蛋白质下游纯化工艺简介
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化工艺蛋白质纯化工艺是一种将混合物中的蛋白质分离和纯化的过程。
蛋白质在生物科学和生物技术领域有着广泛的应用，因此蛋白质纯化工艺的研究和开发具有重要的意义。
蛋白质纯化的目的是从复杂的生物样品中分离出所需的蛋白质，并去除其他杂质。
在蛋白质纯化过程中，常用的方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、透析等。
离子交换是一种常用的蛋白质纯化方法，它基于蛋白质和离子交换树脂之间的相互作用。
树脂上的固定离子与溶液中的离子相互吸附，从而实现蛋白质的分离和纯化。
离子交换方法通常分为阳离子交换和阴离子交换两种。
阳离子交换树脂选择性地吸附带有负电荷的蛋白质，而阴离子交换树脂则选择性地吸附带有正电荷的蛋白质。
凝胶过滤是一种基于蛋白质的分子大小和形状差异进行纯化的方法。
凝胶过滤方法通过将混合物通过一系列孔径不同的凝胶材料，使大分子蛋白质被滞留，而小分子溶质则通过凝胶。
这种方法适用于分离不同分子量的蛋白质。
亲和层析是一种利用蛋白质与特定配体之间的亲和力进行纯化的方法。
亲和层析方法可以利用蛋白质与金属离子、抗体、配体等之间的特异性相互作用，实现蛋白质的选择性吸附和纯化。
亲和层析方法具有选择性强、纯化效果好的优点，因此在蛋白质纯化中得到广泛应用。
透析是一种通过溶液中的溶质浓度梯度来实现溶质扩散的方法。
在蛋白质纯化中，透析方法常常用于去除溶液中的低分子量杂质，如盐和小分子有机物。
透析方法的基本原理是将蛋白质溶液与含有较低浓度的缓冲液分隔开，通过半透膜的渗透作用，使溶液中的小分子杂质扩散到缓冲液中，从而实现蛋白质的纯化。
除了上述常用的蛋白质纯化方法外，还有许多其他方法，如亲水交换色谱、逆流电泳、等电点聚焦等。
这些方法的选择取决于所需纯化的蛋白质特性、目标纯化程度和纯化效率等因素。
蛋白质纯化工艺是一项重要的生物技术工作，通过合理选择和组合不同的纯化方法，可以实现对复杂混合物中蛋白质的高效分离和纯化。
蛋白质纯化工艺的研究和应用将为生物科学研究和生物技术开发提供有力支持，也将为蛋白质相关领域的进一步发展带来新的机遇和挑战。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
蛋白纯化技术简介
在固定相和流动相之间经过多次分配以不同的速率移
动，从而达到分离的目的。
蛋白质层析技术
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蛋白质层析技术
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❖ 层析技术基本原理
1. 吸附层析
混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相 对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。
增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效的亲 和结合。
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2. 凝胶介质的种类
小结
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（＊数字越小，表示介质交
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
①Sepharose（2B,4B,6B） ②Sepharose CL（2B,4B,6B） ③Superose (6,12)
蛋白质纯化技术
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❖ 切向流过滤
切向流过滤（Tangential Flow Filtration ，简称TFF）
其概念是相对于常规过滤（Normal Flow Filtration ， 简称NFF ）而言的。
Sepharose 6 Fast Flow
分离颗粒 范围大小
特性/应用
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pH 稳定性
耐压 最高流速
（Mpa） (cm/h)
Sepharose 4 Fast Flow
蛋白质层析技术
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❖Sepharose CL
蛋白质的纯化的方法及原理
蛋白质的纯化的方法及原理蛋白质的纯化是从其来源中去除其他有机物和无机物，使其成为纯净的蛋白质样品的过程。
蛋白质纯化的方法可以根据需要选择，其中常用的方法包括盐析、凝胶过滤、电泳、金属柱层析、亲和层析、离子交换层析、逆相高效液相色谱等。
下面将详细介绍这些方法及其原理。
一、盐析盐析是利用不同浓度的盐溶液对蛋白质溶液进行逐渐稀释，从而使蛋白质发生沉淀的过程。
纯化蛋白质的关键是利用蛋白质与溶剂中离子之间的相互作用来控制蛋白质的溶解和沉淀过程。
在盐析中，通过选择离子强度和种类可以调整蛋白质溶液中所需溶剂化离子的浓度，达到沉淀和纯化蛋白质的目的。
二、凝胶过滤凝胶过滤是一种分子筛分离方法，利用不同孔径的凝胶进行分离。
凝胶的孔径能够排除较大分子，如核酸和细胞碎片，而较小分子，如蛋白质则能通过孔隙，实现纯化。
该方法简单易行，不需要任何特殊设备，适用于中小分子量的蛋白质纯化。
三、电泳电泳是利用蛋白质在电场中的移动性差异进行分离和纯化的方法。
常用的电泳方法有平板电泳、SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blotting （免疫印迹法）等。
电泳能够根据蛋白质的电荷、分子大小和不同的电场力，在凝胶中分离蛋白质，使其形成带状。
通过切割所需蛋白质的带状区域，可以实现对目标蛋白质的纯化。
四、金属柱层析金属柱层析是利用金属离子与蛋白质之间的亲和性进行分离的方法。
金属柱通常被配制成金属离子亲和基质，并固定在柱子上。
目标蛋白质通过与金属离子发生亲和作用而被保留在柱中，其他杂质则从柱中流出。
通过调节洗脱缓冲液的离子浓度和pH值，可实现对目标蛋白质的纯化。
五、亲和层析亲和层析是利用配体与其特异性结合的蛋白质进行分离和纯化的方法。
通常将配体固定在柱子上，待蛋白质样品通过柱子时，目标蛋白质与配体结合，其他杂质则流失。
通过改变洗脱缓冲液的条件，如离子浓度、pH值和络合剂的添加，可以实现目标蛋白质的纯化。
六、离子交换层析离子交换层析是一种利用蛋白质与离子交换基质之间的相互作用进行分离和纯化的方法。
蛋白质下游纯化工艺简介
蛋白质下游纯化工艺简介Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。
美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。
123456、7pH89、脱盐。
透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常用于蛋白质脱盐。
10、过滤澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介chromatography，色谱，层析表1 常用的液相色谱纯化方法及其原理2、纯化前的准备工作（1）样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性；b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
（2）样品预处理a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟）由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。
如下表所示：表3 不同色谱方法对于样品的要求a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存（数天）a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋白含量测定bcHPLC4（1）（2ab、用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
表4 不同来源的蛋白质样品概述表5 常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数2、离子交换色谱（ion exchange chromatography）蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于脱推c离。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
是当代生物产业当中的核心技术。
该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
常用技术有：１、沉淀，２、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
３、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
４、层析：a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛，又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
５、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
蛋白质分离纯化技术蛋白质的分离纯化一、沉淀法沉淀法也称溶解度法。
其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。
1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。
2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。
3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。
4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。
分离纯化的基本步骤
蛋白质分离纯化的基本步骤蛋白质分离纯化分为四个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎(二)蛋白质的抽提（三）蛋白质粗制品的获得（四）样品的进一步分离纯化。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二)蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
蛋白质分离纯化过程每一步的细化介绍
蛋白质分离纯化过程每一步的细化介绍蛋白质是生物体内最重要的大分子有机化合物之一，它在维持生命活动、调节代谢以及构建细胞结构方面发挥着重要作用。
然而，在生物体内蛋白质的复杂性和多样性使其分离纯化过程变得困难。
为了获得纯度较高的蛋白质样品，科学家们开展了一系列细致入微的步骤。
蛋白质分离纯化的第一步通常是细胞破碎。
细胞破碎可以通过物理方法（如超声波破碎或高压破碎）或化学方法（如细胞裂解酶的作用）来实现。
这一步骤的目的是将细胞膜破坏并释放出细胞内的蛋白质。
接下来，需要进行蛋白质的初步分离。
这一步骤通常采用离心技术，通过不同蛋白质的相对分子质量和沉降速率的差异来实现。
离心可以将细胞碎片、细胞器和其他杂质与目标蛋白质分离开来。
离心的条件可以根据样品的特性进行调整，以达到最佳的分离效果。
在初步分离后，需要进行更加精确的分离和纯化步骤。
这一步骤通常采用各种色谱技术，如凝胶过滤、离子交换、亲和层析和逆流色谱等。
这些技术基于蛋白质的不同性质，如大小、电荷、亲和性等，来实现蛋白质的分离。
通过不断调节色谱条件，可以逐步提高蛋白质的纯度。
需要对获得的纯化蛋白质进行检测和鉴定。
常用的检测方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、质谱分析和免疫学方法等。
这些方法可以确定蛋白质的分子量、组成成分以及可能存在的杂质。
通过综合分析这些结果，可以确定蛋白质的纯度和活性。
总的来说，蛋白质分离纯化的过程是一个复杂而细致的过程，需要一系列的步骤来实现。
通过细胞破碎、离心、色谱分离以及检测鉴定等步骤，可以逐步提高蛋白质的纯度，并获得高质量的蛋白质样品。
这些纯化蛋白质样品在生物医学研究和药物开发领域具有重要的应用价值。
生物工程下游纯化的一般工艺流程
总流程大体包括4个阶段：发酵液预处理和固液分离→提取（初步分离）→精制（高度纯化）→成品制作。
1. 发酵液的预处理和固液分离（或称不溶物的去除）发酵液的预处理可采用的方法及原理：1)加热：把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。
可降低悬浮液的黏度，而且能够加速聚集作用以去除某些杂蛋白等物质，操作比较简单。
对产品的要求较高，热稳定性要好；温度不宜过高，时间不宜过长。
此方法应用较少。
2)调PH：加入草酸、无机酸或碱。
PH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质。
如蛋白质、氨基酸——等电点沉淀法，膜过滤——改变易吸附分子的电荷性质。
3)凝聚和絮凝：将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的块状体，再进行分离。
4)使用惰性助滤剂：惰性助滤剂是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质，用于扩大过滤表面的适用范围，使非常稀薄或非常细小的悬浮液在过滤时发生的快速挤压和介质堵塞现象得到减轻，易于过滤。
固液分离可采用的方法及原理：1)过滤法：迫使液体通过固体支承物或过滤介质，把固体截留，从而达到固液分离的目的。
①传统过滤真空过滤，利用空气和真空之间的压力差进行过滤；压滤，用泵产生的液压或气压作为过滤推动力。
②错流过滤过滤时，料液给过滤介质表面一个平行的大流量冲刷，过滤介质表面积累的滤饼就减少到可以忽略的程度。
离心法：利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行分离、浓缩或提炼。
包括离心沉降、离心过滤、离心分离和超离心。
2)膜分离：利用具有一定选择性透过的过滤介质进行物质分离。
有些操作还涉及到细胞的破碎，细胞破碎的方法如下：1)机械法①研磨和匀浆②超声波：超声波法是一种液相剪切破碎法，频率超过15—20kHx(千赫)的超声波是人耳难以听到的一种声音，它可破碎微生物细胞。
③高压匀浆：机理一：通过针形阀时，压力下降的速度和大小是细胞破碎的原因；机理二：细胞破碎是来自涡流的旋涡使液体细胞颤振的结果；机理三：悬浮细胞在平坦表面上的高速喷射撞击是细胞破碎的主要原因。
蛋白质分离纯化的方法及原理
蛋白质分离纯化的方法及原理蛋白质啊，那可是生命活动中超级重要的大分子呢！就好像是我们身体这个大机器里的关键零件。
要把蛋白质从复杂的混合物中分离纯化出来，就像是从一堆宝贝里挑出最闪亮的那颗宝石。
先来说说沉淀法吧。
这就好比是在一场混乱的舞会中，让特定的人沉淀下来。
通过改变溶液的条件，比如酸碱度、盐浓度等，让蛋白质乖乖地聚集在一起，形成沉淀，然后就能把它们分离出来啦。
就好像有些时候，环境一变，有些人就会自然而然地聚集到一起一样。
还有层析法，这就像是让蛋白质们去参加一场特殊的赛跑，根据它们各自的特点和能力，在不同的赛道上跑，最后就能把它们区分开来啦。
比如凝胶过滤层析，小分子能轻松地在凝胶的缝隙中穿梭，而大分子就会被拦住，这不就分出来了嘛。
离心法也很厉害哦！就像是把一堆东西扔到一个高速旋转的圆盘上，重的就会被甩到外面，轻的就留在中间。
蛋白质也是这样，通过离心，不同重量的蛋白质就会去到不同的地方。
亲和层析呢，就像是给蛋白质设了一个专门的陷阱，只有特定的蛋白质才能掉进去。
利用蛋白质和某些物质的特殊亲和力，就能把目标蛋白精准地抓出来啦。
膜分离法呢，就像是给蛋白质过筛子，合适大小的就能通过，不合适的就被拦住了。
这些方法各有各的奇妙之处，各有各的用处。
就像我们生活中的各种工具，有的适合敲钉子，有的适合拧螺丝。
在实际操作中，可不是随便用一种方法就可以的哦！得根据蛋白质的性质、实验的目的等多方面来考虑。
这可不像在超市随便挑个东西那么简单呢！有时候可能需要几种方法结合起来用，才能得到我们想要的纯净的蛋白质。
想想看，如果没有这些巧妙的方法，我们怎么能深入地研究蛋白质的功能和结构呢？怎么能更好地理解生命的奥秘呢？所以说呀，这些蛋白质分离纯化的方法可真是太重要啦！它们就像是打开生命宝库的钥匙，让我们能一点点地揭开生命的神秘面纱。
总之，蛋白质分离纯化的方法丰富多彩，每一种都有着独特的魅力和作用。
我们要好好地利用它们，去探索那无尽的科学奥秘呀！。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化主要包括“前处理”，“粗分级”，“细分级”三个步骤，本文主要讲述“细分级”，即粗提的蛋白质分离纯化的方法。
蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质不同的生理特性有不同的方法分类，主要根据以下几个性质来设计纯化方法：一、根据分子大小不同分离纯化：蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
1、透析和渗滤：主要利用半透膜透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
2、离心离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。
3、凝胶过滤凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
二、根据溶解度不同分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。
细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程__概述及解释说明
细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述细胞培养法重组蛋白生产是一种常用的生物技术手段，可以通过调控细胞代谢过程来大规模制造特定蛋白质。
这种技术在医药、农业、工业等领域都有广泛应用，为我们提供了丰富的蛋白质资源。
然而，在实际应用过程中，要保证高产量和纯度的蛋白质产出并不容易，因此需要建立完善的上下游工艺流程以及有效的控制策略。
1.2 文章结构本文将从引言开始，逐步深入介绍细胞培养法重组蛋白生产的上下游工艺流程及其相关要点。
首先，在第二节中，我们会详细讨论细胞培养步骤以及蛋白表达和分泌过程。
然后，在第三节中，我们会重点关注收获和破碎细胞的步骤以及蛋白纯化和精制过程。
接着，在第四节中，我们将讨论实施中可能遇到的挑战并提出解决方案。
最后，在第五节中，我们将总结重要观点、结果和发现，并给出未来的展望和建议。
1.3 目的本文的目的是为读者提供一份详尽且清晰的细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程的概述以及相关解释说明。
通过深入了解每个步骤的原理和关键要点，读者将能够更好地理解这种生产方法，并在实际操作中拥有更高的成功率。
我们希望该文可以为相关领域的研究人员、工程师和学生提供有价值的参考，从而推动细胞培养法重组蛋白生产技术在各个领域的进一步应用和发展。
2. 细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程2.1 细胞培养步骤：在细胞培养法中，重组蛋白的生产需要经历一系列的步骤。
首先，需要选择适合的宿主细胞进行培养。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌（E. coli）、哺乳动物细胞等。
然后，将目标基因导入宿主细胞中，并通过合适的启动子和调控元件来实现基因的表达。
接下来是对宿主细胞进行预处理，包括建立种子库、优化培养基和培养条件等。
种子库是为了确保有足够数量和活力的宿主细胞可供后续扩展使用。
针对不同类型的宿主细胞，对培养基成分和配方进行优化可以提高蛋白表达效率和产量。
在进入正式培养阶段之前还需要进行预培养步骤，以使得宿主细胞适应新的环境并增加生长速度。
蛋白质纯化方法及原理
蛋白质纯化方法及原理
蛋白质纯化是一种技术，它将一种特定的蛋白质从其他物质中分离出来，使其达到一定的纯度。
蛋白质纯化的技术有很多种，它们的原理也有所不同。
其中，最常用的纯化技术是电泳分离技术，它可以利用电场的力将蛋白质和其他物质分开，从而实现蛋白质的纯化。
电泳分离技术的原理是，在电场作用下，蛋白质和其他物质形成质子流，由于质子流的原因，蛋白质会在电场中运动，而其他物质则会沿着电场而不动。
由于蛋白质和其他物质的不同性质，电场的作用使它们在电泳液中分开，从而达到纯化蛋白质的目的。
另外，蛋白质纯化也可以利用离子交换技术来实现。
离子交换技术是利用离子交换柱上的离子交换树脂，将蛋白质与其他物质分离的技术。
当蛋白质溶液通过离子交换柱时，蛋白质会被离子交换树脂吸附，而其他物质不会被吸附，从而实现蛋白质的纯化。
此外，蛋白质纯化也可以采用硅胶凝胶柱技术来实现。
硅胶凝胶柱技术是通过利用蛋白质与硅胶凝胶之间的相互作用，将蛋白质与其他物质分离的技术。
当蛋白质溶液通过硅胶凝胶柱时，蛋白质会被硅胶凝胶柱吸附，而其他物质不会被吸附，从而实现蛋白质的纯化。
蛋白质纯化的技术有很多，上述介绍的只是其中三种最常用的技术，
其原理也不尽相同。
不同的技术需要不同的条件，但它们都是通过利用蛋白质与其他物质之间的性质差异，来实现蛋白质的纯化。
蛋白质分离纯化的方式及基本原理
蛋白质分离纯化的方式及基本原理
蛋白质分离纯化是指将蛋白质从混合物中分离出来，并将其纯度提高到足够高的水平，使其具备生物学或生化功能的过程。
蛋白质分离纯化的基本原理是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。
蛋白质分离纯化的基本步骤包括取样、提取、分离和纯化。
首先是取样，这是蛋白质分离纯化的第一步，其目的是从可用样品中取出一部分样品以进行分离纯化。
接下来是提取，这是蛋白质分离纯化的第二步，主要是将蛋白质从样品中提取出来，以便进行后续处理。
第三步是分离，这是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的有效分离。
最后是纯化，这是将分离的蛋白质的纯度提高到足够的水平，使其具备生物学或生化功能的过程。
蛋白质分离纯化的基本原理是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。
它是一个复杂的过程，涉及到各种技术，如沉淀、溶解、离子交换、硅胶等。
分离的基本原理是利用蛋白质的分子特性，如电荷、大小、结构等，在不同的溶剂环境中，蛋白质的分子结构、分子质量和电荷状态会发生变化，从而使蛋白质的分离和纯化变得可能。
蛋白质分离纯化是一个复杂的过程，涉及到多种技术，其基本原理
是利用蛋白质的物理性质、化学性质和生物特性来改变蛋白质的状态，从而实现蛋白质的分离和纯化。
蛋白质分离纯化可以帮助我们更好地理解蛋白质的功能和结构，为后续的生物学研究和药物开发提供重要的信息。
蛋白的分离纯化详细讲解
变性和复性
• 原理：蛋白质在一定的理化条件下失 去原有的空间结构、生物学功能及部 分理化特性等称为变性.当变性条件去 除后恢复原有的空间结构及生物学功 能即为复性.
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯化 原核表达蛋白
二、蛋白质的分离纯化
分离纯化流程
原材料的获取
预处理 （沉淀）
纯化
细胞破碎
研磨 超声 渗透压 酶 ……
• 将上述作用体系的一方连接到层析基质上,使之 固定化,就有可能分离纯化专一作用tag <6-8 Histidine>镍离子-6
个组蛋白 T7-tag <MASMTGGQQMG> HSV-tag <QPELAPEDPED> S-tag <KETAAKFERQHMDS> VSV-G-tag <TTDIEMNRLGK> HA-tag <YPYDVPDYA>
一、蛋白质的分离纯化概述
与蛋白质分离纯化相关的理化特
• 分子大小
性
• 分子形状
哪些技术、原理
• 带电特性
• 溶解特性
• 与配体特异性结合不同
• 吸附性质
• 变性和复性
分子大小 重点
• 大小：蛋白质的分子大小主要取决于蛋白 质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数 目.
• 常用方法 • 透析 • 超滤 • 凝胶过滤 • 离心
离蛋白质混合物最强大的技术,也是蛋白质组学研究的重要技术.
• 基本步骤：第一相等电聚焦后,在等电聚焦的垂直的方向进行第二
相SDS-PAGE.
双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不 同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDSPAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面 上分开.
生物制药下游纯化技术概述
生物制药下游纯化技术概述生物技术通过微生物和细胞培养的使用，是高价值产品的主要来源，且目前制药行业已可大规模地生产，用于不同疾病的治疗。
但无论是通过植物、动物组织、微生物或细胞培养生产，所需的产物通常会存在于相当复杂的料液流体中，需要大量的纯化过程。
所以，在生物科技行业，下游处理部门的生物化学家和化学工程师面临着诸多的挑战。
他们一般在研发阶段使用不同的实验室规模纯化方法，然后再将工艺放大至生产规模，且方法必需经济、高效、快速，以加快产品上市时间。
在生物性产品的工业化生产过程中，由于产品来源以及产品本身的差异，其下游工艺会有很大的差异，所以，每种工艺都必需根据产品的特性及其收获或纯化来源而“量体裁衣”。
本文将简单介绍下游工艺不同阶段所使用的常规技术。
❶发酵液收获下游工艺的第一步是从发酵液中分离生物质。
于细胞内表达的目的蛋白通常为可溶性蛋白，但有些情况下也可能是不溶性的包涵体。
生物质回收常采用制备型离心方法，但现在更倾向于使用有不同孔径选择的切向流过滤系统，孔径规格包括0.2、0.45及0.65μm。
处理时，需选择合适的孔径，以防止处理液中的微粒会进入膜孔，导致滤液流速的显著降低，也通过调节工艺条件控制这一现象，获得优化的进样、滤液流速以及跨膜压。
发酵液的组成会显著影响滤液流速，比如用于控制发酵过程中起泡现象的消泡剂，这种疏水性化合物会快速吸附到膜表面，导致通量降低。
在特定的工艺条件下，某些消泡剂还会从溶液中析出，形成不溶性的微粒，堵塞膜孔。
所以，在选择发酵工艺的消泡剂时，必需考虑到后续步骤。
在细胞收获过程中，通过向细胞浓缩液中补加合适的溶液，即可对细胞进行漂洗（洗滤），该过程也可维持细胞悬液所需的pH或离子强度，避免细胞裂解。
洗滤也可以去除工艺料液中的可溶性杂质。
该步骤通常在细胞浓缩达到特定值而通量迅速降低时进行。
❷细胞裂解及裂解液澄清收获的细胞团块可在高压条件下进行机械破碎，释放所需的产物以进行进一步的处理。
试述蛋白质分离纯化的原理与方法
试述蛋白质分离纯化的原理与方法蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它们在维持生命活动中扮演着关键的角色。
蛋白质分离纯化的目的是将目标蛋白质从混合物中提取出来，并去除其他不需要的杂质。
本文将介绍蛋白质分离纯化的原理和常用方法。
蛋白质分离纯化的原理主要基于蛋白质间的差异性。
根据不同的性质，如分子质量、电荷、疏水性等，可以采用不同的方法进行分离纯化。
以下是常用的蛋白质分离纯化方法：1.等电聚焦（isoelectric focusing）：该方法基于蛋白质在不同pH条件下的电荷差异进行分离。
通过在一个pH梯度中施加电场，蛋白质会在电场的作用下聚集在其等电点（pI）附近，从而实现分离纯化。
2.非变性凝胶电泳（non-denaturing gel electrophoresis）：该方法是一种较为粗略的分离纯化方法，通过基于蛋白质的分子质量进行分离。
常见的非变性凝胶电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）和琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）。
3.变性凝胶电泳（denaturing gel electrophoresis）：与非变性凝胶电泳相比，变性凝胶电泳在分离蛋白质时去除了二级结构和三级结构的影响，使蛋白质只以其分子质量差异进行分离。
SDS-PAGE是最常用的变性凝胶电泳方法之一，它利用SDS （十二烷基硫酸钠）将蛋白质变性，并在凝胶中形成等电点电泳进而进行分离。
4.柱层析（chromatography）：柱层析是一种基于蛋白质在固定相上的亲和力、大小、电荷等性质差异进行分离的方法。
常见的柱层析方法包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析和凝胶过滤层析等。
5.亲和纯化（affinity purification）：该方法利用目标蛋白与特定亲和剂之间的特异性相互作用进行分离。
通过将亲和剂固定在固定相上，然后将混合物经过固定相，目标蛋白会与亲和剂结合，其他杂质则被洗脱。
下游蛋白纯化工艺表征
下游蛋白纯化工艺表征
《下游蛋白纯化工艺表征》
蛋白质是生命体内重要的组成部分，对于理解生物学过程和研究疾病机制具有重要意义。
下游蛋白纯化是指从其它生物组织或者表达系统中得到目标蛋白，并进行纯化、浓缩和表征的过程。
蛋白质纯化的目的是从复杂的混合物中分离目标蛋白，并去除其它杂质。
在下游蛋白纯化的过程中，为了分离目标蛋白，常采用多种不同的分离方法，如柱层析、电泳等。
其中最常用的是亲和层析，通过配体选择性地结合目标蛋白，实现其分离。
其他分离技术还包括离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流层析等。
在完成纯化过程后，需要对得到的目标蛋白进行表征，以验证其纯度和活性。
蛋白质表征的目标包括性质和功能特征等。
性质表征包括分子量、等电点、氨基酸组成等，常用的方法有
SDS-PAGE、2D电泳等。
功能表征则包括酶活性、结合性等，可以通过酶活性测定和配体结
合实验等方法进行。
蛋白质表征的过程中，还需要根据需要进行一些附加的处理和分析。
例如，可以采用Western blotting来检测目标蛋白的免疫反应性，并进行定量分析。
此外，还可以利用质谱技术对目标
蛋白进行序列分析，以确定其组分和修饰。
总之，下游蛋白纯化工艺表征是蛋白研究中的重要环节，为了获得高纯度、活性的目标蛋白，需要灵活运用各种纯化技术和表征方法。
通过精确的纯化和表征过程，能够为蛋白质研究提供准确可靠的基础。
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蛋白质下游纯化工艺简介Revised as of 23 November 2020蛋白质下游纯化工艺简介Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。
美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。
一、纯化工艺常用衔接技术：1、盐析。
常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<-20℃)中可以长期保存。
2、等电点沉淀。
根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。
3、有机溶剂沉淀。
采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。
例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。
4、透析。
根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。
5、超滤。
根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的超滤膜进行超滤。
6、真空冷冻干燥。
利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华为水蒸气的原理。
可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。
7、变性沉淀。
根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。
例如胸腺肽制备中使用的热变性(~80℃)去除杂蛋白。
如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不高则不宜采用。
8、离心沉淀。
利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷冻离心机进行。
9、脱盐。
透析、超滤可用于进行脱盐，SephadexG25、G50常用于蛋白质脱盐。
10、过滤澄清过滤、除菌过滤（微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介chromatography，色谱，层析表1常用的液相色谱纯化方法及其原理1、纯化的一般目标和方法首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
然后进行捕获色谱（capturechromatography），主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。
经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediatechromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。
最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱（polishingchromatography），常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。
2、纯化前的准备工作（1）样品稳定性试验a、测定样品在pH2-9的稳定性；b、测定样品在0-4mol/LNaCl及0-2mol/L硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
（2）样品预处理a、去除样品中颗粒物（微米膜过滤或者10000g离心15分钟）b、去除样品中脂类（10000g离心15分钟或有机溶剂抽提）c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）表2样品中有害杂质及去除办法由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。
如下表所示：表3不同色谱方法对于样品的要求（3）样品的保存条件：短期储存（小于24小时）a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存（数天）a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。
c、样品复杂度检测HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳（CE）。
4、蛋白质的来源（1）天然蛋白：天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
（2）重组蛋白：重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。
重组蛋白主要有三种表达定位：a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
b、外周质：表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
表4不同来源的蛋白质样品概述三、常用液相色谱纯化方法1、凝胶过滤（gelfiltration，molecularsieechromatography分子筛、sizeexclusionchromatography大小排阻色谱，gelpermeationchromatography 凝胶渗入色谱）。
根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。
最常用的经典凝胶为SephadexG系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。
凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。
凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
要点:采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。
表5常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数2、离子交换色谱（ionexchangechromatography）蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。
阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。
由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱对于等电点小于的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。
两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。
columnchromatography（柱色谱）batchchromatography（批色谱）c、疏水作用色谱利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。
d、亲和色谱利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。
例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋白-凝集素，抗原-抗体等。
近来发展了金属螯合亲和色谱，用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。
肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。
e、反相色谱常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。
如血管紧张素（angiotensin）的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
同一个样品在同一Source30RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选择性。
四、应用举例例一、一种抗HIgp120单克隆抗体的Fab片断（中表达）分子量：50kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离子交换去除大部分杂质，疏水作用色谱进一步去除杂质，最后用凝胶过滤分离。
例二、重组表达的α-淀粉酶分子量：；等电点：~6先采用阴离子交换，再进行疏水作用色谱，最后进行凝胶过滤。
例三、重组表达的乙型肝炎表面抗原的分离1、史克公司：（酵母细胞表达）破碎细胞，表面活性剂抽提，离心沉淀、超滤，再经凝胶过滤、阴离子交换，超速离心纯化，脱盐，除菌过滤，吸附，分装。
2、Merck公司：（酵母细胞表达）破碎细胞，去碎片，抗原用多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，甲醛处理，明矾吸附，疫苗。
3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）培养上清液，离心去碎片，50%硫酸铵沉淀，离心，50%KBr处理，脱盐、超滤浓缩、SepharoseCL-4B凝胶柱分离。
4、Below，工艺破细胞，去碎片，加硫酸铵至一定浓度后，直接上Butyl-Sepharose4FF疏水柱，脱盐后上DEAE-SepharoseFF，超滤浓缩后上Sepharose4FF凝胶过滤柱。
例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离（注射用降纤酶）分子量：38kD；等电点：~原工艺：阴离子交换，凝胶过滤，第二次阴离子交换，凝胶过滤达到95%以上纯度，产量6000-10000单位/克蛇毒。
(两周)新工艺：亲和色谱，阴离子交换，凝胶过滤，亲和色谱（一周）纯度达到%以上，产量达20000-25000单位/克蛇毒。
尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后，获得了单成分降纤酶组分，电泳为一条带，HPLC为单峰。
如上图所示，由于每一个步骤均会带来一定的损失，故在可能的情况下应尽量减少下游纯化的步骤（在保证达到所需纯度的前提下）。
重组蛋白纯化的基本策略一、融合表达蛋白的纯化：融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用GlutathioneSepharose凝胶或ChelatingSepharose凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。
二、包含体表达蛋白的纯化：在系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。
一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。
以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于Phenyl-Sepharose6FF （highsub）色谱柱，活性组分再上Q-SepharoseFF进行离子交换，最后上Superdex75prepgrade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。