基因工程原理讲义：基因克隆的质粒载体
基因工程第三章分子克隆载体
2、可扩增性 质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复
制。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型
质粒拷贝数较多，可达几百。
严谨控制型 拷贝数少，一般<10个，分子量大；
松弛控制型 拷贝数多，10-200个，分子量小；
复制受限，受细菌宿主DNA复制系 统的控制；
复制不受细菌DNA复制系统限制， 当宿主蛋白质合成受抑制时（如培 养中加入抗生素时），其拷贝数可 猛增至1000-3000之多，该性质对 基因工程技术十分有利。
7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。
第一节 质粒载体
一、质粒的基本特性
质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。
绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型:
来自pSCl01的 四环素抗性基因 Tetr
来自RSF2124的 氨苄青霉素抗性基 因Ampr。
特点
1. 具有多个单一的限制性内切酶位点。
2. Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。
3. 利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯 霉素使质粒拷贝数进一步扩增。
基因工程
第三章 分子克隆载体
商丘师范学院 马原松
பைடு நூலகம்
第三章 分子克隆载体
教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体: 质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过 本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的 分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载 体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理， 噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的 工作原理。 重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。 教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等
基因工程基本原理
基因工程基本原理
基因工程是通过改变生物体的基因组来实现对其性状的调控的技术。
其基本原理包括以下几个步骤：
1. 基因选择：从目标生物体中选择具有所需性状的基因。
2. 基因克隆：将目标基因从生物体中分离出来，通常通过
PCR等方法进行基因扩增。
3. 基因构建：将目标基因插入到载体DNA中，构建重组DNA。
载体可以是细菌、酵母或其他生物的染色体片段，一
般被称为质粒。
4. 基因转导：将重组DNA导入到宿主生物体中。
这通常使用
基因枪、电穿孔和细菌介导等技术来实现。
5. 检验与筛选：对转导后的宿主生物进行筛选，确认目标基因达到预期效果。
这可能需要对基因表达进行检测，例如通过PCR、基因表达测定等方法。
6. 基因表达：在宿主生物中，目标基因会被表达为蛋白质，进而影响其性状。
这可能需要使用特定的启动子、RBS和终止
子等元件来调控基因表达水平。
基因工程的基本原理就是通过这些步骤来实现对基因组的改造，从而达到人为调控生物性状的目的。
这项技术在农业、医学和
生物工程等领域有广泛应用，例如改良植物品种、生产特定药物和生物材料等。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
质粒载体的构建及其在基因工程中的应用研究
质粒载体的构建及其在基因工程中的应用研究随着基因工程技术的不断发展，质粒载体成为了实现基因转化的重要手段之一。
质粒载体构建是基因工程研究的重要环节，其成功与否直接关系到后续研究的开展和成果的取得。
本文将介绍质粒载体的构建原理、构建方法以及其在基因工程中的应用研究。
一、质粒载体的构建原理质粒载体是人工合成的单链圆形DNA分子，作为存储DNA序列的一种手段，其基本结构特征主要包括起始端、终止端、多个酶切位点、标记位点等。
考虑到质粒载体在基因工程研究中的应用，构建原理主要包括以下几点：1. 合成目的基因的DNA序列，包括启动子、编码区、终止子等。
2. 找到合适的质粒载体，通过酶切识别并将目的基因DNA序列与质粒载体进行连接。
3. 对连接后的质粒载体进行转化，将其转移到细胞中，获得外显表达的蛋白。
质粒载体的构建原理相对简单，但质粒载体在实际应用中的构建过程则需要复杂的技术手段和严密的实验操作。
二、质粒载体构建方法1. 基于PCR扩增法PCR扩增法是目前基因工程研究中最常用的方法之一。
选择需要进行扩增的目的基因DNA序列，使用酶切产生目的碎片，通过PCR扩增后，利用限制性内切酶等酶切方法进行连接。
2. 基于化学合成法在基于化学合成法中，研究者可以通过化学合成方式来合成目的基因DNA序列，在此基础上通过PCR扩增和限制性内切酶等酶切方法进行连接。
3. 基于网站选择法基于网站选择法是现在比较流行的方法之一，具有操作简单、成本低等优点。
研究者可以在网站上选择目的基因序列，并结合实验室已有的质粒载体库，在网站上进行设计、合成、定制和质粒表达等步骤。
三、质粒载体在基因工程中的应用研究质粒载体在基因工程中的应用研究十分广泛，可以用于植物基因转化、动物基因转化、疫苗研发、DNA疫苗的制备、表达蛋白的研究等方面。
1. 植物基因转化通过基因转化技术向植物中加入外源基因，可以使植物表现出新的性状或特征。
在实践中，研究者会将需要转入的序列合成后，利用限制性内切酶或其他酶切方法将其插入到质粒载体中，再利用农杆菌等工具将质粒载体导入植物细胞中，从而实现植物基因转化。
《基因工程》第三章 载体2
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
基因克隆主要载体系统
低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后 仍能有效的转化给受体细胞,同时低分子量的质粒 对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高 的拷贝数可获得大量的克隆基因
a
11
(三)质粒载体的选择记号
新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。
a
8
a
9
(一) 质粒载体
质粒载体包括以下两种： 1.克隆的质粒载体
允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。 2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
a
10
(二) 质粒载体必须具备的基本条件
(1) 具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。
(2) 具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形 DNA、 单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。
a
17
噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
基因克隆主要载体系统
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
基因工程原理基因克隆载体讲课文档
f：噬菌体DNA从寄主染色体 DNA上删除下来；
g：溶原性细胞按照正常速率分 裂。
第四十三页，共84页。
1. 与构建载体相关的λ噬菌体性质
基因按功能相近性聚集成簇： •左侧区：A-J，合成头尾蛋白的 全部基因 •中间区：J-N，非必要区，与重 组有关
•右侧区：N-R，DNA合成及 调控。
构建克隆载体的一般是非接合型质粒
第十六页，共84页。
6. 显性质粒和隐蔽质粒
显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。
如：
• 抗性质粒（R质粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、 抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等
• 育性质粒（F质粒） • 降解质粒：降解农药
• Ti质粒：形成冠瘿瘤
隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。
4. TA载体
T T
A
A
第三十三页，共84页。
第三十四页，共84页。
5. 质粒表达载体
——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在 受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。
第三十五页，共84页。
lac启动子表达系统
第三十六页，共84页。
质粒表达载体
融合型表达载体 非融合型表达载体
（c）不能提供复制能力
（d）不能为外源基因提供表达能力
• 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体 中只有（ a ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体
（a）pSCl01
（b）pBR322 （c）pUBll0
（d）pUCl8
第三十一页，共84页。
第七次课结束！
第三十二页，共84页。
——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要 基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程的四大技术
基因工程的四大技术
基因工程是一种通过改变生物体的基因来改变其外部表现的技术，它主要包括了四大技术：基因克隆、质粒载体构建、DNA测序和基因编辑。
基因克隆是指将特定的DNA片段从一个生物体中提取出来，然后将其复制到其他生物体中的过程。
这种技术早期是一种繁琐的手工操作，需要牛仔式的实验技能，并且存在着一定的风险。
随着现代技术的进步，基因克隆已经变得更加可靠和高效。
现在，使用PCR 技术和DNA修饰酶等工具可以快速且准确地进行基因克隆。
质粒载体构建是指将特定的DNA片段克隆到一个称为质粒的小环状DNA片段上。
质粒通常存在于细菌中，是细菌用来存储和传递基因的工具。
构建质粒载体需要将目标DNA片段连接到一个特定的质粒DNA片段上，然后将它转化到宿主细胞中。
质粒载体构建可以被用来生产大量蛋白质、药物和其他化合物。
DNA测序是指将 DNA 的顺序进行分析的过程。
这个技术可以让科学家更好地理解和操纵基因。
对于广泛的应用领域，如医学、环境和农业，DNA测序已成为关键的技术。
现代DNA 测序可以通过自动高通量技术，产生数以百万计的 DNA 片段的快速测序结果。
基因编辑是指通过分子生物学技术直接更改一段 DNA 序列的过程。
这种技术可以让科学家更好地理解基因，并且能够使目标细胞中的基因进行针对性的修改。
基因编辑是作为理解基因和生物活动的研究工具，以及改善人类健康、植物和动物耐逆性等实际应用的工具来使用的。
总之，四大基因工程技术的发展，使得科学家对于基因的理解逐步深入和进一步，也促进了科技和生产效率的提高，为我们的社会和未来奠定了更加坚实的基础。
基因工程的质粒载体
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
第四章 基因克隆的质粒载体
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
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碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
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8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
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氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
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什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
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从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性田文晓 1343001125按照来源和性质分类1、质粒载体①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体）1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出现无插入片段的空载体。
2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。
①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。
②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。
此时，原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖。
3、粘粒载体（柯斯质粒）①具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
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第六讲基因克隆的质粒载体中国科学院遗传与发育生物学研究所2017年8月基因克隆的质粒载体一、导言1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。
2．质粒的类型多种多样F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的寄主受体细胞中去。
R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞中去。
Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌素可使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
3．质粒载体70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。
二、质粒的一般特性1．质粒DNA(细菌质粒定义)*1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。
除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
*2.质粒DNA分子大小文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。
1Kb～200Kb (Sambrok et al.)5Kb～400Kb (Lehninger)MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿)1.5Kb≈1MD*3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
*4.质粒DNA的分子构型SC构型：即共价闭合环形的cccDNA所呈现的超螺旋构型。
走在凝胶的最前面。
OC构型：即开环DNA(ocDNA)所呈现的构型，其中一条DNA 链保持完整的环形结构，另一条链上则出现有一个至数个的缺口。
走在凝胶的最后方部位。
L构型：发生双链断裂形成的线性DNA分子所呈现的构型，通称L型。
走在凝胶中间部位。
2．质粒克隆载体必须具备的条件(三种共同的组成部分)①具有复制区或复制因子(replicator)复制因子：是指一段特定的质粒DNA，它含有质粒DNA的复制起点(ori)(origin of replication)，以及编码质粒DNA和质粒复制所需要的DNA序列结构。
*注意复制因子(replicator)和复制子(replicon)之间在概念上的差别。
复制子(replicon)：系指含有一个复制起始位点的DNA复制单位，例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行自主复制的遗传单元均称为复制子。
*在一般的情况下，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独立的复制子。
但在少数的情况下，由融合产生的质粒也会含有两个复制子，但其中只有一个有活性。
②具有抗菌素抗性基因一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状作为选择记号，而且在有关的限制酶识别位点上插入外源DNA片段之后形成的重组质粒，至少仍要保留一个强选择记号。
③具有若干限制酶单一识别位点这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的需要，而且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。
④具有较小的分子量和较高的拷贝数这类质粒的优点在于：a.低分子量质粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超过15Kb)仍可有效地转化给受体细胞；b.含有较高的拷贝数有利于质粒DNA的制备，增加克隆DNA片段(基因)的产量；c.低分子量的质粒分子中对某种限制酶具多重识别位点的机率也就相应下降；3．质粒DNA编码的表型①质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%。
②质粒DNA尽管分子量小，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。
b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……固N作用；H2S的合成；柠檬酸的利用；欧文氏菌的色素形成；产碱杆菌的反硝化活性；产碱杆菌和欧文氏菌的硫氨素的合成；c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；炭疽杆菌外毒素的合成；苏芸金芽孢杆菌 -内毒素的合成；破伤风杆菌神经毒素的合成；大肠杆菌定居抗原的合成；大肠杆菌及链球菌等的溶血素的合成；肠道细菌的血清抗性；耶尔森菌的毒力；炭疽芽孢杆菌的荚膜的合成；大肠杆菌中铁的运转。
d.其它特征：盐杆菌细胞中气泡的形成；链霉菌之痘疱形成的(致死接合)；肺炎克氏杆菌中的Kik+IncN质粒的致死效应；土壤杆菌对细菌素的敏感性；麻风杆菌之半透明/不透明菌落的变异；Nod+Flx+豌豆根瘤菌的根际蛋白质的合成；Caedibacter包涵体的产生；葡萄球菌之内肽酶活性。
4．质粒DNA的转移①接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。
控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。
加上大肠杆菌素基因——大肠杆菌Col质粒非接合型质粒加上抗菌素抗性基因——大肠杆菌R质粒，也称R因子。
带上一段寄主染色体DNA——F 因子接合型质粒(F因子) 加上大肠杆菌素基因——大肠杆菌素Col质粒加上抗菌素抗性基因——大肠杆菌R质粒，R因子②接合型质粒F因子是最有代表性的接合型质粒：F因子在寄主菌中的三种存在方式：a.染色体外双链环形DNA，F+细胞b.染色体外双链环形DNA F 细胞+寄主染色体DNA片段c.以线性DNA形式整合到Hfr细胞寄主染色体DNA上。
接合型质粒F因子的接合转移：F+细胞和F-细胞，以及性须pilus结构↓F+细胞和F-细胞混合培养，通过性须作用，细胞配对，这个过程称细菌的接合作用(conjcogation)↓在细胞配对期间，F+细胞中的F因子接滚环复制模型，经过性须通道进入F-细胞(单链)↓F-细胞变成F+细胞质粒的接合转移与基因工程的安全载体问题：从基因工程的安全性角度考虑，我们感兴趣的主要是非接合型质粒：理由是：①接合型质不但自身转移；②还可引起寄主染色体片段转移；③而如果F因子整合到寄主染色体上，则会牵动染色体发生高频转移；④引起其它非接合型质粒发生迁移作用。
5．质粒DNA的迁移作用(mobilization)①质粒DNA迁移作用的概念由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程叫做质粒DNA的迁移作用。
非接合型质粒由于分子量小不足以编码转移过程所需的全部基因，因而不能够发生自身转移，但如果寄主细胞中存在着共存着一种接合型质粒，那么它们通常也就可以被转移。
②质粒DNA迁移作用原理ColE1质粒是一种可迁移的非接合型质粒ColE1质粒迁移的生化过程：迁移条件bom位点，(位于ColE1质粒分子上)mob基因编码的核酸酶，又叫迁移蛋白*1.bom位点又叫nic位点，迁移蛋白作用于nic位点，从而引动非接合型质粒发生迁移作用。
mob gene=接合性动员基因conjugative mobilizationgene.nic site=自我转移的接合型质粒在起始接合性DNA转移时，在转移起点oriT进行链特异性及以部位特异性的单链切割的DNA部位。
*2.许多质粒载体在构建过程中已失去了nic位点，故此不能被迁移。
种nic-质粒的转移途径是形成融合质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。
*3.重组缺陷(recA)寄主菌株的使用在重组缺陷的寄主菌株中，nic-质粒就不会同接合型质粒发生重组，因此在recA寄主中，nic-质粒比nic质粒较为稳定。
*4.图4-5解释6．质粒DNA的复制类型①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的(stringent plasmid)高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的(relaxed plasmid)②质粒拷贝数定义：在文献中常用有两种定义A．常用定义：生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子数。
B．特殊定度：培养在富裕培养基中快速生长的细菌细胞，可拥有3-4条染色体DNA，而在碳源供应不足的培养基中缓慢生长的细菌细胞，平均只有1.1条染色体DNA。
因此有的文献中质粒拷贝数定义是：每个细菌细胞中每条染色体平均具有的质粒DNA分子数。
C．本书定义：在LB液体培养基中生长的每个细胞中含有高于20个以上质粒DNA者，叫做高拷贝质粒(High-copy-number plasmids)；低于20个的则称为低拷贝质粒(low-copy-number plasmids)。
7．质粒的不亲和性问题(incompatibility)不亲和性，即不相容性①定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。
②注意：只有当有确切的证据表明第二种B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。
③不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。
彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。
同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近。
④质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：*1负反馈调节环(negetive feed-back loop)大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。
在质粒拷贝数少的情况下，细胞中阻遏蛋白质亦相对降低，于是阻遏蛋白质与质粒DNA中靶序列相互作用，使之发生复制。
随着质粒DNA复制的结果，质粒拷贝数上升，于是所编码产生的阻遏蛋白质也就随之增多。
细胞中阻遏蛋白质浓度增多的结果，会形成二聚体，于是失去与质粒DNA结合并促使其发生复制的能力。
结果质粒复制停止，也就是说质粒拷贝数是受阻遏蛋白质的负反馈调节：负反馈调节环(negetive feed-back loop)当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。