流式细胞术在药学中的应用

流式细胞术在药学中的应用

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是20 世纪70 年代初发展起来的一项高新技术，利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。

流式细胞仪根据基本功能不同可以分为流式分析仪和流式分选仪[1] 。流式分析仪可以对细胞或微粒上标记的荧光物质进行分析，从而判定相应蛋白或核酸等物质的水平；而流式分选仪则可以在流式分析的基础上，将所需的细胞或微粒进行进一步分选，用于下游实验。流式细胞仪主要由三部分组成：液流系统、光学系统、和电子系统；流式分选仪还增加了分选系统。流式细胞仪的基本工作原理是：荧光物质标记的单细胞悬液样品在一定压力下进入流动室，经鞘液包裹以单细胞液流的方式经过检测区；细胞或微粒上所承载的荧光物质被激光束照射，发射出散射光以及特定波长的荧光，并通过不同滤光片；光信号在电子系统被转化为电信号，再转换为数字信号，经计算机分析处理，直观地统计出染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。散射光信号包括前向角散射光（forward scatter，FSC）和侧向角散射光（side scatter，SSC），FSC主要反映细胞大小，SSC主要反映细胞内颗粒的复杂程度等[2, 3] 。荧光信号的强弱则反映了相应检测物质（细胞内或细胞外）的表达水平高低。

生产流式细胞仪的主要厂家是美国的BD公司和贝克曼库尔特(Beckman Coulter)两家公司, 它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪, 并研制生产了FCM所用的各种单克隆抗体和荧光试剂[4] 。事实上，在实验之初，详细分析待测标记物在细胞中的水平，综合考虑标记物抗体、荧光强度、多色荧光补偿等各方面，合理选择荧光抗体并设计实验，这对于流式检测十分重要[3] 。应用流式细胞术的常用实验包括细胞表面标志检测、细胞内蛋白包括细胞因子检测、细胞分选、细胞凋亡与周期检测、染色体倍体分析、荧光报告基因表达和转染效率判定等基础和临床科学研究。

我们课题组主要研究的是2型糖尿病与肠道菌群的关系，查文献发现，Ｔ淋巴细胞是人体重要的免疫细胞群，外周血成熟Ｔ细胞主要有CD4+和CD8+ 2个亚群，它们在体内进行免疫应答时互相协同，又相互拮抗，以维持免疫应答的相对平衡，平衡失调会导致免疫功能紊乱，产生一系列的免疫病理变化，也影响机体的免疫保护机制[5-7] 。CD4+Ｔ细胞通过自身或调节其他免疫细胞分泌细胞因子而发挥作用，各种细胞因子可直接导致胰岛β细胞损伤并参与胰岛素抵抗。其中分泌的各种相关因子可通过各种途径造成组织损伤和肾脏纤维化，导致糖尿病肾病的发生。CD8+ T细胞具有抑制免疫细胞毒性效应的一种Ｔ细胞，其降低使对CD4+ T细胞功能的抑制作用减低，从而促进CD4+ T细胞对胰岛β细胞的损伤，加速糖尿病的发生发展[8, 9] 。

在一篇用流式细胞术检测T细胞在2型糖尿病中发病机制研究文献中发现[10] ，此项研究结果中，CD4+ T细胞亚群较对照组升高，而

CD8+亚群值明显低于对照组，提示２型糖尿病患者自身免疫调节功能异常，即具有抑制免疫细胞毒性效应的Ｔ细胞减少，CD4+ T细胞功能的抑制作用减弱，使辅助抗体产生的功能增强，自身抗体生成增多，免疫调节紊乱，促进糖尿病的发生、发展。CD4+/CD8+比值是临床上常用作了解机体细胞免疫功能的敏感指标。此项研究中，CD4+/CD8+比值明显升高，提示２型糖尿病患者存在明显的细胞免疫功能异常，这可能与CD8+ T细胞减少关系较大，故CD8+ T细胞减少在此细胞免疫缺陷中居主导地位。这种由T淋巴细胞介导的免疫异常可造成对胰岛Ｂ细胞的损伤，可能在２型糖尿病的发生、发展中起重要作用。糖尿病肾病患者外周血CD4+ T淋巴细胞较２型糖尿病组升高且差异有统计学意义，提示CD4+ T淋巴细胞可能参与糖尿病肾病的发生。

流式细胞术也可用于各种基因表达蛋白的定量、定性研究,选择不同的单克隆抗体及荧光染料, 可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征, 如果对具有某种特征的细胞有兴趣, 还可以利用流式的分选功能将其分选出来, 以便进一步培养、研究。所以说，流式细胞术在药学专业中对某些细胞、蛋白机制的研究有重要应用。