第3讲--用于核酸操作的工具酶

PstI
1, 2, 4, 7
PvuⅡ
2, 4
SalI
1, 2, 4, 7
ScaI
4 - 6, 8
SstⅡ
2, 4
XbaI
2, 4, 7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
辅助因子 ATP Mg2+ SAM
Mg2+
ATP Mg2+ SAM
识别序列 EcoB:TGAN8TGCT 旋转对称序列 EcoP1:AGACC
EcoK:AACN6GTGC
EcoP15:CAGCAG
切割位点 距识别序列1-5kb处 序列内或附近 距识别序列
识别随机性切割 特异性切割 下游24-26bp处
5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
E·coliDNA连接酶
X
2）T4-DNA连接酶
从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离，由 T4噬菌体DNA上的基因编码，分子量 6.8KD，需要ATP作为辅助因子提供能量。
T4 DNA连接酶 1、特点：只连接ds-DNA分子，要求3’羟基和5’-磷酸基。 2. 用途： A 、互补的粘性末端的连接 B 、平整末端的连节
第3讲 用于核酸操作的工具酶
一、限制性核酸内切酶 二、DNA连接酶 三、DNA聚合酶 四、外切核酸酶 五、核酸修饰酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonucleases）
1、限制性内切酶及其特点 识别双链DNA分子中的特定序列，并由此 切割DNA双链的核酸内切酶,简称限制酶。 限制酶识别序列长度：4-8bp。
酶切碰到的问题：
DNA 未能切下
⑴ 酶失活确诊：用λDNA同时酶切。 ⑵ 反应条件：盐、酶、温、Buf.、pH和离子强度。 ⑶ DNA不纯。重新纯化。 ⑷ 甲基化：换酶或菌株 ⑸ 其它修饰 ⑹ 不存在识别序列
DNA酶切不完全：
⑴ 酶活性下降 ⑵ 酶稀释不对 ⑶ DNA不纯 ⑷ 甲基化 ⑸ DNA粘在管壁上 ⑹ 反应条件：盐、酶、温、Buf.、pH和离子强度。
表2 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶
诱发星活性的条件a
识别序列
AvaI
1, 2, 4
BamHI
1 - 5, 8
G GATCN, G PuATCC
BstI
2, 4
BsuI
2, 4, 6
EcoRI
1, 2, 4 - 6
N AATTN
HaeⅢ
2, 4
HhaI
2, 4, 7
HindⅢ
6
HpaI
1, 2, 4
OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
３） 平齐末端
PvuII等产生的平头末端 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
表1 对甲基化敏感的限制性内切酶
限制酶
AvaⅡ BclⅠ ClaⅠ EcoRⅡ HphⅠ MboⅠ NruⅠ Sau96Ⅰ SauFⅠ StuⅠ TagⅠ XbaⅠ
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG
TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG GATCGA TCTAGATC
识别序列呈典型的“回文结构”
EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’
3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回纹结构的两个基本特点： A、能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两 对称互补配对； B、两条互补链的5’—3’的序列组成相同，即将 一条链旋转180度，则两条链重叠。
连接多个平头双链DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
T4-DNA连接酶
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
（3）基因突变分析 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）即限制性片段长度多 态性。
由于不同基因型中DNA限制性内切酶位点间 的碱基插入、缺失、重组或突变，在用限制性 内切酶消化时，得到的DNA片段的数目和大小 产生差异，电泳后经Southern Blot 分析后产生 限制性片段长度多态性。
影响连接反应的因素： 温度、离子浓度、 DNA末端性质 DNA片段的大小等
平末端的连接速度比粘性末端的低10100倍。
提高平头末端连接效率的方法包括：
• 加大连接酶用量（10倍大于粘性末NA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯
仿、乙 醇、EDTA、SDS、NaCl等 • 加大酶的用量，1µg DNA 用 10U 酶 • 加大反应总体积，以稀释抑制因素 • 延长反应时间 • 重新纯化 B、温度：不同的酶要求的温度不同
C、DNA样品的甲基化程度。 D、缓冲液性质：
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH 3‘ … C-G-A-G-T-C-P
P-C-T-G-G-A-G … 3’ OH-G-A-C-C-T-C … 5’
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
平末端在连接时效率比粘性末端低。
切割无特异性
甲基位点 识别序列中的A
识别序列中的A
II型酶的发现： H.O.Smith 和K.W.Wilox 于1970年首次
从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现
并分离到II型酶，至今已开发了2300多 种II型酶。
3、限制性内切酶的命名
由3部分构成：
属名
种名
菌株名
Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm dam dam
*下横线字母表示限制酶识别序列, 蓝色字母表示dam甲基 化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列
2、限制性核酸内切酶的类型
主要特性
I型
II 型
III 型
限制修饰
多功能
单功能
双功能
蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体
5、切割频率
A、 定义：切割频率是指限制性内切酶在某 DNA分子中预测的切点数。
B、计算：1/4n n表示限制性酶识别的碱基 数。
如：识别4个碱基的限制酶，其切割频率应 为每256（44）个碱基有一个识别序列和 切点。 5—1024（45）；6—4096（46）
6、限制酶的用途： 1） DNA重组 2） 限制酶（物理）图谱绘制 3） 突变分析（RFLP分析） 4）限制酶的部分酶切与完全酶切
1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，
完全水解 1µg pRB322 DNA所需的酶量。
酶切效果检测
星活性（Star Activity）：当酶解条件改变 时，酶切反应的专一性降低，导致同种 酶能识别多种序列的现象。 如：EcoRI 识别 5’GAATTC 3’ 在低盐（<50mM）或pH>8和甘油大 量存在（超过5% ）时，还可以识别 5’AAATTC 3’、5’GAGTTC 3’ BamHI也会产生星型活性。
1968年分离到I型限制酶。
大肠杆菌细胞中存在两种DNA甲基化酶： 即DNA腺嘌呤甲基化酶（Dam酶）：作 用：在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引 入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI、 EcoRI等，但BamHI、 BglII、Sau3AI不受 影响。
DNA胞嘧啶甲基化酶（Dcm酶）：在 5‘CCAGG 3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧 啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有 EcoRII等。
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同
时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切
0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥
5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G …3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
NAD+ E·coliDNA连接酶
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’
BamHI： 5‘…G G A T C C …3’ 3‘…C C T A G G …5’
BamHI： 5‘…G G A T C C …3’ 3‘…C C T A G G …5’
限制酶切后产生两个末端，末端结构是 ５’-Ｐ和３’-ＯＨ
（2）末端种类：粘性末端 平末端
平末端 粘性末端
粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接， 任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制 酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。 在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的 基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端， 然后再将二者连接成重组DNA分子。