HPLC_ELD法联用测纯度

高效液相色谱分离-蒸发光散射

检测法测定海藻糖的纯度

魏　泱,丁明玉*

(清华大学化学系,北京100084)

摘　要:用反相高效液相色谱法分离-蒸发光散射检测法测定了海藻糖的纯度,检测下限为5mg /L 。在30～1000m g /L 范围内,海藻糖浓度的对数与ELSD 测得的峰面积对数具有良好的线性关系。

关键词:高效液相色谱法;蒸发光散射检测法;海藻糖

中图分类号:O 657.7 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(2001)01-0005-03

海藻糖(trehalo se )是一种二糖,由两个葡萄糖分子通过T -T

-(1→1)糖苷键链接而成。它是一种非还原性糖,在酵母中含量很高。可以在干燥的环境中起到保护酶、疫苗等活性物质的作用,目前在化妆品、医药等方面得到了愈来愈广泛的应用。中国科学院微生物研究所利用生物合成,从酵母中提取出高纯度的海藻糖。

传统定性分析海藻糖的方法主要是纸层析和薄层层析法。纸层析法也可作为定量分析海藻糖的方法,但其定量的准确度和重现性都无法与高效液相色谱法(HPLC)相比。HPLC 法通常用糖分析柱[1]

、氨基键合柱[2～4]

或C18柱[5,6]

作固定相,以乙腈和水的混合溶剂或纯水为流动相来分析糖。糖本身在紫外区无吸收,通常使用示差折光检测器(RID)

[1,6]

,或者通过衍生化

[2,5]

后再进行检测。RID

灵敏度较低,衍生化法操作繁琐,且不可避免地会引入误差。蒸发光散射检测器(ELSD )作为一种新型的通用型检测器,目前正得到越来越广泛的应用。ELSD 利用了流动相与被测物之间的蒸汽压相对差异,柱洗脱液进入雾化器针管,在针的末端,洗脱液和充入的气体(通常为氮气)混合形成均匀的微小液滴;漂移管的作用在于使流动相挥发,蒸汽压较小的被测物颗粒经过漂移管进入光散射池;在光散射池中,被测物颗粒散射光源发出的光,经检测器检测散射光,产生电信号。ELSD 在检测类

酯[7]、表面活性剂[8]

等物质中发挥着较大的作用,

同样可以直接对糖[3,4]进行检测,且具有较高的灵敏度。本研究力图通过实验,建立起一种快速、准确、直接测定海藻糖纯度的HPLC /ELSD 法。1　实验与方法1.1　仪器与试剂

HP1100高效液相色谱仪(美国Hew lett Packard 公司):配有四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD )和化学工作站。另配有Alltech 500ELSD (美国Alltech 公司)。

海藻糖,纯度98.5%(Sigm a 公司);海藻糖样品(中国科学院微生物研究所合成);甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯。水为二次重蒸去离子水。流动相使用前用0.45μm 滤膜过滤。1.2　色谱条件

色谱柱:Zo rbax SB-C18(4.6mm ID ×25cm ,5μm ),Hew lett Packard 公司产品,流动相:甲醇—水(4∶1,V /V ),流速:0.8m L /min;柱温:25℃;进样量:20μL;ELSD 参数:漂移管温度为75℃,氮气流速为 1.75L /min 。1.3　标准溶液的配制

称取101.5mg 海藻糖标样(98.5%)溶于100m L 甲醇中配制成储备液(对应海藻糖浓度为1000mg /L )。使用前以甲醇稀释成适当浓度的工作溶液。

收稿日期:2000-03-02;修订日期:2000-05-19作者简介:魏　泱(1975-),男,硕士研究生

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5—第20卷第1期2001年1月分析试验室Chinese Jour na l o f Analysis Labo rato ry V ol.20.No.12001-1

DOI:10.13595/https://www.360docs.net/doc/2b12497884.html, k i .i ssn 1000-0720.2001.0002

2　结果与讨论2.1　分离条件的选择

由于海藻糖样品系生物合成,纯度很高。在实验中,不断改变流动相中甲醇和水的比例,主要目

的在于使海藻糖在合适的时间内被洗脱。当甲醇-水的比例为4∶1时,海藻糖在3min 左右出峰。见图1

。

图1　ELSD 检测海藻糖标样(a )和样品(b )的色谱图

Fig .1　C hromatograms of standard (a )and sample (b )detected by ELSD

2.2　ELSD 条件优化

根据流动相的种类和比例,首先设漂移管温度

为70℃,氮气气速为 2.0L /min 。保持气速不变,改变漂移管温度,观察信号基线水平和噪音,75℃时流动相基本挥发,噪音不是太大。固定漂移管温度为75℃,观察不同氮气流速时海藻糖的信号强度,1.75L /min 为在较小噪音水平上,产生最大检测响应值的最低气速。故选定漂移管温度为75℃,氮气气速为 1.75L /min 。2.3　线性关系考察

将海藻糖贮备液稀释配成30,50,100,300,500mg /L 的系列浓度,依次进样20μL,根据ELSD 测得的峰面积对相应的标准溶液浓度进行线性回归,发现线性很差。以海藻糖浓度的对数对ELSD 测得的峰面积的对数进行线性回归,两者间存在着良好的线性关系,结果见表1与图2。将最小浓度的标准溶液再逐级稀释,依次进样20μL,计算当信噪比为3时对应的标准溶液浓度以确定检出下限,得到的海藻糖检测下限为5mg /L 。2.4　海藻糖样品的测定

对同一份样品,重复进样5次,用ELSD 测定其峰面积,取5次测定平均值计算样品中海藻糖含

表1　EL SD 检测海藻糖线性关系考察

Tab .1

　Investigat ion on linear relation between concentra -tion of trehalose and peak area detected by ELSD

海藻糖浓度(×10-4%)

峰面积浓度的对数值峰面积的对数值306116.0 1.477 3.7865013854.6 1.699 4.14210042876.0 2.000 4.632300194692.6 2.477 5.289500353674.5 2.699 5.5491000

864179.3

3.000

937

图2　海藻糖浓度的对数与峰面积的对数线性关系图Fig .2　Linear relation between logarithm of concentration

and logarithm of pea k area

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6—

量。在样品溶液中加入已知量的海藻糖标准溶液,测定其回收率,结果见表2。

表2　海藻糖纯度的测定结果

Tab.2　Purity determination results of trehalose by ELSD 纯度(%)回收率(%)R SD(%)

99.2199.420.93

2.5　讨论

使用反相高效液相色谱法分离糖时,可以采用纯水做流动相。利用ELSD的操作使全部柱流出物都进入直的漂移管,让流动相在其中蒸发,为了有利于蒸发必须使用较高的操作温度。如果采用纯水做流动相,相应地,ELSD就必须采用较高的漂移管温度和较大的雾化器载气气速,使得ELSD检测的峰面积减小,降低了灵敏度。故本文采用沸点较低的甲醇为主作为流动相。

在使用当前的色谱条件时,当海藻糖浓度为30～1000mg/L范围内,其浓度与ELSD测得的峰面积线性关系很差,而将它们取对数后再进行拟合,则可得到良好的线性关系。采用同一台ELSD 在正相条件下,检测天麻甙(对羟甲基苯U-D-吡喃葡萄糖甙),天麻甙浓度在21.3～890mg/L范围内,其浓度与ELSD测得的峰面积线性关系很好,将它们取对数后再进行拟合,其线性关系不如前者(详情另报)。可见ELSD的响应值与被测物浓度的关系曲线比较复杂,这与许多文献的报道是一致的,其具体关系尚处于研究中。

RID是检测糖主要的检测器之一,但它对工作环境要求很苛刻,要求恒温,恒流速,且无法采用梯度洗脱,其检测灵敏度也不够高。ELSD的出现,在一定程度上弥补了HPLC传统检测器的不足,特别是对无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测,显示出其优越性。

采用高效液相色谱蒸发光散射检测验正海藻糖的纯度,方法可靠,灵敏度较高。ELSD检测过程中,无溶剂峰干扰,基线平稳。

参考文献

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Purity Examination of Trehalose by HPLC with ELSD W EI Yang and DI N G Ming-yu(De-pa rtm ent o f Chemistry,Tsinghua Univ ersity, Beijing100084),Fenxi Shiyanshi,2001,20(1):5～7

Abstract:A rev ersed-phase high performance ch romatog ra phy with evaporativ e light-scattering detecto r(ELSD)using m ethano l-wa ter(4∶1, v/v)as m obile phase was established fo r direct purity exa mination o f trehalo se.An ODS colum n Zo rbax C18w as em ploy ed.Reg ressio n equations rev eal linea r relationship betw een log arithm of trehalo se concentra tion and lo garithm of trehalose peak area detected by ELSD in th e range of30～1000mg/L trehalose.Recoveriy o f trehalose m ea-sured by ELSD is99.42%w ith detection limit of 5mg/L.

Keywords:H ig h perfo rmance liquid chrom atog ra-phy;Ev apo ra tiv e light-scattering detector;Purity examination;Trehalose

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