基因组测序基本原理
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鸟枪法测序步骤
• 第一,建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组 文库。克隆数要达到一定数量,即经末端测序的克隆片段 的碱基总数应达到基因组5倍以上。
• 第二,高效、大规模的末端测序。 • 第三,序列集合。 • 第四,填补缺口。
鸟枪法测序简要
鸟枪法测序技术
DNA target sample
基因组测序
生物信息系列讲座之二
大纲
I. 核酸DNA的发现以及测序历史简介 II. 双脱氧化(Sanger dideoxy method)测序 III.大片段的DNA测序与基因组测序的大发展 VI.人类基因组 V. 1000美元个体化基因组测序计划(The “$1,000 dollar
genome)
Sanger 双脱氧测序原理
3’
Single stranded DNA 5’
5’
3’
a) 常规的PCR,粘附(Anneal)
Sanger 双脱氧测序原理
5’
b) 在延伸的时候将
DNA聚合酶与加入
正常的dNTP,同时
掺入少量的双脱氧
的ddNTP
3’
DNA聚合酶 延伸方向
Sanger 双脱氧测序原理
• 荧光标记
– 化学合成时带有荧光素标记的ddNTPs被掺入到反应中。 – 每一种ddNTP都带有自身特定的荧光波长以便于观测
测序结果分析
目前一般采用凝胶电泳法分析-能够比较好的将每 一条dNTP产生的DNA条带分离开。
DNA测序胶: 老方法
在反应中加入不同的ddNTP得到结果
利用电泳或者放射自显影的 方法来分析DNA序列
3’
T TT
T
5’
5’
3’
ddA
以ddATP为例,可以 看到在反应中带有T的
ddA
模板被掺入的互补的
ddATP随机停止。因
ddA
为ddATP不能够再使
ddA 其主链延伸。
如何读取这些DNA片段?
• 同位素标记
– 同位素标记的引物 (如 32P) – 同位素标记的dNTPs (如35S 或者 32P)
C. 焦磷酸测序(Pyrosequencing): measuring chain extension by pyrophosphate monitoring。焦磷酸测序 技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳, DNA片段也无须荧光标记,操作极为简便,可以快速、准 确地确定DNA序列。
带有同位素标记的引物或者ddNTP被掺入到反应 中,以便于观测
自动测序仪
输出
DNA测序的实例样本
• 一个带有28个DNA样品的胶图: 绿带:碱基A,, 蓝带 C, 黄带G,红带 T.
• 越小的片段跑得越快
自动测序仪
测序的趋势
相对而言一般很少实验室会自己做测序,一则自身测序费用比较高,而且荧光试剂容 易粹灭,同时也比较消耗时间,另外可能出现一些其它问题引起结果不成功。所以大 部分的测序都是送到相关的测序中心或者公司完成: --下面这个序列就是一个自动测序仪记录的一段DNA片段
SHEAR
End Reads (Mates)
Primer
550bp
SEQUENCE
SIZE SELECT
e.g., 10Kbp ± 8% std.dev.
LIGATE & ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱLONE
Vector
重叠群Contigs
▪ 重叠群是指一组相互重叠的染色体DNA序列 ▪ 如何建立重叠群基因克隆? ▪ For sequencing one wants to create “minimum tiling path”
▪ YACs (yeast artificial chromosomes) – 插入大小: 200–1,000 kb
大片段插入载体
▪ Lambda 噬菌体 以及 cosmids
– 插入稳定 – 但插入片段的容量可能不足以做大规模的
测序
▪ YACs
– 能够插入大片段 – 但不太稳定,比较难实际操作
BACs and PACs
Part II. 大片段DNA测序与基因组测序的大发展
19
蜜蜂基因组是如何获得的?
基因组文库的建立
• 目前基将基因组片段打碎建立文库。基因组文库含有某种 生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。
酵母人工染色体(YACs) 200-1000 kb Bacteriophage P1 90 kb
On WebCT -- “The $1000 genome” -- review of new sequencing techniques by George Church
Part I.核酸测序原理
核酸发现与测序简史
DNA测序的简史
MC chapter 12
DNA测序的方法
A. 双脱氧法 (Sanger dideoxy) (primer extension/chaintermination) method: 最流行也是最广为接受的方法。
▪ BACs and PACs
– 大规模测序通用质粒 – 对插入片段大小比较合适,而且容易使用 – 与其它正常质粒一样能够扩增和分离
全基因组鸟枪法测序
• 但是片段比较大时,如在基因组测序时,仅仅由Sanger方 法并不合适,因此Shotgun测序,将基因大片段打碎后测 序。鸟枪法战略(Shotgun Strategy)又称随机测序战略, 是由美国塞莱拉遗传公司创始人克雷格•文特尔发明,主 要针对大片段的全长测序。因为整个基因组太长而每次只 能测得一个500的小片断(read)。
Cosmids 40 kb
Bacteriophage l 9-23 kb
质粒(2-6 kb)
大片段载体
▪ Lambda phage – 插入大小: 20–30 kb
▪ Cosmids – 插入大小: 35–45 kb
▪ BACs and PACs (bacterial and P1 artificial chromosomes (Viral) respectively) – 插入大小: 100–300 kb
B. Maxam-Gilbert化学剪切法(chemical cleavage method): DNA is labelled and then chemically cleaved in a sequence-dependent manner. This method is not easily scaled and is rather tedious