AFLP分子标记技术及其应用2

合集下载

AFLP分子标记的发展及应用

收稿日期：００一ｌ１２１Ｏ－５作者简介：静（９９）女，刘１一，硕士，师。Ｅ— ａ：ｕｒ９１＠１３ＣＩ７讲ｍｉｌｊ￣７２６．Ｏｌｉｉｎ
京林业大学学报，００２（）７ — ３２０，２６：９８．
［］李６
１ＡＬＦＰ标记的基本原理、操作流程及技
术关键
１１ＡＩＰ记的原理．ＦＪ标
ＡＬＦＰ标记的原理是对基因组总ＤＡ酶切Ｎ
后经ＰＲ进行选择性扩增。先将基因组ＤＡ用ｃＮ两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段，与并
不断改进和优化，由此衍生出多种相关技术，并使其在遗传多样性、种质鉴定、遗传图谱构建、因定位等研基究中得到广泛的应用。本文即对ＡＬＦＰ的原理、衍生技术及其应用等进行了介绍。
关键词：分子标记技术；ＦＰ应用ＡＬ；中图分类号：５３Ｑ０文献标识号：Ａ文章编号：０１４４（０００－０００１０－９２２１）５０１－５
为第二代分子标记技术，是在随机扩增多态性（ａｄｍｍｐｉｅｏｙｏｐｉＤＡ，ＲＰＲｎｏＡｌｄＰｌｒｈＮｉｆｍｃＡＤ）和
限制性片段长度多态性（ｅｔｃｏｒｍｎＲｓｉｉＦａｅｔｒｔｎｇ
ｎｔＰｌｏｈｓＲＬ）技术上发展起来的ｇＩｏｍｒｉＩｙｐｍ，ＦＰＤＡ多态性检测技术，Ｎ同时拥有ＲＬＦＰ的高重复性和ＲＰＡＤ简便快捷的特点。同其他以ＰＲ为Ｃ基础的标记技术相比，ＦＰ技术能同时检测到ＡＬ大量的位点和多态性标记，具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、ＮＤＡ用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因组产生标记、标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点，１９自９５年由ＺｂａＶｓａｅｕ和ｏｕ创建以来，已在动物、植物和微生

AFLP 技术的基本原理

AFLP 技术的基本原理与实验方法AFLP 技术的基本原理:AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。

接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。

接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。

引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。

选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。

另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。

并与之结合，实现特异性扩增。

实验方法:(1)DNA 酶切AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。

表1：E-M酶切体系表2：P-M酶切体系表3：P-T酶切体系表4：E-T酶切体系表5：M-S酶切体系表6：T-S酶切体系※先将模板吸入PCR板中，再将内切酶、Buffer、双蒸水配制为Mix（因内切酶用量很少或者因少数枪头质量问题，每次吸取内切酶时一定要注意观察吸取是否足量），将配制好的Mix 加入到模板中，最后在配好的反应体系中加入矿物油覆盖离心，放入PCR仪或水浴锅中37℃条件下5－6小时，然后立即转入65℃条件下1小时完全酶切。

一般做1/2倍体系即可。

目前本实验室拥有的内切酶有：EcoRⅠ；MseⅠ；PstⅠ；TaqⅠ；SacⅠ,以上内切酶均为Fermentas 公司生产。

(2)连接表8：连接体系※在连接的过程中不同的内切酶都有其对应的接头（表7），不同的酶切组合就用相应的接头组合。

AFLP分子标记技术在浙蒲2号种子纯度快速鉴定中的应用

ＺｅｕＮ．ａｓｂｉｅｙａａｙｉｏｅｙｒｅｅａｉｈｐｏ２ｗｓｅｔｌｈｄｂｎｌｓｆｔｉｈｂｄｇｎｒｔｎ，ｐｒｎｓａｄａｂｅｄｎｉｅＪ９ａｓｓｈｒｉｏａｅｔｎｒｅｉｇｌ０９．Ｔｏｐｉｆｐｉｒｎｗａｒｏｒｓｍｅ
《植物新品种保护条例》有关育种者权利保护等法规的颁布实施，保护品种选育者的知识产为权，少假劣种子对农户造成损失，用分子标减应记技术进行品种真实性快速鉴定技术正备受关
注Ｊ】。在众多的ＤＡ分子标记中由于ＲＰＮＡＤ技术提供的信息不够全面，复性差，般为显重一
王玲平，丹丽，晓花，宝根，国景戴吴汪李
（浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江杭州３０２）１０１
摘
要：以瓠瓜杂种一代浙蒲２号及其父、母本和品系Ｊ９Ｏ９为材料，建立了利用ＡＬＦＰ分子标记技术进行瓠瓜
杂种纯度鉴定技术体系。从６引物组合中筛选出了两对稳定扩增、４对多态性好、分辨率高的引物组合Ｅ．ＡＣＭＣＡ和ＥＡＣＭ— Ｉ可有效区分父、和杂种一代，Ｃ／ —Ｔ — ＣＪＣＴ，母本适宜用于浙蒲２号种子纯度快速鉴定。
统的依据形态学进行品种纯度鉴定大多依靠田间种植，鉴定所需时间长、率低，效常不能满足种

常用分子标记技术原理及应用

单链制备
通过加热或化学方法将双链DNA变性为单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并观察迁移率变化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可靠性，能够检测出微小的基因组差异，广泛应用于遗传育种、生物多样性保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析，评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生不同长度的片段，通过电泳和染色检测多态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状的基因，辅助育种者快速筛选具有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传结构、物种演化和生态适应性等方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位基因的长度多态性来识别基因组中的变异。

分子标记方法

分子标记方法：AFLP原理和操作步骤AFLP原理：AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。

但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。

实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。

实验试剂Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、dNTPs、二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化参考大量提取DNA实验方法提取基因组DNA。

DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化，首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次，离心吸上清液于Eppendorf 管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g 离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次，风干后溶于30μlTE缓冲液中，UV-2401PC 紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA 浓度大约为100ng/ul。

（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液，2.5μl 10×T4DNA 连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ，5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸水补至25μl。

AFLP的原理及其应用

基础理论　Basic researchA FLP的原理及其应用王　斌　翁曼丽(中国科学院遗传研究所　100101)提　要:AFLP是检测DNA多态性的一种新的分子标记技术。

对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述。

关键词:分子标记技术　AFLP　原理　应用1　分子标记技术的快速发展在过去10a中,分子标记技术得到了突飞猛进的发展,至今已有10余种分子标记技术相继出现,并在各个研究领域得到了应用。

其中在植物分子生物学领域中应用最广泛的是RF LP和RA PD。

R FL P 的结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁图,例如水稻RF LP连锁图的建立〔1,2〕。

RF L P比较作图进一步揭示了在主要粮食作物中,R FL P标记在染色体上的排列具有类似的顺序〔3,4〕。

因此R FL P 自出现至今虽然已有10多a了,但它仍是当今应用最广泛的一种分子标记。

然而,R FL P必须经过滤膜转移和So uthern杂交,费时、费力、周期长。

另外, RF L P对DN A多态性检出的灵敏度不高,RF L P连锁图上还有很多大的空间区,这限制了它的进一步发展。

PCR对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用,迄今所用的分子标记技术尽管可以分为多种类型,其实除了以传统的Souther n杂交为基础的RF L P外,其它各类分子标记都涉及P CR。

R AP D就是以随机引物为模板通过P CR扩增进行DN A多态性研究的,与RF LP相比,它较便宜,方便易行,非常灵敏,DN A用量少,而且不需要同位素,安全性好。

继RF L P之后,RA PD是应用最广泛的,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的R AP D标记。

近来西红柿P to基因和水稻Xa21基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RA PD标记,然后通过M BC(M ap based clo ning)方法克隆了目的基因〔5,6〕。

AFLP分子标记技术及其在药用植物研究中的应用

［］晓慧，．６２谢等５６咧临床药物咨询刚顾性分析中阑药房．０１２０，
１（）：３～４９２７４８３
终得到各方的支持和院方的资助．物咨询服务一定会更好药
的为广大患者服务。
２ＴｅｃｉｇＨｏｐｔｌｏｈｎｏｇＵｎｖｒｉｆＴＣＭ，ｉｎｎ２０１）．ａｈｎｓｉａｆＳａｄｎｉｅｓｔｏｙＪａ５０１
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ
Ａｍｐｉｉｄｆａｌｆｅｒｇｍｅｔｌｎｈｐｌｍｏｒｓ（ＦＩＰ）ｉｅｍｏｌｃａａｋｒｔｃｉｅｉｅｎｅｇｔｏｙｐｈｉｍＡｓａｎｗｅｕｌｒｍｒｅｅｈｎｑｕｎｖｎ—
（东中医药大学，东济南２０５；．山东省农科院作物所，东济南２００；．山东中医药大学附属医院，东济南２０１）山山５３５１山５１０２山５０１
摘要：增片段长度多态性（ｍｐｉｅｒｇｎＬｎｔｏｙｏｐｉＡＬ）一种在ＰＲ技术和ＲＬ扩ＡｌｉＦａｍｅｔｅｇｈＰｌｍｒｈｓｆｄｍ，ＦＰ是ＣＦＰ标记技术基础上发明的新的分子标记技术。本文简述了ＡＬＦＰ分子标记技术的原理和特点，述了其在药用植物遗传连锁图谱的构建综遗传多样性研究、质资源鉴定等方面的应用情况，对其发展前景进行了展望。种并

分子标记――AFLP原理和操作步骤

分子标记――AFLP原理和操作步骤一、原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA 分子标记技术。

但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增,然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳,多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接,连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。

实验中,根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物,可以达到选择性扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段,进行结合,导致特异性扩增。

二、实验试剂Taq酶 EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头 E+A引物M+C引物T4DNALigaseE和M引物琼脂过硫酸胺丙烯酰胺尿素硝酸银甲酰胺 dNTPs 二甲苯青冰醋酸玻璃硅烷50bpMark三、操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化A 、参考实验一的大量提取DNA实验方法，B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5µg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化,首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次, 离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/1 0体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇,－20℃放置2h以上，10000g 离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ,风干后溶于30μlTE缓冲液中，UV-2401PC(岛津)紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5µg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300u l，此时DNA浓度大约为100ng/ul。

（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng,2.5μl 10×酶切缓冲液, 2. 5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ, 5U MseⅠ,2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25μl。

AFLP标记技术及其在猪遗传育种中的应用

畜牧兽医科技信息２００７．０７１４作者简介：任斌（１９８１～），男，硕士研究生，研究方向：动物分子数量遗传育种。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｅｎｂｉｎ２０５０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ%通讯作者：黄生强（１９６８～），男，副教授，硕士生导师．研究方向：分子遗传与动物育种。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｓｑ３２１＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ前言扩增片段长度多态性（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙ－ｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）技术是由Ｚａｂｅａｕ等１９９２年发明的，并于１９９３年获得欧洲专利局专利。

它是在ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ结合的基础上发展起来的，克服了两者各自的缺点，而集中了二者的优点，它既有ＲＦＬＰ的可靠性，又有ＲＡＰＤ的方便性。

ＡＦＬＰ被认为是迄今为止最为有效的分子标记，不管基因组ＤＮＡ有多么复杂，理论上讲，用ＡＦＬＰ方法都可以检测出它们的多态性。

它不仅具备了多态性丰富、共显性表达、不受环境影响、无复等位效应的特点，而且还具带纹丰富、用样量少、灵敏度高、快速高效的特殊优点。

一个０．５ｍｇＤＮＡ样品，可做４０００个反应，获得８万个标记，６５０万条带纹。

通过实验验证，ＡＦＬＰ被认为是一种理想的有效的分子标记，已用于基因鉴定!基因作图!基因表达等方面。

目前，不仅在水稻、小麦和棉花等主要农作物上得以应用，还在羊、猪和狗等动物遗传育种中得到广泛应用。

本文将主要对ＡＦＬＰ标记技术在猪遗传育种中的应用加以综述。

１ＡＦＬＰ的发生发展!基本原理及其技术流程１．１ＡＦＬＰ的发生发展ＡＦＬＰ（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是１９９２年由荷兰科学家Ｚａｂｅａｕ和Ｖｏｓ发展起来的一种检测ＤＮＡ多态性的新方法。

至今正式发表的关于ＡＦＬＰ的论文还不多，可实际上做这方面研究的人已很多。

首先在棉花，水稻等农作物的遗传育种等方面得以快速应用，粟米群等［６］应用ＡＦＬＰ标记鉴定小豆栽培型种质遗传多样性认为ＡＦＬＰ是一种可靠又理想的遗传标记方法。

分子标记——AFLP原理和操作步骤

分子标记——AFLP原理和操作步骤一、原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。

但AFLP是通过P CR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。

实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。

二、实验试剂Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、dNTPs、二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark三、操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化A、参考实验一的大量提取DNA实验方法，B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组D NA进行纯化，首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（2 4∶1）各抽提一次，离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次，风干后溶于30μlTE缓冲液中，U V-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。

（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ，5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25μl。

AFLP分子标记技术

•二、AFLP的基本原理是什么？•三、AFLP的实验过程怎样？•四、AFLP的应用研究如何？•五、对AFLP的评价分子标记的历史：•第一代分子标记技术RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）•第二代分子标记技术RAPD（Random Amplified PolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片断长度多态性）•事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分子标记的SNP（单核苷酸多态性)等AFLP的基本原理•基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增。

最后只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增；最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。

AFLP的实验流程•模板制备DNA的提取（SDS法和CTAB法）酶切连接PCR扩增(PCR AMPLIFIED )预扩增(Pre-amplified)选择性扩增(Elective amplified)DNA的提取（SDS法和CTAB法）•SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为十二烷基磺酸钠，•CTAB是Cetyltrimethyl ammoniumbromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨，•两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出来，另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

酶切•为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个用6个碱基识别位点的限制性内切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI)，另一个用4个碱基识别位点的限制性内切酶(常用MseI、TaqI)。

AFLP分子标记技术的新进展及其在法医植物学中的应用

ＡｂｔａｔＡｍｐｉｅｒｇｎｅｇｈｐｌｍｏｐｉ（Ｌｓｒｃ：ｌｄｆｍｅｔｌｎｔｏｙｒｈｓＡＦＰ）ｉａｎｗｍｏｅｕａｒｅｏｄｔｃｅｏｃｉｆａｍｓｅｌｃｌｒｍａｋｒｔｅｅｔｎｍｉｇ
Ｋｅｏｄ：ｆｅｓｅｉｎ；ｏａｙｒｖｗ［ｂｉｔｎｔｐ］ｍｏｃｌａｋｒＡＬｙｗｒｓｏｎｉｍｄｉｅｂｔ；ｅｉｐｌａｏｙｅｒｃｃｎｅｕｃｉ；ｌｕａｍｒｅ；ＦＰｅｒ
ＰＲ技术的出现是ＤＡ遗传分析的一场革命，ＣＮ
中的应用情况。
关键词：法医学；植物学；综述［文献类型号：Ｆ９．Ｄ７５２文献标志码：Ａ文章编号：１０ — ６９２０）５０７ — ３０４５１（０８０ — ３５０
院，海２０３）上０４３
摘要：扩增片段长度多态性（ｍｐｉｅｒｇｎｅｇｈｐｌｍｏｐｉＡＦＰ是一种用来检测基因组多态ａｌｄｆａｍｅｔｌｎｔｏｙｒｈｓｉｆｍ，Ｌ）
性的新一代分子标记。有分辨率高、定性好、复性好等特点。年来，究人员对该技术进行了不断的具稳重近研优化和完善．由之衍生出多种相关技术。ＦＰ技术在动物、物及微生物等许多研究领域已有广泛应用，并ＡＬ植在法医植物学中得到初步发展并成为研究热点。本文主要介绍了ＡＬＦＰ技术的新进展以及在法医植物学

实验推荐分子标记技术AFLP

实验推荐分子标记技术AFLP 引言：分子标记技术是现代遗传学和分子生物学研究中不可或缺的工具之一。

由于其高度多态性和高分辨率的特点，AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）技术在种质资源评价、基因组构建和进化生态学研究等领域得到广泛应用。

本文将介绍AFLP 技术的基本原理、实验步骤及数据分析方法，旨在为研究人员提供一种高效、准确的分子标记技术。

一、AFLP技术的原理AFLP技术利用限制性内切酶对基因组DNA进行特异性切割，然后通过PCR扩增和电泳分离等步骤，获得多态性的DNA序列。

其原理流程如下：1. DNA提取：从不同样本（如植物、微生物等）中提取总DNA，保证所需的DNA质量和浓度。

2. 酶切反应：选择适当的限制性内切酶对DNA进行切割，生成特定的DNA片段。

3. 适配体连接：将适配体序列连接到DNA片段的末端，使其成为PCR扩增的起始模板。

4. 扩增反应：利用引物对连接的DNA片段进行PCR扩增，生成大量的AFLP产物。

5. 电泳分离：将扩增的AFLP产物进行电泳分离，根据片段的大小而呈现不同的迁移距离。

6. 成像和数据分析：利用凝胶图像获取AFLP分析结果，并进行数据分析和解读。

二、AFLP实验步骤AFLP实验的具体步骤如下：1. 样本准备：选择适当数量的样本，根据研究目的确定样品的种类和数量，并进行相应的预处理。

2. DNA提取：采用合适的DNA提取方法提取样本中的总DNA，并进行质量和浓度检测。

3. 酶切反应：选择合适的限制性内切酶对DNA进行酶切反应，生成DNA片段。

4. 适配体连接：将适配体序列连接到DNA片段末端，以便进行扩增反应。

5. 扩增反应：利用PCR技术对连接的DNA片段进行扩增，生成大量的AFLP产物。

6. 电泳分离：将扩增的AFLP产物进行凝胶电泳分离，根据片段大小进行排序，形成AFLP图谱。

7. 图谱分析：根据AFLP图谱进行数据分析，解读样品之间的遗传关系。

AFLP分子标记技术及其在蔬菜遗传育种中的应用进展

ＥｃＲＩｄｐｅ：ｏａａｔｒ
‘
１ＡＬＦＰ的简介、术流程及其特点技
１１ＡＬ．ＦＰ的简介
（０ｐｏ￣）５一ＴＴＡＧＴＣ５ｍｌＬ：ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣ／
ＣＡＴＣＧＣＡＴＴＡ一５ＴＣＧＡ完全匹配则扩增效果好，时候和引物３端的最后１个有
碱基能配对（其他碱基有一些不配对）的片段也能进行扩增，
但扩增效果不好。所以只有和含有选择性引物很好配对的片段，能被大量地扩增出来。才
的一种检测ＤＡ多态性的分子标记技术。Ｎ
１２ＡＦＰ的技术流程．Ｌ
（０ｐｏＩ）５一ＡＡＡＣＧ５ｍｌｘ：ＧＣＧＴＧＧＴＣＴＡＧ／Ｌ
ＴＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＡＣＴ一５
分子标记是在形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的新的较为理想的一种遗传标记形式，以生物大分子是物质，其是生物体的遗传物质— — 核酸的多态性为基础的尤
遗传标记，近年来分子生物技术为蔬菜遗传育种研究带来了
（．１山西农业大学园艺学院，山西太谷０００；２北京市农林科学院蔬菜研究中心，３８１．北京１０９）００７
摘要：扩增片段长度多态性（ＦＰ技术是检测ＤＡ多态性的一种分子标记技术。本文介绍了ＡＬＡＬ）ＮＦＰ分子标记技术的基本原理、技术流程及特点，及其在蔬菜遗传与育种中的应用进展，并对其前景进行了展望。

分子标记在作物种质资源评价中的应用

分子标记在作物种质资源评价中的应用作物种质资源是现代农业发展的重要基础和保障。

种质资源评价是作物育种和遗传改良的基础环节，而分子标记技术是评价作物种质资源不可或缺的手段之一。

本文将从分子标记技术原理、种质资源评价方法、应用案例等方面对其应用进行探讨。

一、分子标记技术原理分子标记可以简单解释为在分子水平上，对不同个体之间基因变异的特异性检测。

作为现代分子遗传学的重要组成部分，分子标记技术已广泛应用于种质资源评价和遗传改良。

常见的分子标记类型包括基因多态性序列标记（SSR），单倍型标记（SNP）和扩增片段长度多态性标记（AFLP）等。

分子标记的基本原理是利用基因间重复DNA序列的变异，通过PCR扩增和电泳分离，检测出个体间的DNA序列变异差异。

二、种质资源评价方法（一）基于分子标记的种质资源评价分子标记在种质资源的快速鉴定、分类和遗传多样性评价中发挥了重要作用。

基于分子标记的种质资源评价方法包括基因频率分析、遗传距离图谱、群体分化分析等。

其中，遗传距离图谱是使用分子标记数据构建的一种反映不同种质资源群体之间遗传距离关联程度的图谱。

通过不同种质资源群体之间的DNA序列变异差异，可以将其聚类到同一分支上，或者说明它们在遗传上存在相似性。

（二）基于表型的种质资源评价基于表型的种质资源评价是传统的种质资源评价方法，包括外形鉴定和生理生化鉴定等。

这些评价指标总是受到环境因素影响，因此不能全面反映种质资源的遗传特性。

基于分子标记的种质资源评价方法可以洞察到DNA序列层面上的变异情况，可以判断群体间的遗传多样性差异，有助于发现群体之间的亲缘关系和遗传稳定性。

三、应用案例（一）玉米品种种质资源评价玉米是世界上最重要的粮食作物之一，其种质资源评价具有重大意义。

使用SSR标记对我国60个玉米品种进行了RD、IR和TYL三个玉米螟的抗性评价。

研究结果表明，具有抗RD和TYL两种抗性的玉米品种比只有IR抗性的品种更为抗虫。

AFLP技术及其在水生动物研究中的应用

摘要ＡＬＦＰ技术是近年来发展起来的一种新型分子遗传标记技术，技术在遗传多样性分析，该遗
传图谱构建以及遗传育种等方面均具有重要的作用。介绍了ＡＦＰ的发展背景、本原理和特点，对Ｌ基并其在水生动物研究方面的应用情况进行了综述。
ＤＡ．基因组ＤＡ、ＤＡ、Ｎ质粒、一个基因Ｎ如ＮｃＮｍＲＡ、某
或基因片段；时，ＦＰ有一个Ａ的序列特征，同样一套限制酶、头以及Ｎ用接引物可对不同生物的ＤＡ进行标记研究。Ｎ２５等位基因共显性在可分辨的长度范围内不．同长度的等位基因可通过电泳共显于同一凝胶上。然
护我国水域生态系统的多样性均具有重要的意义
１ＡＦＬ基本原理Ｐ
而ＡＦＰ分析具有很强的可重复性。Ｌ２４适用性广ＡＬ．ＦＰ标记技术适用性广，其适合尤于一些多态性低或特定品种的遗传研究和连锁图谱的构建。ＡＬＦＰ技术适用于任何来源和各种复杂度的
次为ＳＲ、ＡＤ和ＲＬＳＲＰＦＰ。
需要知道待测基因组的序列信息且具有分辨率高、结果可靠、复性好等优点。因此．ＲＬ重与ＦＰ和ＲＰＡＤ等分

aflp技术的原理与应用

AFLP技术的原理与应用1. 简介AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）技术是一种基于PCR扩增的分子标记技术，用于研究基因组的遗传多样性和基因型差异。

它结合了限制性内切酶的切割特点和PCR扩增的高效性，可以快速而高效地分析大量DNA样本上的多态性。

2. 原理AFLP技术将DNA分子进行限制性内切酶切割，得到的片段通过两次PCR扩增反应使其增加特异性引物序列，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析DNA片段的长度差异，从而确定遗传多样性。

AFLP技术的主要步骤包括：2.1 DNA样本的制备首先，需要从研究对象中提取DNA样本，并通过质量检测确保样本的质量和纯度。

通常使用酚/氯仿法、磁珠法等方法提取高质量的DNA。

2.2 限制性内切酶切割将提取的DNA样本与适当的限制性内切酶一起孵育，选择性切割DNA片段。

不同的内切酶会产生不同的切割模式和DNA片段长度。

2.3 适配体连接适配体是特定序列的引物，通过连接适配体，使得限制性内切酶切割的DNA 片段获得特异性序列。

适配体连接反应包括两步PCR反应，第一步是单核苷酸加酶反应（T4 DNA核苷酸转移酶），第二步是锚定PCR。

2.4 扩增和荧光标记经过适配体连接后的DNA片段即可进行扩增反应。

采用带有荧光染料的引物进行PCR扩增，荧光标记的引物可用于不同长度的DNA分子之间的区分。

2.5 凝胶电泳分析将扩增产物进行凝胶电泳分析，通常使用聚丙烯酰胺凝胶，根据DNA片段的长度差异，通过荧光检测仪或射线照射，获得DNA的长度信息。

3. 应用AFLP技术具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，广泛应用于生物学和农学等领域。

以下是AFLP技术的一些应用：3.1 遗传多样性研究AFLP技术可以用于测定不同个体、种群或物种之间的遗传多样性，从而了解基因组的遗传变异情况。

3.2 基因型鉴定AFLP技术可以用于鉴定不同个体或物种之间的基因型差异，以区分各个个体或物种。

AFLP分子标记在枣研究中的应用进展

AFLP分子标记在枣研究中的应用进展摘要：aflp技术已广泛应用于果树种质资源的研究，本文就aflp分子标记技术的原理与特点，以及在枣研究上的应用进行了概述，对当前枣属植物研究领域aflp应用存在的问题进行了分析，并对其前景作出了展望。

关键词：分子标记；aflp；枣中图分类号：s665.1 文献标识码：a 枣（zizyphus jujube mill.）为鼠李科（rhamnaceae）枣属（zizyphus mill.）植物，早在3000多年前，我国就将枣作为重要的栽培果树。

据《中国果树志·枣卷》统计全国有枣树品种700余个，品种类型之多居世界首位。

枣树品种繁多，品种或类型名比较混乱，如“冬枣”就有20多个不同的地方品种，传统外观形态的鉴别方法很难鉴别，因此，迫切需要寻求有效、快速鉴别品种或类型的方法。

另外，枣树各品种之间的亲缘关系研究，种质资源的保存及各品种的发育和进化历程探所也需要快速有效的技术手段。

分子标记技术的迅速发展为上述问题的解决提供可能。

近年来分子标记技术在植物学领域得到广泛应用，如彭建营等利用rapd 技术对枣的遗传变异进行了研究，确定基本品种分；乔勇等对21个枣品种（系）进行了aflp指纹分析；宋婉对枣品种进行了rapd 和aflp分析，在rapd分析中，结合13个引物的扩增结果，可将供试品种全部分开；aflp分析中，9对引物可将供试品种鉴别开。

aflp是通过选择性扩增片断产生多态性分析鉴别品种，与rapd相比，多态性更高，重复性更好，已广泛应用于多种果树种质资源鉴定，本文对其在枣研究中的应用进行概述。

1 aflp的技术原理和特点aflp（amplified fragment length polymorphism）是1993年由荷兰keygene公司的zabeau和vos等创建的一种新的dna分子标记技术，它是指扩增的限制性片段长度多态性。

其以基因组dna 经限制性内切酶消化后的片断连接人工接头作为扩增模板，利用设计的引物进行pcr扩增，扩增产物经变性聚丙烯酰胺电泳分离，通过一定的检测手段将dna指纹显示出来。

利用分子标记鉴定植物种属和DNA分型技术的应用

利用分子标记鉴定植物种属和DNA分型技术的应用植物是人类赖以生存的物种之一，而植物种属的鉴定则是植物科学研究中的重要环节。

为了更好地了解植物种属的基因信息，科学家们把目光投向了分子遗传学领域，并通过分子标记鉴定和DNA分型技术等手段，成功解决了许多植物种属的分类问题。

一、分子标记鉴定植物种属分子标记是指通过分子生物学技术鉴定分子相似性的一种方法。

在植物种属的鉴定中，分子标记被广泛用于DNA序列的测定和基因的克隆，进而确定植物之间的遗传关系。

1. DNA片段长度多态性分析DNA片段长度多态性分析（AFLP）被广泛应用于植物种属的鉴定。

这种分子标记技术是通过缩合酶反应将基因组DNA片段扩增，并将其进行电泳分离，然后在凝胶上观察不同长度的片段，从而鉴定植物种属。

2. 序列关联分析序列关联分析（SSR）也是一种常用的分子标记鉴定植物种属的技术。

SSR技术主要是通过PCR反应扩增核苷酸序列，并在凝胶上观察序列间的不同长度，从而实现鉴定不同的植物种属。

二、DNA分型技术在植物种属鉴定中的应用DNA分型技术是基于分子遗传学原理，通过PCR反应分析特定DNA区域的多态性，以此来确定不同植物种属的遗传关系。

在植物种属鉴定中，DNA分型技术可采取PCR-RFLP、SSCP、SNP和STR等多种技术手段。

1. PCR-RFLP技术PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性）技术是将PCR扩增出的特定DNA序列加入酶切物并酶解，进而将其分离并观察。

PCR-RFLP技术能够明确不同植物种属的遗传差异，进而进行鉴定。

2. SSCP技术SSCP（单链构象多态性）技术是通过PCR扩增DNA片段，并将其进行单链分离，再通过凝胶电泳进行分析。

该技术能够比较直观地分析出不同植物种属之间的差异，进而鉴定植物种属。

3. SNP技术SNP（单核苷酸多态性）技术主要是通过PCR扩增目标DNA片段，然后进行DNA测序以观察SNP变异。

cDNA-AFLP分子标记技术及其在茶树育种上的应用前景

Ａｂｔａｔｓｒｃ
ＡｍｅｈｄｆｔｏｏＡＦＬＰ— ｓｄｉｅｐｉｉｇｆ — ｅｆｎｇｒｒＡＦＬＰｗａｓ
ｄｅｅｏｅｎｅｅａｓＢｅａｓｔｒｌａｌｔａｄｖｌｐｄｉｒｃｎｔｙｅｒ．ｃｕｅｏｆｉｓｅｉｂｉｉｙｎｈｉｒｐｒｄｕｉｌｔｔｓｅｈｎｑｉｇｈｅｏｃｂｉｙ，ｈｉｔｃｉｕｅｓｉｗｉｌｐｉｄｉｌｎｔｒｓａｃｆｒｉｔｎｃｍａｐｉｇｏｆｇｅｅｉｏｉａｄｉｅｔｆｉｇｇｎｅ．Ｉｈｅｄｅｙａｐｌｅｎｐａｅｅｒｈ，ｏｎｓａｅ，ｐｎｎｔｃｌｃｎｄｎｉｙｎｅｓｎｔｐｅｅｐｒ，ｈｅｒｎｃｐｌｐｒｃｄｕｅｎａｒｓｎｔｐａｅｔｐｉｉｅｏｅｒａｄｐｐｌａｉｎｗｅｅｄｅｃｉｅｉｔｏｒｓｒｂｄ．Ｎｏｗｈｉｔｃｎｉｕｅｃｔｓｅｈｑｈａｓｂｅｓｄｉｐｐｎｅｔｃｌｃｎｔａａａｘｐｎｓｖｅｐｏｓｃｎｔａｂｒｅｎｅｎｕｅｎｍａｉｇｏｆｇｎｅｉｏｉｉｅｎｄｈｓｅａｉｒｐｅｔｉｅｅｄｉｇ．Ｋｅｒｓｔａｂｒｅｎｃｙｗｏｄｅｅｄｉｇ；ＤＮＡ— ＡＦＬＰ；ａｐｉｇｏｎｔｃｌｃｎｄｎｔｆｉｅｓｍｐｎｆｇｅｅｉｏｉａｄｉｅｉｙｎｇｇｎｅ
（江大学茶叶研究所浙杭州３０２）１０９