体外受精与核移植动物

母细胞的选择
采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞 形成卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complesx COC）。无论采用何种方 法，采集的COC都要求卵母细胞形态规 则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细 胞紧密包围。在家畜体外受精研究中， 常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D 四个等级。A级卵母细胞要求有三层以 上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B 级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层 低于三层或部分包围卵母细胞；C级为 没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D
卵细胞回收与成熟培养
卵细胞的回收 （1）超数排卵 （2）从活体卵巢中采集卵母细胞 （3）从屠宰后母畜卵巢上采集卵母 细胞
（1）超数排卵
对于实验动物如小鼠、兔，以及家畜猪、 羊等采用的主要方法是；用促性腺激素处 理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵 管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。 在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较 高，很少使用。这种方法的关键是掌握卵 子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精 能力的时间，一般要求在卵子具有旺盛受 精力之前冲取。
13.2 体外受精动物
• 体外受精动物的概念 • 体外受精动物的意义 • 体外受精动物的培育程序
体外受精技术的发展
• 20世纪60年代初至20世纪80年代中 期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为 实验材料，进行了大量基因注射 显微操作图。 • 基础研究，在精子获能机理和获能 方法方面取得很大进展。
这些理论和方法上的成就，推动 了体外受精技术的发展，试管小 鼠（Whit-tingham，1968）、大鼠 （Toyoda和Chang，1974）、婴儿 （Steptoe和Edwards，1978）、牛 (Brackett等，1982）、山羊(Hamda， 1985）、绵羊(Hanada，1985）和 猪(Chang等，1986）等相继出生。
胚胎移植的方法
1. 手术法 适用对象：绵羊等小家畜一般采用 手术法移植 操作过程：将同期发情的受体动物 仰面固定在手术床上，全身麻醉，借 助内窥镜观察排卵和黄体发育情况。 腹部切口，将一侧卵巢上有黄体发育 的子宫远端拉出，吧胚胎输入子宫上1 ／3处。也可先用钝形针头在要移植部 位刺一个小孔，然后吧吸有胚胎的胚
胚胎培养
• 受精卵在体外培养发育至桑葚期或囊胚期 才能进行移植。通常情况下，移植的较佳 时期是发育至8 ～16细胞期的胚胎。 • 发育阻滞：是指体外受精的早期胚胎在体 外发育中往往会停止在某一阶段不再发育， 这种现象称为发育阻滞。 • 提高受精卵发育率的关键因素：是选择理 想的培养体系。在家畜中，胚胎培养液分 为复杂的和化学成分明确的培养液两大类。 复杂培养液中的成分很多，除无机和有机 盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和 嘌呤等营养成分和血清，最常用的有 TCM199、B2和F10。用它们培养胚胎时，可
辅助受精两种方法
• 透明带修饰法 • 精子注入法
透明带修饰法
它是运用物理或化学方法对卵母细胞的透 明带进行打孔、部分切除或撕开缺口，为 精子进入卵黄周隙打开通道，然后把卵子 与一定浓度的精子共培养以完成受精过程. 这种方法适用于具有一定运动能力，但顶 体反应不全，无法穿过透明带的精子。它 的优点是对卵子的损伤小，但对于靠透明 带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子 受精，影响胚胎继续发育。目前这种方法 仅在小鼠中取得成功。
2.非手术法
使用对象：对于牛、马等大家畜 经常采用非手术法。 操作方法：一般使用专用胚胎枪 直接插入子宫内注入胚胎。
13.3 试管婴儿
• 试管婴儿：（test －tube baby）是指卵 子与精子在体外受精，培养发育成早 期胚胎，再植回受体子宫内发育出生 的婴儿。 • 1978年，世界首例试管婴儿在英国诞生。 • 1983年，澳大利亚培育出第一例人类冷 冻胚胎试管婴儿。 • 1988年，我国首例常规试管婴儿在北京 医科大学诞生。 • 2000年，我国首例超快速冷冻胚胎移植 的试管婴儿在湖南医科大学诞生。
体外受精动物的意义：
• • • • 发挥优良母畜的繁殖潜力 促进家畜改良的速度 保存遗传资源 辅助技术
体外受精动物培育的程序
• • • • • • 精子采集与体外获能 卵子采集与成熟培养 体外受精 重组胚激活与体外培养 胚胎1.采集精子并选择有活力的精子 上浮分离法：在精液中加入少量培 养液，有活力的精子会游到培养液 上部。这样收集培养液上面的精子 即可得到有活力的精子。 2.精子获能是指精子获得穿透卵子透 明带能力的过程。目前可以采用添 加诱导精子获能物质（如钙离子、 血清蛋白、肝素）的特定培养液来 完成精子体外获能。
精子注入法
它是利用显微操作仪直接把精子注入卵黄周隙或 卵母细胞的胞质中，前者称透明带下授精 （subzonal inseminatiom SUZI），后者称胞质内精 子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）。透 明带下授精对注入的精子数有严格要求：具有活 力且已发生顶体反应的精子要单个注入；没有发 生顶体反应的精子，注入的数目可加大。SUZI的 优点是对卵母细胞的损伤小，已在临床医学上得 到运用，但多精入卵是制约这一技术发展的主要 原因。胞质内精子注射对精子活力、形态和顶体 反应没有特殊要求，只需注入单个精子即可，为 提高受精率，注射后卵子需要人为激活。
试管婴儿（第一代）技术步骤
• 女方超排卵与取卵 • 精子采集与体外获能处理 • 体外受精 • 受精卵体外培养 • 胚胎移植 • 胚胎移植（选择8细胞胚胎）与观察 • 子宫内发育、婴儿诞生
13.4 核移植动物
• 核移植：（cell nuclear transfer）是利用 显微操作技术将一种动物的细胞核移 入同种或异种动物的去核成熟细胞内 的技术。 • 细胞核移植动物：又称为克隆动物 （cloned animal），是指用特定发育阶 段的核供体及相应的核受体（去核的 成熟卵细胞）体外构建重组胚，通过 胚胎移植到受体完成发育出生的动物。 • 细胞核移植动物又称为核质杂种，包
• 辅助受精技术（Techniques f.r assisted fertilizati.n）是IVF的延伸，它是通过人为方 法使精子和卵子完成受精过程，克服在某 些情况下精子不能穿过透明带和卵黄膜的 缺陷。这项技术起源于20世纪60年代，20世 纪80年代得到迅速发展，在医学上已成为治 疗某些男性不育症的主要措施之一；在基 础生物学中，它对研究哺乳动物受精和发 育机理有很重要的价值；它还对挽救濒危 动物和充分利用优良种公畜等有重要意义。 目前哺乳动物的辅助受精技术有透明带修 饰和精子注人两种方法。由于两种方法都 需要借助显微操作仪来完成，所以又称辅
体外受精与核移植 动物
13.1 胚胎工程
• 胚胎工程（embryo technology)是指对 动物早期胚胎或配子进行工程操作， 获得所需要的成体动物的技术。 • 胚胎工程技术主要包括体外受精、 胚胎移植、胚胎分割与融合、胚胎 与精子、卵子冷冻、保存、胚胎性 别控制、胚胎细胞核移植、基因导 入等。
第三代试管婴儿：
• 通过种植前遗传学诊断（PDG）技术培 育出的试管婴儿将被称为第三代试管 婴儿 • 从体外受精的胚胎取出部分细胞进行 基因诊断，排出带致病基因的胚胎后 再进行移植，从而实行胚胎着床前即 诊断出遗传病症的愿望 • 1990年，世界首例PDG试管婴儿成功培 育
第四代试管婴儿：
• 借助别人卵浆增强自己卵子能力 • 特征：卵浆臵换 • 只要针对那些卵子质量不高、活力 差的高龄女性
胚胎移植
胚胎移植（embryo transfer, ET）是指将 发育到一定阶段的胚胎移植到与供体 同时发情排卵、但未经配种的“受体” 母畜卵管或子宫的技术。 胚胎移植应选择与供体发情周期同步、 生殖道正常、无疾病、繁育史良好的 受体。通常采用药物调控发情期的方 法，来刺激或抑制动物的生理周期， 从而达到动物发情的同步化。
（2）从活体卵巢中采集卵母细胞
这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或 腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母 细胞。在家畜中， 牛和马等大家畜常用超 声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直 肠把握卵巢，经阴道壁穿刺插入吸卵针， 借助B型超声波图像引导，吸取大卵泡中的 卵母细胞。按照目前的技术水平，一头健 康母牛每周可获得5~10枚卵子。在家畜中， 活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后 才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母 畜具有重大意义，在有些国家已用于商业 化生产。
二、试管婴儿
世界上第1例试管婴儿 Louis Brown 在英国诞生
中国双胞胎试管婴儿
试管婴儿可分为三个类型：
• 第一代试管婴儿： 1977年，爱德华兹（Edwards ）和 斯蒂普特（Steptoe)培育为第一代试 管婴儿。
第二代试管婴儿：
• 1992年，Palermo的单精子卵细胞浆内 注射（ICSI）是第二代试管婴儿 • 通过先进的显微注射仪将单个精子注 射进卵子内受精培育的婴儿，因此这 种方法又称为显微受精 • 第二代试管婴儿的技术关键在于显微 操作系统与注射技术的建立等
（3）从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞
这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗 涤、保温（30℃~37℃）后，快速运到实验室， 在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一 定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求310mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。用 此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期（GV 期），需要在体外培养成熟后才能与精子受精。 从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的 保温和防止细菌污染。因此卵巢从畜体摘取后须 放入含有生理盐水或磷酸缓冲液（PBS）的保温 瓶中；吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤； 所用溶液都要添加抗生素。 这种方法的最大优 点是材料来源丰富，成本低廉，但确定母畜的系 谱困难。
13.4.1 核移植动物培育流程：
1.核供体细胞获得与取核 供体核细胞可以使原代细胞或 传代细胞，从来源上包括胚胎细胞、 胚胎干细胞、体细胞。分离制备单 个动物细胞，通常采用处于G0期细 胞作为核移植的供体细胞。