中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理

中国药科大学药物代谢动力学实验考查知

识点整理

药物代谢动力学实验考查知识点整理

第一部分：HPLC使用注意事项

1、HPLC组成：泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统/积分仪

2、反相色谱：

分离机理：“反相色谱”固定相极性小于流动相极性常用流动相：乙腈、甲醇，水 3、色谱柱的分类：

按填料：球形、无定形按含碳量：C18、C8

按应用：分析柱、制备柱、预处理柱按粒径：150mm*,5μm等按填料类型：正相柱、反相柱、手性柱 4、键合相色谱柱的优缺点：

优点：稳定不易流失；

应用广泛，可使用多种溶剂；消除硅羟基的不良影响；

缺点：pH得在3~8范围内

5、C18柱的活化：90% 10% 90%的甲醇溶液1ml/min依次冲洗30min

6、流动相：

使用之前需超声脱气目的：色谱泵输液准确提高检测性能

保护色谱柱

流动相脱气的方法：加热，抽真空，超声，通惰性气体流动相组成：流动相配置：

缓冲溶液现用现配，不要储存时间过长，避免pH值发生变

化和成分分解，影响色谱分离的效果；

有机溶液和缓冲液使用前均需经μm微孔滤膜过滤；流动相使用前脱气。 7、常用定量方法：外标法内标法内标物的要求：

化学结构与待测品相似；样品中不存在；

不与样品组分发生化学反应；保留值与待测值接近；浓度相当；与其他色谱峰分离好

8、样品的预处理：

目的：除杂质；浓缩微量成分；改善分离；保护色谱柱；提

高检测灵敏度

方法：高速离心，过滤，选择性沉淀，衍生反应；液固萃取、

液液萃取

沉淀蛋白的溶剂：

有机溶剂：乙腈、甲醇强酸：三氯乙酸、过氯酸盐：50%硫酸铵、10%TCA 分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水第二部分：实验设计

1、考虑问题：动物种属、给药剂量、取血时间、采样量、血药浓度

大概范围

2、分析方法建立：色谱柱、流动相组成、柱温箱温度、样品处理方

法、风量下限与标曲范围

第三部分：实验相关条件与数据处理实验一：

1、采血点设计一般原则

为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点的

设计应兼顾药物的吸收相、平衡相和消除相。一般在吸收相至少需要2~3个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要4~6个采样点。整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。为保证最佳采样点，建议在正式试验前，选择2~3只动物进行

预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。

2、动物给药方式：股静脉注射

3、麻醉：腹腔注射20%乌拉坦

4、采血方式：眼眶静脉丛采血

5、蛋白沉淀方式：10%高氯酸，涡旋，15000rpm 10min,

取100ul上

清二次离心

6、非那西丁色谱条件

流动相：50mM磷酸盐缓冲液中，并稀释到1L）：乙腈

色谱柱：岛津 Shimadzu VP-ODS; 150×; 5μm 检

测波长：254nm 柱温：40℃进样体积：20μL

6、参数计算

曲线线性判断为一房室模型，参数计算如下：

参数 C0 T1/2 k Vd CL MRT AUC 公式 y = 令x=0得 y = 令y=得 T1/2=/k得 Vd=X(给药量)/C0 X=*2mg/ml= CL=k*Vd MRT=1/k AUC=X/CL 值μl/ml 480μ

参数k AUC 非房室值μ-k/=- AUC0~100min= AUC100~∞=C100min/k= AUC0~100min+ AUC100~∞=+ AUMC0~100min=9030AUMC100~∞

=t100minC100min/k+C100min/k2= AUMC=AUMC0~100min+ AUMC100~∞MRT=AUMC/AUC MRT=1/k C0=Div/VSS=/ Div/AUC=/μ AUMC MRT C0 T1/2 CL Vss 12171μg*min2/ml /40min μl/ml 无 VSS=/AUC2=*/

实验二：

1、肝微粒体的制备方法版本一：

获取肝脏：大鼠禁食不禁水24小时后取肝脏，组织匀

浆：称重剪成碎块后加入匀浆液制成匀浆。

差速离心：匀浆液4℃9000g离心15min，弃去沉淀和脂

肪层取上清

液于100000g离心管中离心20min,弃上清，沉淀用pbs

轻轻冲洗。

重悬沉淀：用10ml匀浆液重悬，冻存管分装后置-80℃

冰箱内保存蛋白定量：BCA法版本二：

大鼠拉颈椎处死, 开腹取肝脏, 用滤纸吸干水分, 称

质量。立即

放入冰冷的蔗糖溶液中清洗, 用剪刀剪成碎块, 反复

清洗至无血色。加 4 倍肝质量的蔗糖溶液, 在冰浴中用组

织匀浆机制成匀浆,再超声分散 30 s, 4 C下 10 000 r/min -离心20 min。上清液用四层纱布过滤除漂浮脂物,滤液在 4 C 下 50 000 r/min 离心 60 min, 弃上清液, 沉淀用焦磷

酸钾缓冲液悬浮均匀, 在 4 C 下50 000 r/min 离心 60 min, 沉淀即为肝微粒体。用Tris HCl 缓冲液悬浮均匀, 体

积为原上清液的1/ 4 即可, 分装于塑料管中, 于- 80 C保存, 采用Lowry 法测定肝微粒体蛋白浓度版本三：

2、NADPH体系:

葡萄糖- 6- 磷酸(G- 6- P)

葡萄糖－6 －磷酸脱氢酶(G- 6- P- OH) β-NADP+ 氯化镁 5Mm