免疫荧光组化技术

5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运 动着。根据量子理论，运动着的电子可以
处于一系列不连续的能量状态中，电子遵
守一定的规则，要以从一个能级向另一能
级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定
能量的吸收或释放。
激发
当电子吸收能量跃迁到较高能级， 这个过程叫激发。
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热 滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 分光镜 U 激发滤光片 截止滤光片 用途 BA420 自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 DM400 BP330-385 BP360-370
有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT） 把光信号转变成电信号；②利用电荷耦合 器（CCD）把光信号转变成电信号。
(2)成像方式 ①载物台运动成像：以直径
很小的激光束照射样品，照射点发出的荧
光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动 到下一点，记录该点的荧光强度。该方法 无轴向像差，成像时间长；
②反射扫描成像方式，通过转动反射镜使
三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应 时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与
FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86
个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S H H FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖ H S H
2.荧光素的种类
(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量
390D，最大吸收光谱为490～495nm，最 大发射光谱为520～530nm。呈现明亮的 黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是 罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收 光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，
记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS 洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，
湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检
闭后必须在30min后才能再启动光源，一 天中应避免数次点燃光源。
(6)标本染色后应立即观察。
(7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”
为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光； “ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋ ＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法： 1.动物脏器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝
束和整形，变成一束直径较大的平行
光束，长通分色光镜使光束偏转90度，
经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品
中的荧光物质在激光的激发下发出沿
各个方向的荧光，
一部分荧光经过物镜，长通分色反射
镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦 点外，经过焦点处的针孔，由检测器 接收并转变成电信号。
3.光信号接收和成像方式
(1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常
V
BV
DM455 BP400-410
DM455 BP400-440 BP420-440
BA455
BA475
儿茶酚胺观察
芥子喹吖因；染色体 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸
B
DM500 BP450-480
BP470-490 BP420-480
BA源自文库15
异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察
吖啶橙：DNA，RNA 金胺结核杆菌
2.间接法
是直接的重要改进，先用标记
的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合， 随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结
合。
操作流程
(1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石 蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS
洗3×3min。
(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h， 或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
1.仪器构成
(1)计算机系统：控制着机械，光学、声
学系统及各种外围设备。 (2)激光照射系统：氩离子激光器和声光 调节器。
(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共
聚焦系统组成。
(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元 件组成。 (5)X－Y平台 (6)Z-轴步进马达
2.共聚焦成像原理
激光器发出的激光束经过光的扩
10min，无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，
75％乙醇各2min）。 3.PBS洗（磷酸盐缓冲液0.01mol/L pH7.4） 3×3min。
4.0.1%胰蛋白酶（100ml蒸馏水中加入
100mg胰蛋白酶，100mg氯化钙，用0.1N
NaoH调pH至7.6），37℃，消化30min。 5.0.01mol/L pH7.4 PBS洗3×3min。 6.兔抗人AFP1:50（用专用抗体稀释液稀释） 37℃，1h或室温4h，或4℃过夜。
发射
以辐身方式跃迁时，能量转化成相
应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单
重激发态。如果电子直接从单重激发态以
辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很
不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也 很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物
称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的 光能并发射荧光。
3.改良法
4.透析标记法
（二）四乙基罗达明标记抗体方法
（三）藻红蛋白标记抗体方法
四、荧光抗体的质量控制
主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。
1.特异性染色效价测定 2.非特异性染色测定 3.吸收试验 4.F/P比值的测定方法
五、免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标
(2)操作流程 抗体与荧光素比例为50-100:1 抗体的准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总 量的1/10。 荧光素的准备：用分析天平准确称取 0.01mgFITC/1mg抗体。 结合：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体 溶液中。
透析 过柱 Sephade×G50或 G25 保存 4℃ -40℃等量甘油分装保存。 2.Chadwick法
1、具备用于标记抗体的荧光素条件
(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化
学基团，结合后不易离解，而未结合的色 素及其降解产物易排除。
(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。 (3)标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。 (4)结合方法简便而快速，并且较稳定。
(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。 (6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。
IB G
DM505 PB460-490
BA515IF BA590 罗丹明 四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
BP470-490
DM570 BP510-550 BP530-550 BP480-550
IG
DM565 BP520-550
DM600 BP545-580
BA580IF
BA610IF 德克萨斯红：荧光抗体观察
(1)光源
光源的亮度应根据荧光素的类型
选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染 料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率
超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，
引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内
气压升至50～70标准大气压，此时达到最
高亮度，成为稳定工作状态。
(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部 分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像 和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片 性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的 前提和必要条件。
荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 甘油 蒸馏水 4.8g 12ml 12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心， 15min，最后加入1.4-diazobicydo[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度 2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于20℃中。 (5)镜油
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min，
PBS洗3×3min。
(4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min。 (5)封片，镜检。
六、荧光显微镜检查方法
1.荧光显微镜
荧光显微镜是免疫荧
光组织化学的基本工具。它是由超高压光
源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光
学系统和摄影系统等主要部件组成，是利 用一定波长的光激发标本发射荧光。
呈橙红色荧光。
(3)四乙基罗达明(RB200) 呈褐红色粉 末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可 长期保存。最大吸收光谱570nm，最大
发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧
光，分子量580，RB200不能直接和蛋白
质结合，要先经五氯化磷反应，转化成
硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。
(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯 (5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS） (6)得克萨斯红（Texas red） (7)藻红蛋白（PE） (8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）
激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下 照射点所发射的荧光，成像速度快。
4.参数的选择
基本参数：Confocal,pinhole,detector, PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, BR subval,Samples/pt等
5.性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描
速度快，扫描范围大，图像存取方便，可 进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。
6.应用
(1)组织光学切片
可对活的或固定的细
胞及组织进行无损伤的系列“ 光学切 片”，得到其各层面的信息-“ 显微CT”。 (2)三维图像重建
(3)细胞物理和生物化学测定
(4)荧光的定量、定位分析
2.标本制作要求
(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间
(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 (3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消 耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部 不能充分激分。
(4)封片剂
常用甘油，必须无自发荧光，
无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封 片剂。
八、激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser
scanning confocal microscope,LSCM) 是80年代发展起来的一项具有划时代意 义的高科技新产品。
实现了对细胞内部非侵入式光学断层 扫描成像，从而对被检物体样品从停留到 表面单层，静态平面的观察进行到立体， 断层扫描、动态全面的观察，在生命科学 研究中得到迅速应用。
3.使用荧光显微镜注意事项
(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行检查。 (3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源 时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，
超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集 中检查，以节省时间，保护光源。光源关
(5)Ca2+、pH及其他细胞内离子的实时定 量测定 (6)粘附细胞的分选
(7)激光细胞显微外科及光陷阱技术
(8)荧光光漂白恢复（FRAP）技术
(9)胞间通讯的研究 (10)细胞膜流动性测定 (11)光活化技术
实习1
免疫荧光组化----间接法
1.4 µ m石蜡切，58℃烤，18h。 2.常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各
第六讲 免疫荧光组化技术
主要内容
一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法
四、荧光抗体的质量鉴定
五、免疫荧光组化染色方法
六、荧光显微镜
七、非特异性荧光的消除方法 八、激光扫描共聚焦显微镜
思考题：
1.什么叫荧光？ 2.常用荧光素有哪些特征？ 3.标记荧光抗体有哪二种主要的制备 方法？
4.免疫荧光组化直接法、间接法的 原理和主要操作流程？