环孢菌素A两种不同产生菌原生质体的制备和再生

环孢菌素A两种不同产生菌原生质体的制备

和再生

作者：林永勉郑孝贤郑卫程元荣

【摘要】以环孢菌素A两种不同产生菌——雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，开展了原生质体制备和再生条件的研究，并分别实现了两个不同种的菌株原生质体再生。

【关键词】环孢菌素A 雪白白僵菌茄病镰刀菌原生质体

Formation and regeneration of protoplasts from two

ABSTRACT Protocols for formation and regeneration protoplasts for two different fungus species, Beauveria nivea and Fusarium solani, were described. High yield of protoplasts was obtained by using a combined enzyme system containing lywallzyme and snailase. The effects of factors such as osmotic stabilizers, cultivation time, temperature, pH, incubation time on the formation and regeneration were studied.

KEY WORDS Cyclosporin A; Beauveria nivea; Fusarium solani;

Protoplast

环孢菌素A(cyclosporin A)是由11个氨基酸组成的环肽，已作为高效免疫抑制剂在人体器官移植上广泛应用［1］。1976年瑞士Sandoz公司首次报道了由半知菌属多孔木霉(Tolypocladium inflatum)［后更名为雪白白僵菌Beauvcria nivea)］和光泽柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)产生的环孢菌素A［2］。此后各国的科学家又陆续报道了由13种其他产生菌，如茄病镰刀菌(Fusarium solani)和侵菅新赤壳菌(Neocosmospora varinfecta)等产生环孢菌素A。福建省微生物研究所于1983年首次报道了从我国土壤中筛选到环孢菌素A的产生菌茄病镰刀菌411，在国内率先研制成功环孢菌素A［3，4］。根据Ains worth的真菌分类法，茄病镰刀菌和国际上常用的环孢菌素A产生菌雪白白僵菌分别属于丝孢纲(Hyphomycetes)的丝孢目(Hyphomycetales)和瘤座孢目(Tuberculariales)。这两种产生菌不但在形态、培养特征和生理特性上有所不同，而且在工业化生产工艺和结果各有不同的特点。茄病镰刀菌生产环孢菌素A具有发酵培养基成本低，发酵周期短(5d)的优点，但环孢菌素A效价和组分含量偏低；雪白白僵菌生产环孢菌素A具有环孢菌素A效价和组分含量较高的优点，但发酵培养基成本高，发酵周期长(10～15d)。Kim等［5］利用雪白白僵菌进行种内融合，所获得的依赖L Val和L Leu的融合株环孢菌素A效价高达8920 mg/L，但发酵所需的培养基价格昂贵，使用培养基中氨基酸含量高达36g/L，发酵周期长达10～13d。我们设

想将两种不同的环孢菌素A产生菌的菌种进行目间原生质体融合，试图筛选出集合两个不同菌种优点的融合子应用于生产，获得提高环孢菌素A生产能力和经济效益的新菌株。本文报道以雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，分别进行原生质体制备与再生条件的研究。

1 材料和方法

1.1 菌种

茄病镰刀菌S421502和雪白白僵菌X44150均由福建省微生物研究所提供。

1.2 培养基

PDA液体培养基称取20g去皮土豆，切成小块状，加适量水煮30min。用4层纱布过滤，弃去滤渣，于滤液中加入2g葡萄糖，定容到100ml。

PDA斜面琼脂培养基 100ml PDA液体培养基加琼脂2g进行制备。

PDA再生培养基 PDA液体培养基，酵母浸汁(膏状)0.3g，KCl 3.9g，琼脂2g，定容至100ml。