无内毒素质粒大量提取试剂盒使用说明
质粒提取试剂盒说明书
质粒抽提：质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
实验原理：提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。
详细内容请参考《分子克隆实验指南》。
另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。
碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。
将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL 以上。
煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。
加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA 变性。
但是。
闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。
当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。
QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。
选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。
2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。
5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。
如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
快速型无内毒素质粒超大量 3 提取试剂盒手册说明书
EZgene TM EndoFree plasmid ezFlow ezFilter Megaprep3kit(BG0060) HandbookFor research use only.Not intended for diagnostic testing.ContentsContents (1)Introduction (2)Important Notes (2)Storage and Stability (3)BeforeStarting (4)Safety Information (4)Kit Contents (5)EZgene TM Plasmid ezFilterMegaprep3Protocol (6)Purification of Low-Copy-Number Plasmid and Cosmid (8)快速型无内毒素质粒超大量3提取试剂盒简明步骤 (9)Trouble ShootingGuide (12)IntroductionKey to the kit is our proprietary DNA binding systems that allow the high efficient binding of DNA to our ezBind TM matrix while proteins and other contaminates are removed under certain optimal conditions.Nucleic acids are easily eluted with sterile water or elution buffer.Unlike other procedures,our patented plasmid purification kit has no guanidine salt in the buffer,the purified DNA is guanidine/ion exchange resin residues free which enable the high performance of downstream applications such as transfection, restriction mapping,library screening,sequencing,as well as gene therapy and genetic vaccinations.Important Notesumbers::The yield of plasmid DNA depends on the origin of the Plasmid Copy N umbersreplication and the size of the plasmid.The protocols are optimized for high copy number plasmid purification.For low copy number plasmids,both the culture volume and the buffer volume need to be scaled up2times.Reference Table1for the commonly used plasmids,Host Strains:The strains used for propagating plasmid have significant influence on yield.Host strains such as Top10and DH5a yield high-quality plasmid DNA. endA+strains such as JM101,JM110,HB101,TG1and their derivatives,normally have low plasmid yield due to either endogenous endonucleases or high carbohydrates released during lysis.We recommend transform plasmid to an endA-strain if the yield is not satisfactory.Please reference Table2for the endA information.Table2endA strains of E.Coli .Optimal Cell Mass (OD 600x mL of Culture):This procedure is designed for isolating plasmid grown in standard LB medium (Luria Bertani)for 12-16hours to a density of OD 6002.0to 3.0.If rich medium such as TB or 2xYT are used,make sure the cell density doesn’t exceed 3.0(OD 600).A high ratio of biomass over lysis buffers result in low DNA yield and purity.Culture Volume Volume::Use a flask or tube with a volume at 4times the culture medium to secure optimal condition for bacteria growth.Don’t exceed the maximum culture volume suggested in the protocol.Incomplete lysis due to over amount of bacterial culture results in lower yield and less purity.Table 3The optimal cell mass mass,,culture Volumeand Binding Capacity for the mega DNA units,S torage and StabilityBuffer A1should be stored at 4°C once RNase A is added and Buffer ER should be stored at 4°C.All other materials can be stored at room temperature (22-25o C).The Guaranteed shelf life is 12months from the date of purchase.Before StartingPrepare all components and get all necessary materials ready by examining this instruction booklet and become familiar with each steps.Important:I.RNase A:It is stable for more than half a year when stored at roomtemperature.Spin down RNaseA vial briefly.Add the RNaseA solution to Buffer A1and mix well before use.II.Buffer ER should be stored at4°C.III.Buffer B1precipitates below room temperature.It is critical to warm up the buffer at50°C to dissolve the precipitates before use. IV.Buffer N3may form precipitates below10°C,warm up at37°C to dissolve the precipitates before use.V.Keep the cap tightly closed for Buffer B1after use.VI.Make sure the availability of centrifuge and vacuum manifold, especially,after mixing the lysate with ethanol,the sample needs to be processed immediately by vacuum.Materials supplied by users:VII.100%ethanol.VIII.Pump-driven vacuum system,1,000mL bottle(Corning#430518 or430282)or equivalent pyrex glass bottles.IX.50mL conical tubes.X.High speed centrifuge tube for endotoxin removal if desired. Safety Information�Buffer N3contains acetic acid,use gloves and protective eyewear when handling.�Buffer N3,Buffer RET contains chaotropic salts,which may form reactive compounds when combines with bleach.Do not add bleach or acidic solutions directly to the preparation waste.Kit Contents*Add216mL(BG0059)or320mL(BG0060)96-100%ethanol to each DNA Wash Buffer bottle before use.EZgene TM Plasmid ezFilter ezFilterMegaprep Megaprep 3Protocol I.Inoculate 600600mLmL LB containing appropriate antibiotic with 500µL fresh starter culture.Grow at 37°C for 14-16h with vigorous shaking.Note :The best way to prepare a starter culture:Inoculate a single colony from a freshly grown selective plate into 1mL LB medium containing the appropriate antibiotic and grow at 37°C for 6-8h with vigorous shaking (~250rpm).The buffer volumes need to be scaled up if processing over 500mL of culture.II.Harvest 600mL overnight bacterial cells by centrifugation at 5,000x g for 10minutes at room temperature.Decant or aspirate medium and discard.Note :Remove the residual medium completely for optimal cell lysis and neutralization.III.Resuspend the bacterial pellet in 30mL Buffer A1(Add RNase A to BufferA1before use).Pipet or vortex till thebacterial pellet dispersed thoroughly(Complete resuspension is critical for optimal yields).Then add 1.5mL Bu Bufferffer ER into the suspended bacterial culture.Mix well by inverting 5-10times.Note :if room temperature is below 25°C,warm up the mix solution after adding Buffer ER at 45°C for 5min.IV.Add 27mL Buffer B1.Mix gently but thoroughly by inverting 10times and incubate atroom temperature for 5minutestoobtain a cleared lysate.Do not incubate longer than 5minutes.Then add 3mL Buffer D1,mix gently and incubating for another 5minutes.Over-incubating causes genomic DNA contamination and plasmid damage .Avoid vigorous mixing as this will shear the genomic DNA.V.Add 8mL Buffer N3and mix immediately by inverting 5times till a flocculentwhite precipitate forms.Vortex the lysate for 5seconds.Note:It is critical to mix the lysate well,if the mixture still appears conglobated,brownish or viscous,more mix is required to completely neutralize the solution.VI.Attach the 2-layer filter unit to a sterile 500mL or 1000mL standard bottle(Corning#430518or 430282or equivalent pyrex glass bottle)and screw tight.Connect the unit to a pump-driven vacuum system.VII.Transfer the clear lysate from the bottom of the mixture (use a 50mL serological pipet)to the filter unit.Stand by for 5minutes and turn on the vacuum with low vacuum force and increase to maximum vacuum force after 5minutes.Figure1.Instruction of filter assembling.Note11:If the flow through gets too slow,turn off the vacuum and wait for1minute.NoteCarefully detach the upper filter cup and replace it with the replacement cup.Assemble the unit as Figure1.Pour the lysate from the original cup to the replacement cup.Turn on the vacuum and filter the rest of the lysateN ote2:Low vacuum force prevents clogging of the filter membranes.Note3:Use a50mL serological pipet to transfer the relatively clear lysate from the bottom of the lysate bottle to the filter unit.This will speed up the flow rate of the filter unit.Normally around200mL lysate can be filtered through the filter unit within20-30 minutes.Pour the remaining white precipitates to the filter unit when most of the lysate has been filtered through.VIII.When most of the lysate has been filtered through the unit,turn off the vacuum,wait for1minute,detach the unit and discard the upper filter cup including the rubber rings.Note:The DNA is in the collection bottle.IX.Connect the DNA unit to a500mL or1,000mL standard bottle and screw tight.Connect the DNA unit to the vacuum with the vacuum off.Add1volume of Buffer RET(For example,60m L of Buffer RET to60m L of clear lysate), and add36mL100%ethanol to the lysate bottle.Mix well by sharp hand shaking3-5times and immediately pour half of the lysate/ethanol mixture to the DNA unit and turn on the vacuum.X.Pour the rest of the lysate/ethanol mixture into the DNA unit.When all the lysate pass through the DNA unit,vacuum for1minute.XI.Wash the DNA membrane with50mL DNA Washing Buffer and vacuum for 1minute at maximum force.Wash the DNA membrane with another50 mL DNA Washing Buffer and vacuum for1minute at maximum force. XII.Add50mL100%ethanol evenly to the DNA membrane and vacuum for1minute.Turn off the vacuum,wait for1minute,and discard the liquid waste in the bottle.Reconnect the bottle to the DNA binding unit.Turn on the vacuum for10minutes at maximum force(It is critical to dry the residual ethanol for optimal yield).Turn off the vacuum,incubate at65o C for10min will help to remove the ethonal and increase the elution efficiencyXIII.Wait for1minute,and replace the500mL or1,000mL standard bottle with a sterile50mL conical tube,screw tight.XIV.Add8mL Endofree Elution Buffer evenly to the membrane and incubate for5minutes.Turn on vacuum to elute DNA.Typically3~5mL of solution can be collected.This is the1st elution.XV.Turn off the vacuum and replace the50mL conical tube with another sterile 50mL conical tube,screw tight.Add3mL Endofree Elution Buffer and incubate for3minute.Turn on the vacuum and collect the2nd elution,typically mL of solution can be collected.1~21~2mLNote:The DNA is ready for downstream applications such as transfection of endotoxin-sensitive cell lines,primary cultured cells or microinjection.Note:Two elutions give rise to maximum DNA yield.For maximum yield and higher concentration,pool the elutions together,add0.1volume3M Potassium Acetate or Sodium acetate(pH5.2)and0.7volume isopropanol.Centrifuge at top speed for10 min.Discard supernatant.Wash the DNA with1000µL70%ethanol,centrifuge for5 min,carefully decant.Air-dry the pellet for10-20minutes in a tissue culture hood.Resuspend the DNA in Endofree Elution Buffer.Note:Use lessEndofree Elution Buffer if high concentration is desired.g/mL L)=OD260nm x50x dilution factor.DNA concentration(µg/mPurification of Low-Copy-Number Plasmid and CosmidThe yield of low copy number plasmid is normally around0.1–1µg/mL of overnight culture.For isolating low copy number or medium copy number plasmid DNA,use the following guideline:•Culture volume:Use2x volume of the high copy number cultureBuffer B1,Buffer D1and Buffer N3•Use2x volume of the Buffer A1,Buffer ER,ER,Bufferand100%ethanol.Additional buffers can be purchased from Abgent.•use same volume of DNA Wash Buffer and Endofree Elution BuffeBuffer.r.快速型无内毒素质粒超大量3提取试剂盒简明步骤（详细内容请参考说明书英文部分）�实验前准备RNase A:常温下可稳定贮藏半年，使用前将提供的所有RNase A瞬时离心后加入Buffer A1,使用后将Buffer A1/RNase A置于4o C保存。
无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南
详细内容：. ® (无内毒素质粒大抽提). 在升地培养瓶中加入培养基,然后加入菌种于℃摇床培养小时；文档收集自网络，仅用于个人学习:为获得最好地结果，请接种培养过夜地菌种（）.并强烈推荐使用()品系用于常规地质粒提取，如和.注意：菌液地培养时间不能超过小时；文档收集自网络，仅用于个人学习. 收集培养基至适当地离心管，室温下，×离心分钟沉淀；. 吸尽并去除培养基，用干净地吸水纸吸尽壁上多余地液体.加到细菌培养物中，涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞；文档收集自网络，仅用于个人学习注：充分重悬细菌沉淀物对获得高产量地质粒是相当关键地.充分重悬后溶液是均匀地，不存在小块物质；请尽量吸弃残余地培养基以防止稀释加入地溶液；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入，轻轻颠倒旋转混匀次至获得澄清地裂解液；室温放置分钟可以有是必须地.避免剧烈振荡混匀而打断染色体，降低质粒地纯度.（使用后请盖紧盖子且于室温保存）；文档收集自网络，仅用于个人学习. 将取出活塞，将其放置于架子上；. 加入，轻轻颠倒混匀几次至出现絮状沉淀.这可能需要放置分钟并间断颠倒混匀；文档收集自网络，仅用于个人学习. 立即将裂解液转移到中，垂直放置分钟.这时白色地絮状沉淀物会漂上溶液地上层，裂解液可能开始流出过滤器，用新地管子收集细菌裂解液，并将活塞轻轻插入过滤器中；文档收集自网络，仅用于个人学习. 握住过滤器，轻轻推动活塞将裂解液打到收集管中；注意不要将任何杂质打到收集管中；. 加入体积地（蓝色）到收集液中，轻轻颠倒旋转混匀次，冰浴放置分钟；注意：加入后，溶液应变得浑浊，但冰浴静置后溶液应是澄清地.文档收集自网络，仅用于个人学习. ℃孵育分钟，溶液重新变为浑浊.室温下，×离心分钟，（蓝色）分层于离心管底部.文档收集自网络，仅用于个人学习. 把上面地水相（上清液）转移到新地离心管中，加入体积地，轻轻颠倒旋转混匀次.注意：转移上清液时不要吸到任何溶液，因为其含有高浓度地内毒素；文档收集自网络，仅用于个人学习. 平衡柱子：用套在收集管中，加入至柱子中，室温下×离心分钟；去除滤过液并重复使用收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入澄清地裂解液至柱子中，×离心分钟.去除滤过液并重新收集管；. 将剩余地裂解液加到柱子上，按上述条件离心，去除滤过液并重新使用收集管；. 加入至柱子中，×离心分钟，去除滤过液并重新使用收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入(已用乙醇稀释)至柱子中，×离心分钟，去除滤过液并重新使用收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入至柱子中，×离心分钟，去除滤过液和收集管；文档收集自网络，仅用于个人学习. 将柱子套在新地离心管中，加入或水至柱子地基质.室温下×离心洗脱.文档收集自网络，仅用于个人学习. ® ( )文档收集自网络，仅用于个人学习. 按步骤准备澄清地裂解液；. 平衡柱子：将同真空装置相连接，加入至柱子中，提供真空分钟至裂解液完全滤过膜；文档收集自网络，仅用于个人学习. 将澄清地裂解液至柱子中，提供真空让所有地溶液滤出柱子；加入至柱子，提供真空吸尽液体；文档收集自网络，仅用于个人学习. 加入（已经用无水乙醇稀释）至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；文档收集自网络，仅用于个人学习. 重用至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；溶液滤出柱子后，将柱子转移至收集管中，另外提供真空分钟，室温下，×离心分钟以洗脱.第二次洗脱可能是需要地；文档收集自网络，仅用于个人学习. 去除柱子，然后将产物保存于℃.。
PH1706 无内毒素质粒中提试剂盒实验操作方法
保存：RNase -20℃保存,其余组分常温保存。自购买日起 18 个月内有效。 浓缩的 DNA Wash Buffer 需用无水乙醇按如下稀释： 50assay 加入 52 ml ；100assay 加入 104 ml 无水乙醇
注意事项
1. 第一次使用前把试剂盒提供的 RNase A 全部加到 Solution I 中，混匀，并在瓶上做好标记。加入 RNase A 后 4℃存放。 2. 温度较低时，Solution II I 可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37℃水浴加热溶解，混匀后使用。 Solution II 请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。 3. Solution II 使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。 4. 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
PH1706 | 无内毒素质粒中提试剂盒
EndoFree Plasmid Midi Kit
Catalog No：PH1706 Size： 50T | 100T Store at RT
简介
Endo-free Plasmid Mini Kit 采用了一种新型的独特的内毒素吸附缓冲液(Buffer ER)，能有效去除质粒中的内毒素污染，可大 大提高转染实验效率和动物注射效果。无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀。每个纯化柱可用于抽提 1-5 毫升用 LB 培养过夜的 大肠杆菌。抽提所得质粒的 OD 值一般在 1.80 左右。所得质粒量会受质粒拷贝数等因素影响，所得的质粒可直接用于转细 胞，DNA 测序，PCR，基于 PCR 的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化。
试剂组分
Component 纯化柱子 收集管 Solution I Solution II Buffer NT Buffer ER Buffer WB DNA Wash Buffer RNase A Elution Buffer 说明书 50 Assay 50 50 15mL 15mL 12mL 6mL 30mL 13mL 50ul 15mL 1 100 Assay 100 100 28mL 28mL 20mL 10mL 55mL 26mL 100ul 20mL 1
无内毒素质粒 DNA 大量提取试剂盒
5 12,000 rpm 室温离心 12min，收集上清。 6 将上清置于 DNA 纯化柱中，静置 5 min。
●
如果收集的上清液过多，超过 DNA 纯化柱容积（15 ml），可 将上清分次加入 DNA 纯化柱中。
7 12,000 rpm 离心 2min，弃滤液。
●
此时质粒 DNA 被吸附于 DNA 纯化柱中的硅胶膜上。
溶液 W 初次使用前用无水乙醇按 1: 1.5 稀释，即含 60% 乙醇。 ● 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液 PB 中含碱和变性剂，请不要直接 接触皮肤。 ● 上述产品组分均可单独购买，详见产品索引。
质量控制 从大肠杆菌提取 pGEM 质粒 DNA。提取的质粒DNA 质 量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。 保存条件 RNase A：可室温保存 1 年以上。RNase A 为浑浊溶液。初 次使用本试剂盒时，请将 RNase A 全部加入到溶液Ⅰ中，均 匀混合后于 4℃保存。可保存 6 个月。 其他试剂：室温保存。 若溶液Ⅱ出现沉淀，请于 37℃保温溶解。待恢复至室温后使 用。沉淀的出现不会影响质粒 DNA 的纯化结果。 注意事项-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------● ● ● ●
● ● ●
若溶液Ⅱ出现沉淀，请于 37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现 不可剧烈混和，否则会使染色体 DNA 断裂。 此步骤不宜超过 5 min。
不会影响质粒 DNA 的纯化结果。
ZYMORESEARCH质粒提取试剂盒说明书
ZYMORESEARCH质粒提取试剂盒说明书预期用途
本试剂盒可用于提取咽拭子样本中人上皮细胞、细菌和真菌的DNA。
本试剂盒提供的裂解液能快速有效裂解细胞，裂解产物能够直接用于PCR 扩增，并且灵敏度高，特异性强，省去了繁琐的核酸提取与纯化步骤，实现快速PCR检测。
对于病原微生物检测，流行病学调查、菌群调查及其它一些以口腔微生物为样本的核酸检测都非常适用。
操作步骤
1、待检拭子样本直接置于200IFatlyeL1中，充分搅拌洗脱拭子上的样本，在管壁挤压数次后弃拭子；
2、吹打混匀，95℃孵育5min；
3、孵育后的样本12，000rpm离心2，3min，上清可直接用于PCR扩增，上清如不立即使用，需置于-20℃长期保存。
推荐使用咽拭子DNA快速提取扩增试剂盒（荧光PCR法），货号MKNJGNSWDLAQP008。
注意：
离心后的上清加入PCR反应体系的量不宜超过总体积的5%。
如偏好较小体积的反应体系，可将裂解产物稀释5倍或10倍后用作模板；
样本要求
用专用采样拭子，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将拭子放采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
以上标本可立即用于测试，也可放置在-20℃条件下长期保存。
注意事项
2、如样本中扩增反应抑制物较多时，可将裂解后的上清稀释5倍作为模板，进行PCR扩增。
3、实验完毕用1%的次氯酸钠或75%酒精处理工作台和移液器。
超速无内毒素质粒大量高效提取试剂盒
产品说明书◆超速无内毒素质粒大量提取试剂盒◆目录号1217◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外超速无内毒素质粒大量提取试剂盒试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次（121701）20次（121702）溶液P1 室温50ml 100ml溶液P2 室温50 ml 100 ml溶液N3 室温50 ml 100 ml溶液WB 室温15 ml 30 ml沉淀液A 室温18 ml 35 ml沉淀液B 室温 1.1 ml 2.5 ml内毒素清除剂-20℃ 1.5ml 1.5 ml本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
储存事项：1.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒在改良碱裂解法基础上，采用本公司独家研发的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。
纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
同时内毒素含量极低，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。
纯化后期过程均在Eppendorf管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提。
本产品是目前市面上最简捷快速的无内毒素质粒大提产品，属于公司独家产品。
- 1 -操作步骤：1.取过夜培养菌<140 ml菌液，装入合适的离心瓶中，12,000 x g离心3 min沉淀菌体，完全弃除上清。
2.加入5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。
细菌悬液移入50 ml离心管中。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3.加入5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置5 min，使细菌完全裂解，溶液透明。
无内毒素质粒大量快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://EndoFree Plasmid Maxi Kit无内毒素质粒大量快速提取试剂盒目录号：PL13试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次(PL1301)RNaseA（10mg/ml）-20℃750µl溶液P1 4℃77 ml溶液P2 室温77 ml溶液N3 室温77 ml内毒素清除剂-20℃25 ml漂洗液WB 室温25 ml X 2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温20 ml吸附柱DC 室温10个收集管（50ml）室温10个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
内毒素清除剂常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。
储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml）置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速，方便，从150-300ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90 %。
无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南
无内毒素质粒大提取试剂盒中文操作指南（omega）详细内容：E.Z.N.A. ® Fastfiler Endo-free Plasmid MaxiprepProtocol(无内毒素质粒大抽提)1. 在1-4升的培养瓶中加入200-500ml LB培养基,然后加入菌种于37℃摇床培养12-16小时；Tip:为获得最好的结果，请接种1ml培养过夜的菌种（12-16hr）。
并强烈推荐使用E.coli(endA-)品系用于常规的质粒提取，如DH5a和JM109。
注意：菌液的培养时间不能超过16小时；2. 收集200ml培养基至适当的离心管，室温下，3,500-5,000×g离心10分钟沉淀；3. 吸尽并去除培养基，用干净的吸水纸吸尽壁上多余的液体。
加12.0ml Solution I/RNase A到细菌培养物中，涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞；注：充分重悬细菌沉淀物对获得高产量的质粒是相当关键的。
充分重悬后溶液是均匀的，不存在小块物质；请尽量吸弃残余的培养基以防止稀释加入的溶液；4. 加入12.0ml SolutionII，轻轻颠倒旋转混匀7-10次至获得澄清的裂解液；室温放置3-5分钟可以有是必须的。
避免剧烈振荡混匀而打断染色体DNA，降低质粒的纯度。
（Solution II使用后请盖紧盖子且于室温保存）；5. 将取出Lysate Clearance Filter Syrine活塞，将其放置于架子上；6. 加入12 ml Neutralization Buffer，轻轻颠倒混匀几次至出现絮状沉淀。
这可能需要放置2-3分钟并间断颠倒混匀；7. 立即将裂解液转移到lysate Clearance Filter Syrine中，垂直放置5分钟。
这时白色的絮状沉淀物会漂上溶液的上层，裂解液可能开始流出过滤器，用新的50ml管子收集细菌裂解液，并将活塞轻轻插入过滤器中；8. 握住过滤器，轻轻推动活塞将裂解液打到收集管中；注意不要将任何杂质打到收集管中；9. 加入0.1体积的ETR Solution（蓝色）到收集液中，轻轻颠倒旋转混匀7-10次，冰浴放置20分钟；注意：加入ERT Solution后，溶液应变得浑浊，但冰浴静置后溶液应是澄清的。
无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书
无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书货号：D1150规格：10T保存：常温干燥保存，复检期为一年。
试剂盒内容：试剂盒组成D1150-10TRNase A1ml内毒素清除剂100ml溶液P140ml溶液P240ml溶液P340ml结合液120ml漂洗液2×15ml洗脱液30ml吸附柱10个收集管20个说明书1份注意：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。
溶液P1在使用前先加入RNaseA （将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
产品说明：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。
本试剂盒内的内毒素清除剂，可最大限度地除去内毒素。
从50-100ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA，提取率达85-90%。
使用本试剂盒提取的质第1页共3页粒DNA纯度高，可直接用于细胞转染等要求较高的实验，以及其他各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
操作步骤:1、取50-100ml细菌培养物，11000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入4ml溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入4ml溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入4ml溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作步骤
AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作步骤AxyPrep Maxi Plasmid Kit (AXYGEN) AxyPrep质粒大量提取试剂盒操作说明实验准备:, 检查Buffer S1中是否已加入RNaseA。
, 检查Buffer W2中是否已加入无水乙醇。
, 检查Buffer S2是否出现沉淀，如有沉淀，在37?水浴中溶解沉淀，再平衡至室温。
,注意,Buffer S2不用时请立即盖紧，防止被空气中的CO中和。
, 2, 将Buffer S1，Buffer S3K和Buffer B放置4?预冷。
, 将洗脱液Eluent放置65?水浴中预热。
实验步骤:1. 将待提取的质粒对应菌液在5mL含有对应抗性的LB培养液中扩增培养过夜。
2. 次日，将5mL培养后的菌液接种至200mL含有对应抗性的LB培养液中扩增培养过夜。
3. 将菌液分装至5个50mL离心管中，每管40mL，4? 3000×g离心5min，彻底弃净上清。
4. 加入Buffer S1(已加RNaseA，4?预冷)，每管4mL，共20mL，涡旋充分重悬菌体。
5. 加入Buffer S2，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀，室温作用5min。
6. 加入Buffer S3K(4?预冷)，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀，室温作用5min。
7. 加入Buffer B(4?预冷)，每管4mL，共20mL，温和晃动混匀。
8. 4?10000×g离心10min，小心取上清至新管，最终合并为2管。
9. (可选步骤)再次4? 10000×g离心10min，小心取上清至新管。
10. 将上步收集的上清全部加入Maxiprep syringe filter中，将注射器芯从上方推入，下方用纯化柱(Maxiprep column)盛接滤液。
11. 推注注射器芯，将液体滤至纯化柱中，同时在纯化柱下方连接输液器(预先剪除输液针)，并用10mL注射器负压反复抽吸，直至液体滤尽。
质粒大提操作
质粒大提操作手册（Qiagen试剂盒，无内毒素装）操作流程图准备工作检查试剂盒。
联系高速离心机。
准备50 ml（或更大）圆底离心管，灭菌备用。
准备试管架，实验前操作台上紫外线照射备用。
无菌离心管若干。
移液器与无菌吸头若干。
试剂准备：P3缓冲液4℃预冷异丙醇无水乙醇实验前取冰备用。
细菌培养：不要超过所推荐的最大，最好使用LB培养基，培养12-16小时，使每毫升细胞数达到3-4×109。
操作过程使用前准备工作QIAGEN-tips使用中需要保持直立。
LyseBlue的使用：LyseBlue和P1缓冲液以1：1000（10μl：10 ml）混合形成悬液，配制时要用力振荡充分混匀，加入P2后可形成蓝色溶液，加入P3后溶液变为无色。
将RNase A全部加入到P1缓冲液，使其浓度达到100 μg/ml。
将40 ml 96-100%乙醇加入到无内毒素水中，配制成70%无内毒素乙醇。
操作过程1、从平板上挑一个克隆到2~5 ml的抗性培养基中（一般是100 μg/ml的Amp），37 °C，300 rpm振荡培养8 hr。
2、如果是高拷贝质粒，取100 μl培养菌液加到100 ml抗性培养基中。
如果是低拷贝质粒，则取250 μl培养菌液到250 ml抗性培养基中，37 °C，300 rpm振荡培养12~16 hr。
3、6000 g，4°C离心15 min收获菌体细胞。
所得细胞可保存于-20℃备用。
4、加入10 ml的buffer P1（使用前可加入10 μl LyseBlue充分混匀）悬浮菌体细胞，充分混匀，可涡悬振荡，或者用吸头吹吸均匀。
5、加入10 ml的buffer P2，盖上离心管盖，上下用力翻转4~6次，以充分混匀溶液。
室温下放置5 min。
请勿涡旋振荡，裂解反应请勿超过5 min。
准备QIAfilter Cartridge：将盖子放置于QIAfilter Maxi Cartridge流出口上。
质粒提取试剂盒说明书
1使用前，在试剂盒中加入一小管核糖核酸酶到溶液一中。
保存在4°C2向dnawas缓冲液浓缩液中添加60 ml 100%乙醇，并在室温下储存除此之外，还需要一台容量为13000×G的离心机无核酸酶离心管无菌去离子水或te缓冲液纯乙醇操作步骤：（萃取过程在室温下进行）1在10-20ml试管中，将携带所需质粒的大肠杆菌接种于5mllb培养基lb（含50μg/ml 氨苄西林）中，37℃≤0.2培养12-16h，需要注意的是，常规的质粒提取使用的是Enda 阴性的大肠杆菌，如DH5α和JM109。
2取1.5～5ml常温菌液10000×g，离心1分钟，除去上清液。
三。
加入250.0.8l溶液I（含RNase A），用旋涡振荡器摇匀，直至细胞完全悬浮。
（用移液管再消耗）4加入250.0.8l溶液II，轻轻转动离心管4-6次，得到澄清的热解溶液。
最好在室温下孵育2分钟。
剧烈的混合会切断染色体DNA，降低质粒的纯度。
（储存溶液II时应拧紧盖子）5加入350.0.8l溶液III，轻轻倒置并混合几次，直到出现白色絮状沉淀6在室温下以13000×g离心10分钟后，会形成白色沉淀并迅速进入下一步7小心处理上清液，并用2ml离心管转移到干净的吸收柱中。
确保没有沉淀物和细胞碎片被吸入。
在10000×g室温下离心1分钟，直至裂解液完全通过吸收柱8取纯化后的蛋白质，在离心条件下，取剩余蛋白1.500×1.0，进行离心分离。
如果下一步不需要高纯度质粒，如酶消化等筛选方法，这一步可以省略9滤液弃去，用100%乙醇稀释的750.0.8l洗涤缓冲液冲洗吸收柱，在10000×g离心1分钟，滤液丢弃。
注意：浓缩前必须用纯乙醇稀释洗涤液。
参见标签中的方法如果结冰，使用前必须恢复到室温10此步骤可选：加入750.0.8l洗涤缓冲液清洗吸收柱1113000×g吸收柱必须离心2分钟，以确保去除乙醇。
质粒提取试剂盒说明书
质粒提取试剂盒说明书质粒是能够自主复制的小型环状DNA分子，多存在于细菌及酵母菌等生物中，是基因工程中最常用的运载体，担负着将目的基因转移到宿主细胞中的重要使命。
基因表达载体的构建（也就是目的基因与运载体结合）是基因工程的核心步骤，用作运载体的质粒更是掌上明珠。
我们需要从细菌中分离出质粒以备后用。
如果分离不好的嘛......提取出的目的基因就只能眼巴巴地望着彼岸的受体细胞吹凉风。
知道厉害了吧如何提取质粒呢？视频献上，头脑风暴一下热身之后，看一看质粒提取的具体操作。
分离质粒的方法有很多，但都离不开三个主要步骤。
摇菌培养即培养细菌使质粒扩增1.将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板（一种培养基，使质粒扩增）。
2.置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3.灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。
4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5. 37℃，180rpm，振荡培养过夜。
现在，一团团质粒丰富细菌准备就绪任人宰割啦。
分割线收获细菌并裂解21.离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。
2.用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。
3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。
4.加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。
5.加入250ulLB溶液。
立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。
6.加入250ulNB溶液。
立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。
7.室温，1500rpm，高速离心15min。
8、将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。
质粒大量抽提试剂盒说明书
宁波保税区西区创业大道7号2C-1,315800, 电话：+86-574-86822306 传真：+86-574-26893101, sales@质粒大量抽提试剂盒使用说明书质粒大量抽提试剂盒使用说明书（（离心法离心法））产品编号 产品名称包装 DNAP002质粒大量抽提试剂盒（离心法）6×包装清单包装清单：：Solution Ⅰ（溶液Ⅰ） 60ml Solution Ⅱ（溶液Ⅱ） 60ml Solution Ⅲ（溶液 Ⅲ） 84ml Wash Solution （冲洗液） 21ml Elution Buffer （洗脱液）9ml Affinity Column （质粒纯化柱）6个 Collection Tube （废液收集管） 6个 Instrution （说明书）1份操作步骤操作步骤：：1. 取40ml 过夜培养菌液，放于Collection Tube 中，11,000－13,000rpm 离心2分钟，离心速度低时应适当延长离心时间。
2. 弃上清，再加入40ml 菌液，重复步骤1。
弃上清，离心1分钟，用吸头吸干多余液体。
3. 加10 ml 含RNase A 的Solution Ⅰ，用吸头冲打沉淀或用振荡器使菌体充分混悬。
4. 加10 ml Solution Ⅱ，上下翻转混合6－10次，使菌体充分裂解，形成清亮溶液。
5. 加14 ml Solution Ⅲ，上下翻转混合6－10次，于4℃静置10分钟，应见大量白色沉淀生成。
6. 于4℃，11,000rpm 离心30分钟。
离心期间，将Affinity Column 放在Collection Tube 中。
7. 将上清倒入准备好的Affinity Column 中，11,000 rpm 离心2分钟。
也可将过柱液重新倒回AffinityColumn 中，11,000 rpm 离心2分钟，以增加回收率。
8. 弃过柱液，加8.4ml Wash Solution 于Affinity Column 中，11,000 rpm 离心2分钟。
无内毒素质粒大提Protocol
无内毒素质粒大提Protocol无内毒素质粒大提Protocol——孙书洪一．实验前预备1.将一管RNase A加入至Buffer P1中，混匀，至终浓度为100 μg/ml；2.将40ml无水乙醇加入至Kit提供的endotoxin-free water中，配制成70%无内毒素的乙醇；3.检查Buffer P2中有无SDS的沉淀，如果可见沉淀，可将Buffer P2于37℃加热使沉淀溶解；4.将Buffer P3 冷却至4°C；5.将LyseBlue reagent加入至Buffer P1中，混匀，稀释比为1:1000（如：加10 μl LyseBlue 至10 ml Buffer P1），每瓶Buffer P1中加1管LyseBlue reagent；二．实验步骤1.菌种活化：取50μL保藏的菌液，加入至5ml具氨苄抗性的LB 培养基中（试管），37℃，300 rpm培养8h；2.取400μL活化的菌液加入至装有200ml氨苄抗性LB培养基中，37℃，300 rpm过夜（12-16h）；3.菌液分装至50ml离心管中（50ml/管，共4管），4℃，6000g 离心15min。
（此步可以暂停，将菌体于-20℃保存即可）；4.每管加入2.5ml P1 Buffer重悬菌液，votex或用枪头上下吹到充分混匀，合并至一管；5.加入10ml的P2 Buffer（立刻盖上盖子，以免被空气中的CO2酸化），上下颠倒4-6次混匀（不能votex，以免造成基因组DNA断裂混入质粒中），室温放置5min（不能超过5min），如果P1 Buffer中加入了LyseBlue regent，当加入P2 Buffer后细胞悬液将变成蓝色，蓝色均匀分布表明已经充分混匀；6.QIAfilter Cartridge的预备：将Cap拧至QIAfilter Cartridge 的出口处，并将QIAfilter Cartridge放置于一离心管上；7.在细胞裂解液中加入10ml预冷的Buffer P3，迅速上下颠倒4-6次，充分混匀至蓝色消失，注意不要在冰上放置，应迅速进行下一步；8.将裂解液转入QIAfilter Cartridge中，室温放置10min。
QIAGEN-质粒提取操作
QIAGEN-质粒提取操作质粒提取操作步骤——QIAGEN(德国凯杰)质粒提取试剂盒一、细菌培养物的生长1. 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到2-5mL含有适当抗生素的LB液体培养基中生长。
将液体培养基置于37℃，300rpm的摇床中振荡8小时。
2. 用LB培养基以1/500~1/1000的比例稀释含菌落的培养基。
若为了获得高拷贝质粒，用100-200ul含菌落液体培养基接种到100ml LB培养基中；若为了获得低拷贝质粒，用250~500ul含菌落培养基接种到250ml LB培养基中。
让其在37℃，300rpm的摇床中振荡12-16小时。
二、细菌的收获和裂解1. 在6000×g，4℃条件下离心15min，收获细菌。
2. 加入10ml Buffer P1重悬细菌。
3. 添加10ml Buffer P2，剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
4. 加入10ml冰浴的Buffer P3到此溶菌产物中，晃动离心管4-6次使其混匀。
5. 将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
6. 打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 添加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
三、质粒DNA的纯化1. 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液慢慢滴下排空。
2. 将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
3. 用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。
4. 再用15ml Buffer QN洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液。
5. 加入10.5ml异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。
15000×g，4℃离心30min，离心后小心倒出上清液。
6. 洗DNA用5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中)，15000×g，4℃离心10min。
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无内毒素质粒大量提取试剂盒使用说明
货号：D1150
规格：10T
保存：常温干燥保存，复检期为一年。
试剂盒内容：
试剂盒组成D1150-10T
RNase A1ml
内毒素清除剂100ml
溶液P140ml
溶液P240ml
溶液P340ml
结合液120ml
漂洗液15×2ml
洗脱液30ml
吸附柱10个
收集管10个
说明书1份
产品说明：
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。
内毒素清除剂可最大限度地除去内毒
素。
从50-100ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA，提取率达85-90%。
使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可直接用于细胞转染等要求较高的实验，以及其他各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。
溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
操作步骤:
1、取50-100ml细菌培养物，11000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入4ml溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入4ml溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入4ml溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
11000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
注意：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5、加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。
6、37℃水浴5min,不时振荡，溶液又变浑浊。
11000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油相含内毒素。
7、将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油相，注意不要吸入油状相。
重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
8、加入12ml的结合液，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，11000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
如果溶液量多可分多次加入。
9、向吸附柱中加入8ml漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
10、向吸附柱中加入6ml漂洗液，11000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
11、11000rpm离心3min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。
12、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1-2ml经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心2min。
13、为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置5min，11000rpm离心2min。
注意事项:
1.使用前请先检查溶液P2、P3和结合液是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。
2.洗脱缓冲液体积不应少于1ml，体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率，DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
3.质粒DNA浓度＞1mg/ml时清除内毒素效率降低。
由于质粒DNA本身的性质，清除过程可导致部分质粒DNA丢失，但内毒素却能得到最大限度清除。
4.所有溶液应用无内毒素的高纯水配制，所有器械材料均应不含内毒素，玻璃器皿可高温烘烤，非挥发性水溶液可高压处理。
5.DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。
得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA 应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml 单链DNA。
OD260/OD280比值应为 1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。
相关试剂：
M1070D2000plus DNA Ladder
D10106×DNA Loading Buffer
T106050×TAE缓冲液
T10505×TBE缓冲液
G8142GoldView II型核酸染色剂(5000×)。