模式之一。1985年Hjerten[8]等把平板等电聚焦电泳过程转移到毛细管内进行，发展了等电聚焦毛细管电泳(CIEF)。他是将带有两性基团的样品、载体两性电解质、缓冲剂和辅助添加剂的混合物注入毛细管内[9]，当在毛细管两端加上直流电压时，载体两性电解质可以在管内形成一定范围的pH梯度，从而达到使复杂样品中各组分分离的目的。1987年，Karger等[10]对凝胶填充技术进行了改进，优化了CGE技术,极大提高了其分离效率并阐明了用小内径毛细管可进行毛细管凝胶电泳。同年Smith等[11]将毛细管通过电喷射接口与质谱相连，从而实现了质谱和毛细管电泳联用的检测法，毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术以其高效及高准确性被广泛应用于很多领域。

毛细管电泳根据分离机理和介质不同，具有多种分离模式，每种模式的选择性不同。毛细管电泳现有以下六种经典分离模式：毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)，CZE是毛细管电泳中应用最广泛的一种分离模式，CZE用以分析带电溶质，其分离机理是基

于各被测物质的净电荷与质量之间比值的差异，粒子以不同的速度在分立的区带内进行迁移而被分离。CZE的特点是操作简单、快速、应用范围广，从理论上讲适用于分离所有具有不同淌度的荷电粒子，其广泛应用于蛋白质、氨基酸、多肽、对映体拆分和其它带电物质的分析。

胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC)，MECC是指在缓冲液中添加表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，SDS)，当添加剂浓度超过临界胶束浓度后，就形成了胶束。被分离物质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配，并随电渗流在毛细管内迀移，达到分离。MECC是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离技术，既能用于分离中性物质又能分离带电组分，主要用于分析手性对映体和药物小分子等。常用的表面活性剂有各种阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子和两性表面活性剂、混合胶束(如阴离子表面活性剂和胆酸盐组合混合胶束)。

毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis, CGE)，CGE是80年代后期发展起来的毛细管电泳的主要分离模式之一，它的原理是把单体装入到毛细管中引发聚合形成凝胶作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性结构，能够起到类似分子筛的作用，当带电溶质在电场作用下通过凝胶的多孔性结构时，将会因溶质分子大小不同而产生不同的阻力，溶质按分子大小逐一分离。CGE将毛细管电泳的快速和微量分析与凝胶电泳对生物大分子的高效分离能力相结合，发展为当今分离度极高的一种电泳分离技术。尤其对那些荷质比不随分子大小而变的大分子如DNA、蛋白质，CE其他分离模式很难对其分离，采用凝胶的筛分作用就能获得良好分离。而且凝胶能减小溶质的扩散，所得峰型尖锐，能达到CE中的最高柱效。CGE在DNA、RNA片段分离和排序、原蛋白和结合蛋白的分离及PCR产物分析中有着十分广阔的应用。聚丙烯酸胺作为最常用的单体在毛细管内交联生成凝胶，但其使用寿命短、制备比较烦琐。

毛细管等电聚焦(Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)，CIEF为毛细管里进行的等电聚焦电泳过程。它是结合了传统等电聚焦和毛细管电泳高效、快速、微量等优点，根据溶质的等电点(pi)不同而进行分离的技术。其基本原理是将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将分析样品和两性电解质溶液混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，加高电压后，在毛细管内壁建立pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点时呈电中性，不再移动，产生非常窄的聚焦带，并使不同等电点的溶质聚焦在不同位置上而相互分离。聚焦后，改变检测器末端电极槽储液的pH值或用压力使溶质通过检测器。CIEF有非常高的分辨率，可以分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质。CIEF己经成功用于测定蛋白质等电点，蛋白质、多肽的分离分析，异构体分离等方面。

毛细管等速电泳(Capillary Iso-TachoPhoresis, CITP)，CITP的基本原理是将两种滴度差别很大的缓冲体系分别作为先导电解质和后继电解质，带不同电荷的被分析组分按其电泳淌度不同迁移至各个狭窄的区带，得以分离。这种分离模式主要用于离子型物质的分离。CITP具有界面明显、富集、浓缩的特点,所以现在常用作柱前浓缩方法用以富集样品，以解决CE测定中灵敏度不高的问题。

毛细管电色谱(Capillary Electro Chromatography, CEC)，CEC是一种比较新颖的分离分析方法。它是将高效液相色谱(HPLC)的细粒径固定相微粒填充到毛细管中，或在毛细管内壁涂布固定相，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流(或电渗流结合高压输液泵)为流动相驱动力的色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的优势，因为采用柱塞流来推动流动相，克服了高效液相色谱中用压力驱动流体，流速不均匀引起的峰扩展，因而使毛细管电色谱的理论塔板数远远高于高效液相色谱，能达到接近于HPCE的高理论塔板数，虽然其柱效相对HPCE有所下降，但是由于引入了高效液相色谱的固定相，使毛细管电色谱具备了固定相所具有的高选择性，使它不仅能分离带电物质，也能分离中性化合物。

CE的装置比较简单,由高压直流电源、进样系统、分离毛细管和检测器构成，前三个部