AFLP分子标记技术及其应用2
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?AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，
扩增片断长度多态性） ? 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、
SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称 为第三代分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性) 等
AFLP 的基本原理
? 基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子 量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人 工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形 成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR 引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行 预扩增和选择性扩增。最后只有那些两端序列能 与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增； 最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯 酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。
AFLP的实验流程
? 模板制备
?DNA的提取（SDS法和CTAB 法）
? 酶切 ?连接
扩增片段通常用变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳，根据扩增片段大小范围选 择应用4% 一10% 的凝胶电泳。
?PCR扩增(PCR AMPLIFIED )
?预扩增(Pre-amplified)
?选择性扩增(Elective amplified)
叫做扩增片断长度多 h.所得数据可在实验室之间交
பைடு நூலகம்
态性。
流和比较
分子标记的历史：
? 第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
? 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA ）
?扩增产物凝胶电泳
应用放射自显影、银染、荧 光测序仪等方法显示结果，
?结果分析
通过Gene-Scan, Gel-Compare 等软件进行数据分析。
DNA的提取（SDS法和CTAB 法）
? SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为 十二烷基磺酸钠，
? CTAB是Cetyl trimethyl ammonium bromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨，
? 两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜 使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出 来，另外，它还能保护DNA不受内源核 酸酶的降解。
酶切
? 为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内 切酶，一个用 6个碱基识别位点的限制性内切酶 (常用 EcoRI,、PstI或SacI )，另一个用 4个碱基识别位点的限制 性内切酶(常用MseI 、TaqI) 。采用双酶切的主要原因有： (1)多切点酶产生较小的 DNA片段，而切数点较少的酶 能够减少扩增片段的数目，因为扩增片段主要是多切点 酶和切点数较少的酶组合产生的酶切片段，这样就可以 减少选择扩增时所需要的选择碱基数。 (2)双酶切可以进 行单链标记，从而防止形成双链造成的干扰。 (3)双酶切 可以对扩增片段数进行灵活调节。 (4)通过少数引物可产 生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的 AFLP 指纹。这样，经过酶切后就形成了三种类型的酶切片段， 如EcoRI/MseI 酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一 MseI片段、Mse工一MseI片段，由于 AFLP技术革新成 功的关键在于 DNA的充分酶切，所以对模板质量要求很 高，要注意避免其它 DNA污染和抑制物质存在。
a.多态性高；
b.共显性遗传，在二倍体的生 物中能区分纯合与杂合状态；
? （3）生化标记
c.在基因组中频繁出现，甚至
? （4）分子标记
贯穿分布于整个基因组；
我们这里讲的AFLP d.选择中性；
就是一种分子标记技 e.容易获得；
术。它是Amplified f.容易操作，自动化程度高；
Fragment Length Polymorphism 的简写，g.重复性好；
PCR扩增(PCR AMPLIFIED )
? 应用与接头相识别的引物进行扩增。 AFLP引物由三部 分组成：（ 1）5′端的与人工接头序列互补的核心序列 (core sequence) （2）限制性内切酶特定识别序列 (enzyme-specific sequence) （3）3′端的带有选择性碱基 的粘性末端 (selective extension) ，其中AFLP接头的设计 (包括核心序列和酶特定序列 )是关键之处，常用的多为 EcoRI和MseI接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱 基序列是引物的结合位点，合成的寡核苷酸接头经过 94℃变性， 37℃退火， 4℃保存备用；理论上每增加一 个选择性碱基，将只扩增限制性片段的 1/4，而在两个 引物上都有三个选择性碱基的情况下，则仅获得 1/4096 的片段；也就是说，只有那些两端序列能与选择碱基配 对的限制酶切片段被扩增。所以选择性碱基是选择用于 扩增的特定的限制性片段的一种精确而有效的方法；
连接
? 酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用 下与两种内切酶相应的特定接头相连接， 形成带接头的特异性片段。接头为双链， 由两部分组成，一部分是核心序列，一部 分是酶特定序列(能与酶切片段粘端互补)， 通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识 别位点的碱基，保证了连接片段不能再被 酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的 接头才能得到满意的扩增结果。
AFLP 分子标记技术及其 应用
涪陵师范学院生命科学系 主讲人：江 波
AFLP分子标记技术及其应用
? 一、什么叫AFLP ？ ? 二、AFLP 的基本原理是什么？ ? 三、AFLP 的实验过程怎样？ ? 四、AFLP 的应用研究如何？ ? 五、对AFLP 的评价
我们都知道世界是多姿多彩的，可以说是 五彩斑斓，花样百出，无奇不有！从生物
学这个角度来看，这到底是什么原因呢？
主? 要生物是的因多为样生性物主具要有包多括四样个性层！次！即：？遗？
传多样性、物种多样性、生态系统多样 性和景观多样性。
? 而遗传多样性是其它多样性的基础，也 可以说，生物多样性归根到底就是遗传 多样性。
? 那么大家知不知道遗传多样性是如何检 测的呢？
? （1）形态学标记 ? （2）细胞学标记
扩增片断长度多态性） ? 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、
SRAP（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称 为第三代分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性) 等
AFLP 的基本原理
? 基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子 量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人 工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形 成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR 引物3ˊ端选择性碱基的识别，对特异性片段进行 预扩增和选择性扩增。最后只有那些两端序列能 与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增； 最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯 酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。
AFLP的实验流程
? 模板制备
?DNA的提取（SDS法和CTAB 法）
? 酶切 ?连接
扩增片段通常用变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳，根据扩增片段大小范围选 择应用4% 一10% 的凝胶电泳。
?PCR扩增(PCR AMPLIFIED )
?预扩增(Pre-amplified)
?选择性扩增(Elective amplified)
叫做扩增片断长度多 h.所得数据可在实验室之间交
பைடு நூலகம்
态性。
流和比较
分子标记的历史：
? 第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
? 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA ）
?扩增产物凝胶电泳
应用放射自显影、银染、荧 光测序仪等方法显示结果，
?结果分析
通过Gene-Scan, Gel-Compare 等软件进行数据分析。
DNA的提取（SDS法和CTAB 法）
? SDS是Sodium dodecyl sulfate的缩写称为 十二烷基磺酸钠，
? CTAB是Cetyl trimethyl ammonium bromide的缩写十六烷基三甲基溴化氨，
? 两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜 使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出 来，另外，它还能保护DNA不受内源核 酸酶的降解。
酶切
? 为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内 切酶，一个用 6个碱基识别位点的限制性内切酶 (常用 EcoRI,、PstI或SacI )，另一个用 4个碱基识别位点的限制 性内切酶(常用MseI 、TaqI) 。采用双酶切的主要原因有： (1)多切点酶产生较小的 DNA片段，而切数点较少的酶 能够减少扩增片段的数目，因为扩增片段主要是多切点 酶和切点数较少的酶组合产生的酶切片段，这样就可以 减少选择扩增时所需要的选择碱基数。 (2)双酶切可以进 行单链标记，从而防止形成双链造成的干扰。 (3)双酶切 可以对扩增片段数进行灵活调节。 (4)通过少数引物可产 生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的 AFLP 指纹。这样，经过酶切后就形成了三种类型的酶切片段， 如EcoRI/MseI 酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一 MseI片段、Mse工一MseI片段，由于 AFLP技术革新成 功的关键在于 DNA的充分酶切，所以对模板质量要求很 高，要注意避免其它 DNA污染和抑制物质存在。
a.多态性高；
b.共显性遗传，在二倍体的生 物中能区分纯合与杂合状态；
? （3）生化标记
c.在基因组中频繁出现，甚至
? （4）分子标记
贯穿分布于整个基因组；
我们这里讲的AFLP d.选择中性；
就是一种分子标记技 e.容易获得；
术。它是Amplified f.容易操作，自动化程度高；
Fragment Length Polymorphism 的简写，g.重复性好；
PCR扩增(PCR AMPLIFIED )
? 应用与接头相识别的引物进行扩增。 AFLP引物由三部 分组成：（ 1）5′端的与人工接头序列互补的核心序列 (core sequence) （2）限制性内切酶特定识别序列 (enzyme-specific sequence) （3）3′端的带有选择性碱基 的粘性末端 (selective extension) ，其中AFLP接头的设计 (包括核心序列和酶特定序列 )是关键之处，常用的多为 EcoRI和MseI接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱 基序列是引物的结合位点，合成的寡核苷酸接头经过 94℃变性， 37℃退火， 4℃保存备用；理论上每增加一 个选择性碱基，将只扩增限制性片段的 1/4，而在两个 引物上都有三个选择性碱基的情况下，则仅获得 1/4096 的片段；也就是说，只有那些两端序列能与选择碱基配 对的限制酶切片段被扩增。所以选择性碱基是选择用于 扩增的特定的限制性片段的一种精确而有效的方法；
连接
? 酶切后的DNA片段在T4 DNA连接酶作用 下与两种内切酶相应的特定接头相连接， 形成带接头的特异性片段。接头为双链， 由两部分组成，一部分是核心序列，一部 分是酶特定序列(能与酶切片段粘端互补)， 通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识 别位点的碱基，保证了连接片段不能再被 酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的 接头才能得到满意的扩增结果。
AFLP 分子标记技术及其 应用
涪陵师范学院生命科学系 主讲人：江 波
AFLP分子标记技术及其应用
? 一、什么叫AFLP ？ ? 二、AFLP 的基本原理是什么？ ? 三、AFLP 的实验过程怎样？ ? 四、AFLP 的应用研究如何？ ? 五、对AFLP 的评价
我们都知道世界是多姿多彩的，可以说是 五彩斑斓，花样百出，无奇不有！从生物
学这个角度来看，这到底是什么原因呢？
主? 要生物是的因多为样生性物主具要有包多括四样个性层！次！即：？遗？
传多样性、物种多样性、生态系统多样 性和景观多样性。
? 而遗传多样性是其它多样性的基础，也 可以说，生物多样性归根到底就是遗传 多样性。
? 那么大家知不知道遗传多样性是如何检 测的呢？
? （1）形态学标记 ? （2）细胞学标记