高分辨率溶解曲线
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用
摘要 ： 饱和 荧光染料 、 未标记探 针 与 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ结合产 生 的
关键词 ： 高分辨率 熔解 曲线分析 ； 种 质鉴定 ； Ｓ Ｓ Ｒ；Ｓ Ｎ Ｐ
中图分类号 ： Ｓ３ ３ ０ 文献标志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ － ０ ０ ５ ７ － ０ ４
高分 辨 率 熔 解 曲线 分 析 （ Ｈｉ ｇ ｈ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ， Ｈ Ｒ Ｍ） 是在实时荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ基 础 上 发展起 来 的一 项新 技术 。 目前 ， Ｈ Ｒ Ｍ 分 析 的应 用 领域
因型 。
多态 ） 分析 、 突变扫 描 、 甲基 化 分析 、 基 因分 型 、 序列 匹
配等研究 ， 近年来 已成 为生命科 学研究 中的热点技 术 … 。在植 物种 质 资源 研 究 中 ， 高 分 辨 率熔 解 曲 线分
析 的应 用 已经 逐步 开展 ， 主要 用 于植 物遗 传 图谱 构建 、 基 因定 位 与标 记辅 助 选 择 、 突 变 检 测 及 种 质 鉴 定 等研
究 Ｊ 。本文对高分辨率熔解 曲线 分析的原理 、 特点及 其在植物种质资源鉴定 中的应用进行综述 ， 并 对该技 术在种质资源鉴定 中的应用前景进行展望。
高分辨率熔解 曲线分析 （ Ｈ Ｒ Ｍ） 技术 的成 功主要 取决 于 ２个方 面 的 因素 ： 饱 和 荧 光染 料 和 高 分 辨率 的 检测 仪器 ２ ’ 。荧 光染 料包 括 非 饱 和荧 光 染 料 和饱 和
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。
在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。
方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。
样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。
除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。
在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。
结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。
发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。
我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。
用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。
我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。
结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。
在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和self-probing扩增。
stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。
self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。
弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。
依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。
高分辨率熔解曲线及其在分子诊断中的应用
二 、 Ｒ 在分子 诊 断 中的应用 Ｈ Ｍ Ｈ Ｍ 能够 在 没有 标 记 荧 光 探 针 的情 况 下 分 Ｒ 析单个 碱 基 的变 化 。假 如 扩 增 子 包 含 有 一 Ｓ Ｐ Ｎ 位点 Ａ＞Ｃ， 可 能 出现的 双链结 构 为 ２条纯 合双 则 链（ ／ Ａ Ａ和 Ｃ Ｃ） ２条 杂化双 链 （ ／ ／ 和 Ａ Ｔ和 Ｃ Ｇ） ／ ，
结 合 如要 达到饱 和 ， 必须 高浓度 加入 ， 过高 浓度 但
会 抑制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 而饱 和 染 料 不抑 制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 因此 占据 了双链 Ｄ Ａ 的所 有 碱基 对 ， 外 ， Ｎ 此 当双 链 Ｄ Ａ局部解 链 时 ， 离下 来 的染 料 亦不会 重 新 Ｎ 游
文献标 志码： Ａ
高 分 辨 率 熔 解 曲线 及 其 在 分 子 诊 断 中的应 用
沈 薇 综述 ， 傅 启华 审校 （ ．上海 交 通大学 医 学院 附属仁 济 医院检 验科 ， １ 上海 ２ ０２ ； ０ １７ ２ ．上海 交通 大学 医学 院附属 上海儿 童 医学 中心检 验科 ， 上海 ２０２ ） ０ １７ 通 过 加热使 双链 Ｄ Ａ解离 为单链 是 Ｄ Ａ基 Ｎ Ｎ 本 特性 之 一 ， 分 辨 率 熔 解 曲 线 （ ｉ ｅｏｕｏ 高 ｈｇ ｒｓｌｔｎ ｈ ｉ
～
息 ， 如 突 变 、 核 苷 酸 多 态 性 （ｉｇ ｕｌ ｔ ｅ 例 单 ｓ ｌ ｎｃｅ ｉ ｎｅ ｏｄ
HRM高分辨率熔解曲线分析技术--百替生物
由于HRM的操作与后期数据分析简单、 易懂,在多个医学研究领域收到了广泛关注并 发展起来,高分辨率熔解曲线已经成为医学上 DNA诊断的最为理想的解决方法。
Thank you!
在非小细胞性肺癌（NSCLC）患者中发现第19号外显子中 存在有(L747-P753insS)突变，为以后针对性的分子诊断以 及设计药物有潜在意义。(Smith et al., 2008) Clinical Pathology
HRM在序列配对中的应用举例
Human Leucocyte Antigen(HLA)人类白细胞抗原：
LC GREEN
高分辨率：
DNA的熔解曲线取决于DNA碱基序列。理论上 任何一个碱基的改变，都会造成TM值的差异，但是 单个碱基改变造成的差异是极小的，通常只有零点 几度。因此要精确检测TM值的差异，就至少需要保 证每0.1℃获取一次荧光信号。 LightScanner
HRM原理示意图
HRM的技术优势：
TM值：当前温度下50%的双链解链为单链
HRM
RealTime PCR
HRM与RealTime PCR的异同点：
需要加入荧光染料
检测获取荧光信号
•采用的染料类型不同（Sybr和LC）
•荧光信号检测时机不同
•分辨率不同
•数据处理方式不同
饱和染料有效避免了检测荧光信号中的假阳性
新的饱和染料降低了传统染料对PCR反应的抑制作用
1.整体操作方法简单，检测灵敏度高，可检测出单个碱基的改 变，检测效率高，5-10分钟即可完成对96/384孔板的检测。
2.从PCR到检测荧光信号，整个过程在同一个管中进行，最大
程度的避免了污染。 3.无需事先知道突变位点，无需设计探针，大大简化实验设计 时间和研究成本。
高分辨率熔解曲线 算法
高分辨率熔解曲线算法
高分辨率熔解曲线算法是一种用于分析物质熔解过程的算法。
以下是一种常见的高分辨率熔解曲线算法的步骤：
1. 数据采集：收集物质熔解过程中的温度和信号强度数据。
可以使用温度计和光学仪器等设备进行数据采集。
2. 数据预处理：对采集的数据进行预处理，如去噪、数据平滑或峰值修正等。
这些预处理步骤可以提高数据质量和信号特征的可辨识性。
3. 峰检测：使用峰检测算法来找到熔解过程中的峰值。
常用的峰检测算法包括一阶或二阶导数法、小波变换法、基线校正法等。
4. 峰分析：对检测到的峰值进行分析，如峰形参数计算、峰峰高度计算等。
这些分析可以提供关于物质熔解过程的定量或定性信息。
5. 曲线绘制：根据预处理和峰分析的结果，将处理后的数据绘制成熔解曲线图。
通常，熔解曲线图以温度为横轴，信号强度为纵轴。
6. 曲线解释：根据熔解曲线的特征和峰分析的结果，解释物质的熔解过程、化学组成或其他相关信息。
需要注意的是，高分辨率熔解曲线算法可以根据具体的数据类
型和分析目标进行调整和扩展。
因此，上述步骤只是一种常见的算法框架，具体的实现可能因应用需求而异。
高分辨率熔解曲线实验优化建议
High Resolution Melting高分辨率熔解曲线实验优化建议picture placeholderApplication Support Center Roche Applied Science Hotline: 800 820 0577Email: asc.support@饱和双链DNA结合染料减少非特异性产物和引物二聚体引物模板Mg 2+ PCR 程序•引物设计–引物退火温度 Tm~60o C–扩增片段长度 <250bp，通常在100-150bp左右–使用专业的引物设计软件；利用BLAST(/BLAST) 来确保引物与模板DNA结合的特异性•引物纯度–使用HPLC纯化级别的高纯度引物•引物浓度–为了避免引物二聚体的生成，使用较低的引物浓度：例如 200nM each•核酸提取–确保所有样品的提纯方法都是一样的–使用高质量的核酸提纯方法。
例如：商业化的手动核酸提取试剂盒或者全自动核酸提取仪•模板浓度–建议模板起始浓度在5-30ng/20ul，扩增曲线的Cp值<30–用吸光度方法计算待测样品的核酸浓度，调整模板浓度使它们的起始浓度相同167 bp PCR FragmentMgCl2 Titration 1.0 – 4.0 mMPCR Primers: 200 nM each Touchdown PCR Protocol (64 – 54°C)MWMPCR Products (+ NTC 4.0 mM)MWM50 bp4.04.03.53.02.52.01.51.050 bpMgCl 2 ConcentrationAgarose Gel 2%Touchdown PCR•用于：当无法进一步调节引物退火温度时•原理：先在较高的温度退火，保证产物的特异性；在后面的循环中，退火温度逐渐降低，保证有足够的产物总量•局限性：Touchdown PCR 不适用于定量实验Example 1: Touchdown PCR with40 Cycles and 0.5 °C step sizeExample 2:Touchdown PCR with45 Cycles and 1°C step size在 LC Nano中编辑 Touchdown PCR•问题：丰度低的突变基因在PCR扩增中很难被检测到•解决方法：选择性的扩增突变序列•Fast COLD PCR原理：–适用于 G/C → A/T 的突变，Tm(wt)>Tm(mut)–变性温度设在Tm(mut)附近，保证在这个温度下只有突变型发生变性•实验必备条件:–精确的温度控制–孔间温差尽量小，保证样品中突变型扩增的富集程度一致•其他应用：–Fast COLD-PCR：优先扩增 Tm 低于野生型 homoduplexes，适用于 (G/C → A/T, 占突变的84%)–Full COLD-PCR：优先扩增 heteroduplexes, 适用于所有突变–Ice-COLD-PCR：与 Full COLD-PCR 相同, 但使用了 reference sequence(RS) oligo, 提高heteroduplex 的突变检出率HRM优化 - Spiking方法区分纯合子样品•问题：纯合野生型和纯合突变型的Tm接近，分组不清晰•解决方法：向所有样品中加入20%纯合野生型样品–Homozygous WT：组分不变–Homozygous MT：含有20% WT–heterozygous：组分不变，仍然是heterozygousAAA B + AABB + AA AAA BBB20% AA20% AA20% AA内容小结•HRM实验优化建议–引物–模板–Mg2+浓度–PCR程序: Touchdown PCR, COLD PCR •Spiking方法区分纯合子样品We Innovate Healthcare。
探针高分辨率熔解曲线
探针高分辨率熔解曲线探针高分辨率熔解曲线是一种具有非常重要意义的实验方法，用于研究材料的熔化过程和其熔化温度。
这项技术的独特之处在于它可以提供非常详细且准确的数据，以揭示材料的相变行为及其分子结构。
本文将详细介绍探针高分辨率熔解曲线的原理和应用，并探讨其在材料科学领域中的指导意义。
首先，让我们来了解探针高分辨率熔解曲线的原理。
这种技术主要依赖于热量传导和温度测量原理。
通过将材料样品置于一个容器中，然后在其周围放置具有精确温度控制的探针，可以实现对样品的精确加热。
随着温度的升高，材料将开始融化并呈现出熔解曲线。
通过记录探针的温度变化，并对数据进行分析，可以得到准确的熔解曲线图。
探针高分辨率熔解曲线的应用非常广泛。
首先，它可以用于研究和分析材料的纯度。
纯度是衡量材料质量的重要指标之一。
通过分析熔解曲线，可以确定材料中存在的杂质和其他组分，并对其进行定量分析。
这对于制药和化学工业等领域来说尤为重要，因为即使微小的杂质也可能影响产品的质量和性能。
此外，探针高分辨率熔解曲线还可以应用于材料的相变研究。
相变是指物质在特定条件下从一个状态转变为另一个状态的过程。
通过研究材料的熔解曲线，可以确定材料的熔化温度、熔化热和熔解焓等重要参数。
这对于了解材料的相变机制、研究材料性能和改进制备方法都具有重要意义。
在材料科学领域，探针高分辨率熔解曲线的应用有助于指导材料的设计和合成。
通过研究材料的熔化行为和熔化温度，可以选择合适的加热条件和制备方法，以确保所得到的材料具有期望的性能和结构。
这对于开发新型功能材料和高性能材料具有重要价值。
总结起来，探针高分辨率熔解曲线是一种生动、全面且具有指导意义的实验方法。
它通过测量材料的熔化温度和熔解焓等参数，为材料科学领域提供了重要的数据和指导。
它在材料纯度分析、相变研究和材料设计等方面具有广泛应用，为我们深入了解材料的性能和结构提供了有效的手段。
在未来的研究中，我们可以进一步探索和发展这一技术，以实现更高的分辨率和更准确的数据分析，推动材料科学的发展和应用。
高分辨熔解曲线(HRM)
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
探针高分辨率熔解曲线
探针高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线是一种用于分析和比较DNA样本的方法。
它可以确定DNA样本中的突变或多态性，并可用于基因分型、疾病诊断和种群遗传学研究等方面。
探针高分辨率熔解曲线分析是通过添加一种特殊的DNA探针，在高温下使其与目标DNA序列发生结合，并随着温度的升高
而解离。
在解离过程中，探针从目标DNA上脱离，释放出一
个特定的荧光信号。
通过监测荧光信号的变化，可以获得
DNA的熔解曲线。
探针高分辨率熔解曲线分析需要使用一种特殊的实时荧光
PCR仪器，该仪器能够在PCR反应过程中准确地测量荧光信
号的强度。
在实际操作中，首先进行常规的PCR反应来扩增
目标DNA序列。
然后，在PCR反应结束后，通过逐温度升高的步骤，观察荧光信号的变化。
通过分析高分辨率熔解曲线图形的形状、峰值位置和峰值面积大小等特征，可以确定样本中的突变类型和数量。
例如，峰值的位置和形状可能会因为DNA序列的不同而发生变化，从而
揭示出目标序列中的突变或多态性。
探针高分辨率熔解曲线分析具有快速、准确、高通量等优点，因此在分子诊断和遗传学研究等领域得到了广泛应用。
它可以用于检测单个基因的突变、多基因的突变和DNA序列的多态
性等。
同时，该方法也可以提供有关目标DNA序列的相对丰
度和表达水平的信息。
高分辨溶解(HRM)分析
HR-1
HR-1仪器是美国Idaho公司采用精确温度控制 技术，并结合高速的数据采集技术，配合使用 高分辨的饱和LC Green荧光染料，使该仪器 具有较高的灵敏度和特异性。分析时不消耗被 测PCR产物样品，分析结束后PCR产物可用 于下游的分析，如测序等。
HR-1特点：
• 升温速率： 0.01 ℃ -1 ℃ / 秒 • 数据采集密度： 100 个数据 / ℃ • 使用 LC Green 荧光染料 • 反应体系 5-20ul • 分析时间： 40-45 样品 / 小时（基于 0.3 ℃ / 秒升温速率）
2、HLA(人类白细胞抗原 ) 基因组配型 器官移植的 HLA 配型、同胞之间 HLA 基因 型确定，如快速确定 HLA 高度多态性位点的 类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移 植前的 HLA 基因型确认 。
3 、等位基因频率分析 4 、物种鉴定、品种鉴定 1 ） 微生物品种、物种快速鉴定。 2 ） 动植物品种鉴定。 5 、甲基化研究 1 甲基化位点的筛查。 2 甲基化程度分析。 用 HRM 方法检测启动子区域内的甲基化，可检测低达 0.1% 的甲基化程度；并根据已知甲基化程度的标准曲线对未知 样品的甲基化百分比进行测定。 HRM 是一种高灵敏度的甲基化 检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床 应用有很大帮助。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
HRM的应用
高分辨率熔解曲线（HRM ）的应用1.引言高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting ，HRM ），是由美国犹他大学病理学部Carl Wittwer 实验室与美国Idaho 公司于2003年共同合作开发出来的一项新技术，并于2006成功生产出世界上第一台商品化的HRM 仪器HR-1[1,2] ，美国Idaho 公司独家拥有该HRM 专利，专利号： 2005-02333335 (Nucleic and Melting Analysis with Saturation Dyes) 和 2006-0019253, (Amplicon Melting Analysis with Saturation dyes)。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性、特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
2.HRM 的原理及操作流程2.1 HRM 的原理HRM 技术的基本原理主要是基于核酸分子物理性质的不同开发出来的。
不同核酸分子GC 含量，GC 分布等是不同的，因此双链 DNA 分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的原理就是根据核酸分子熔解温度和熔解形状的不同来区分样品。
在PCR 反应时引入饱和的荧光染料LC Green ，荧光染料在PCR 扩增的过程中被嵌入到DNA 双链中。
当嵌有染料的DNA 分子解链的时候，仪器对荧光信号进行采集，绘制出DNA 分子的熔解曲线。
DNA 分子的熔解曲线与DNA 分子的GC 含量，GC 分布，片段长度等性质有关，不同的样品由于碱基作用力的不同呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度(Tm 值)[3]。
图1 LightScanner 突变检测原理Tube 1Tube 2Tube 3Wild type Homozygote Heterozygote以二倍体细胞为例，当纯合子样品通过PCR扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图1（Tube1和Tube2）。
KRAS基因突变高分辨率熔解曲线检测技术参数的优化
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高分辨率溶解曲线HRM
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
25:67–90
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲线)同许多荧光PCR技术一样，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。
HRM技术利用dsDNA的物理性质，准确反映DNA序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，无需使用特异性标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低等优点。
实验室检测证明，在PCR反应前或反应后加入饱和dsDNA染料，对HRM分析，效果相同。
在PCR后加入，可闭管进行HRM分析，无需凝胶电泳。
HRM分析，不损伤PCR产物，用于HRM分析的PCR产物仍可用于电泳、胶回收、测序等一系列后续操作。
HRM可应用于核酸突变扫描、基因分型、甲基化检测、短串联重复序列分析、序列匹配和RNA编辑等多方面研究，已越来越受到国内外核酸分子实验室的欢迎和重视。
对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。
在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。
HRM技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR反应体系中加入双链DNA饱和荧光染料，在PCR反应之后再花15 分钟，就可以完成96或384个样品的DNA变异扫描。
采用这种方法，当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。
一、HRM分析条件1. 设备PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列，序列中如有一个碱基发生突变，都会改变dsDNA的解链温度。
但是这种变化差异极小，只有零点几摄氏度，HRM技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。
高分辨率溶解曲线和TEAL-TIME PCR
目前，有不少人把高分辨率熔解曲线(HRM)和Real-time的熔解曲线混为一谈，只要一听到熔解曲线4个字就和荧光定量联系在一起了，再加上现在市面上有些仪器兼具荧光定量和HRM的功能，使一些同行更加迷惑。
今天去给大家讲一下两者之间的区别。
（一）.两者的原理HRM：不同核酸分子的片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同的，因此任何双链DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。
Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）.两者的采集过程HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。
Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。
（三）.两者的应用HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。
基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。
Real-time：定量及基因分型。
基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。
（四）.基因分型方法的费用HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。
（五）.两者所用的染料HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。
Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。
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高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线（HRM）技术的应用举例HRM应用举例1 突变筛查HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。
在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析（表1）。
表1、突变检测方法的比较研究方法优点缺点直接测序法突变检测金标准，能发现已知和未知突变位点每个位点均需要经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本、少位点的样本检测，容易交叉污染。
Taqman探针法适合已知突变位点、位点数量少、通量高的检测价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知突变位点普通PCR方法技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP判断，不能确定何种突变，适宜少量样本检测费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP仅能检测有酶切位点的片断，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。
SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。
芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点仅适用于全基因组扫描，不适宜单个或少数基因的突变位点检测，精度低，价格昂贵。
Illumina技术这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。
高通量检测，在全基因组上扫描分析上有优势，价格昂贵。
MALDI-TOF MS 质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，如盐离子含量等，适宜于已经优化的特定突变检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新突变检测。
检测过程需要多点质控，否则精确度很低。
另外，很重要的一点是过程复杂：PCR+电泳+割胶+纯化等，最后才是质谱监测，PCR需要自己做，并不便宜。
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高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析的主要原理是由于DNA序列的片段长短，GC含量、分布以及碱基互补性差异等的不同，在DNA 分子热变性时会使溶解曲线的形状和位置有所不同。
同许多荧光PCR技术一样，HRM 利用特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测温度变化过程中双链DNA 荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测, 可以迅速的检测出核酸片段中 GC 含量和单碱基的突变。
高精度PCR 仪及饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现使HRM得到广泛的普及和应用。
项目：
已知SNP位点检测；外显子突变位点筛查；物种鉴定、品种鉴定；甲基化研究；法医学鉴定、亲子鉴定。
样本要求：
新鲜或异硫氰酸胍保存的细胞(﹥5×106)、组织(﹥50mg)、血液(﹥300μl)等样本原材料，或纯化好的DNA(OD260/OD280在 1.7-1.9之间)、总RNA(OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好)，或反转录好的cDNA不少于30μl(纯度在1.9-2.1之间，及反转录好的cRNA完整性好)。
技术优势：
高通量：1 次可同时检测多个样本。
高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。
特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性强。
重复性好：样品经PCR 扩增后直接进行HRM，直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。
操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。
成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作步骤，缩短了实验时间，大大降低了使用成本。