显微技术

根据不同的胶固剂，可选用不同的溶剂， 如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二 甲苯。方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯， 轻擦，并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用 吸耳球吹去可能残留的短绒。
目镜是否清洁可以在显微镜下检视。转动 目镜，如果视野中可以看到污点随着转动，则 说明目镜已沾有污物，可用擦镜纸擦拭接目的 透镜。如果还不能除去，再擦拭下面的透镜， 擦过后用洗耳球将短绒吹去。在擦拭目镜或由 于其他原因需要取下目镜时，都要用擦镜纸将 镜筒的口盖好，以防灰尘进入镜筒内，落在镜 筒下面的物镜上。
使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油 流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高 到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则 会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜 或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光 源。
三、普通显微镜的保养
显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保 养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中， 同时要注意下列事项：
二、普通显微镜的使用方法
1、低倍镜观察 先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标 本片，转动反光镜，调好光线，将物镜降低， 向上调至看到标本，再用细调对准焦距进行观 察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在 最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可 以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光 镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射 入光线的量，增加明暗差。
2、原理
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光 波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波 波长或增加数值口径可以提高分辨率。
最小分辨距离（分辨率）=0.5λ/nsinΘ λ:所用光源波长； n：玻片与物镜介质间的折射率； Θ：物镜口角度数的一半； nsinΘ也被称为数值孔径（numerical aperture，NA）
第一章 显微技术
显微镜分类
显微技术是微生物检验技术中最常用的 技术之一。显微镜的种类很多，在实验室中 常用的有：
普通光学显微镜、
暗视野显微镜、
相差显微镜、
荧光显微镜、
电子显微镜等。
一、普通光学显微镜的结构和基本原理
1、结构 光学系统一般包括:
目镜、物镜、聚光器、光源等；
机械系统一般包括：
镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等。
物镜分类
低倍物镜：1-6X，NA值为0.04-0.15； 中倍物镜：6-25X，NA值为0.15-0.4； 高倍物镜：25-63X，NA值为0.35-0.95； 油浸物镜：90-100X，NA值为1.25-1.40。
显微镜用光源，自然光和灯光都可以， 以灯光较好，因光色和强度都容易控制。一 般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微 镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。有 些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等， 常常使用卤素灯作为光源。
1、观察完后，移去观察的载玻片标本。
2、用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上 的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次， 最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。
3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。
4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上 标本移动器的位置，罩上防尘套。 镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁， 只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸 要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或 纱布等擦镜头。物镜在必要时可以用溶剂清洗， 但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。
六、显微计数
利用血球计数器在显微镜下直接计数是一 种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载 片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜 下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生 物总数。
血球计数器是一只特制载玻片。载片上有 两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其 中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又 称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种 是每个大方格分成16个中方格，每中方格又分 成25个小方格。另一种是一个大方格分25个中 方格，每个中方格又分成16个小方格，不论哪 一种，一个大方格，都等分成（25×16或 16×25）400个小方格。
计算公式如下：
16×25计数板：
总菌数/ml=ຫໍສະໝຸດ Baidu×400×10000×稀释倍数
=每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数
25×16计数板：
总菌数/ml=
×400×10000×稀释倍数 =每小方格内菌数×4×106×稀释倍数
染色观察
染色类型
活菌：美蓝或TTC染色 负染色法：给背景染色，衬托细菌 简单染色法：单一染料染色，如碱性染料 芽孢染色法：用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）染芽
孢，用弱染色剂染菌体 菌体着色，而将不着色的透明荚膜衬托出来
荚膜染色法：荚膜不易染色，故常用衬托染色法，即将 细胞壁染色法：对细胞壁成分进行特异染色
3、油浸镜观察 油浸镜的工作距离很小，所以要防止载玻片 和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、 高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油 浸镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍 物镜，直接用油浸镜观察。显微镜有自动止降装 置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴 中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。 没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微 镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接 触为止，然后用微调向上提升调准焦点。
四、其他显微镜
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
五、显微镜样本的制备
活体观察：
压滴法：加菌液，压盖玻片，立即观察 悬滴法：凹载玻片，加菌液，压盖玻片，立即观察
菌丝埋片法：玻璃纸上培养后观察
2、高倍镜观察 显微镜的设计一般是共焦点的。低倍镜对 准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点， 只要稍微转动微调即可。有些简易的显微镜不 是共焦点，或者是由于物镜的更换而达不到共 焦点，就要采取将高倍物镜下移，再向上调准 焦点的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足 够的光锥角度。稍微上下移动聚光镜，观察图 像是否清晰。
因为每个大方格边长为1毫米，载片与盖 片间距离为0.1毫米，所以每个计数室（1个大 方格）体积为0.1立方毫米。测出每个中方格 菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推 算出1毫升菌液内所含的菌数。
一个大方格是16个中方格时，应当数4角4 个中方格（即100个小方格）的菌数，一个大 方格是25个中方格时，除取4角4个中方格外， 还要数中央一个中方格（即为80个小方格）的 菌数。
物镜：标本的放大主要由其完成，物镜放 大倍数越大，它的焦距越短，工作距离也小。
目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标 准目镜的放大倍数是十倍。
聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形 成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分 辨率是很重要的，可以上下移动调节光的明暗。
可变光阑可以调节入射光束的大小。
物镜的常见参数