大鼠的骨髓间充质干细胞提取

大鼠的骨髓间充质干细胞提取

第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。

心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。

②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。

③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！

④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。

第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。

⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。

⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。

心得体会：

①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。

②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。

③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。

④以上的细胞生长液5ml具体配制为

DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计)

低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml

胎牛血清（HYCLONE公司的，500ml一瓶，大约3600元）浓度为10%，5ml细胞生长液中大约需要0.5ml

L-VC(自己配) 浓度为50ug／ml，5ml细胞生长液中大约需要 25ul

青链霉素(HYCLONE公司的，100ml一瓶，大约190元) 浓度为10万U／ml，5ml细胞生长液中大约需要5ul

至于NaHCO3，一般是加的，浓度为7.5%，使细胞生长液的PH在7.0-7.2之间，但是我不加，因为在细胞生长中会大量产生含N的分泌物，最好先拿试纸测一下。

再者在5ml细胞生长液中L-VC和青链霉素太少，可以忽略不计，但只是在配小剂量的范围内，大剂量的话就要酌情改变。

第三步：细胞计数。①从装有5ml细胞悬液的无菌容器中吸取20ul细胞悬液滴到一个培养皿。②用0.2ml的枪头吸取170ul的生理盐水，滴到20ul细胞悬液上③抽取10ul的4%台盼蓝液滴到盐水和细胞悬液的混合液体中，用枪头在这三者的混合液中抽吸几次，充分搅匀。

④抽取混合液中17ul点到放有载玻片的一个计数池中，刚好填满。开始计数并算出细胞数数量及浓度。并按浓度分装到培养皿中。

心得体会：①计数的这个培养皿可以是污染的，只要看的干净就行。

②混合的液体为20+170+10=200ul。其中细胞悬液的浓度为10%，也就是说细胞悬液被稀释了10倍（也可以稀释至20倍，稀释的越多，更容易数清楚，但误差也随之增大）。③计数公式 : 细胞数×104／ml=（四个大方格细胞数÷4）×稀释倍数×104／ml 比如，你数了四个大方格中有拒染细胞400个，那么根据公式算出

（400÷4）×10×104／ml = 1×107／ml，现在有5ml的细胞悬液，也就是有1×107／ml ×5= 5×107 个细胞。当然这么多细胞，不全是我们需要的骨髓间充质干细胞，还有很多其他像红细胞之类的，所以这就要设计到以后的换液纯化了。

④按6-8×l06/ml的浓度接种，故 5×107 ÷ 6-8×l06/ml = 8.3 – 6.25 ml 。因为一般60mm 的培养皿承载最多5ml的液体，故将5ml的细胞悬液再加入3ml的细胞生长液稀释成

8ml的细胞悬液，各取4ml分装至两个60mm的培养皿。此刻每个培养皿的细胞浓度为：（5×107）÷8 =6.25×l06/ml,正好在要求的接种密度6-8×l06/ml范围内。

⑤将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。

第四步，48h后半量更换细胞生长液。以后每3 d全量更换新鲜培养液，待细胞铺满培养皿约80%时可进行传代，大约周期为7天。