葡萄酒中苹果酸的测定

葡萄酒中苹果酸的测定原理:利用MegaQuant TM (专利技术)测定L-苹果酸需要进行三步酶解反应，第一步：在L-苹果酸脱氢酶(L-MDH)的催化作用下，L-苹果酸被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化生成草酰乙酸：(1) L-苹果酸+ NAD+(L-MDH)oxaloacetate + NADH + H+第二步：加入过剩的L-谷氨酸，在谷草转氨酶的作用下，生成L-天门冬氨酸和2–酮戊二酸(2) Oxaloacetate + L-glutamate(GOT) L-aspartate + 2-oxoglutarate第三步：在心肌黄酶的催化作用下，NADH还原碘硝基氯化四氮唑(INT)，生成甲基- INT(3) NADH + INT + H+(diaphorase)NAD+ +甲基-INT生成的甲基- INT的量取决于L-苹果酸的量，甲基- INT的吸光度值可在505nm下测量。

特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定L-苹果酸含量的。

最小可调吸光光度为0.01个吸光单位，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度为7.7 mg/L。

如果最小可调吸光光度为0.02吸光光度，样品体积为20uL，此时的L-苹果酸检测线为15.4 mg/L。

该实验的测量范围为0.15-15ug L-苹果酸(对于20uL样品液中的浓度为0.007-0.75 g/L)，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.01-0.02吸光单位的变化，对于样品体积为20uL，此时的L-苹果酸浓度大约在7.7-15.4 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。

干扰:红酒中的酚醛树脂会对本实验造成干扰，引起INT的“缓慢反应”（图2），因此在对未稀释的红酒进行测定时，必须首先用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）净化样品。

“缓慢反应”同样也发生在未稀释的白葡萄酒中，按照提供的方法进行测定，其缓慢反应速率非常的慢。

在用MegaQuant TM测定L-苹果酸的时候，对于存在的两种潜在的次要误差原因的认可是非常有必要的：1.使用PVPP去除了红酒中的大部分酚醛树脂，但是还是存在着“缓慢反应”，由于用PVPP处理过的葡萄酒（导致潜在的高估白葡萄酒中的L-苹果酸0.00-0.01g/L，或红葡萄酒中的浓度0.00-0.03g/L）其中存在的“缓慢反应”非常的慢，因此可以忽略不计（实验方法A），然而，如果想得到精确的结果，可以通过实验方法B精确计算得到。

2.推荐使用PVPP药片的测试方法（如每5 mL葡萄酒用1个药片）中，导致了对样品浓度进行了2 % (v/v)稀释，计算方法中考虑了这一点（请参照用PVPP处理样品方法）还原性物质能够干扰实验，引起“缓慢反应”，如：亚硫酸亚和抗坏血酸盐，但是仅仅能够对浓度不是很高的葡萄酒样品进行测定，如亚硫酸盐浓度在4 g/L，如果样品中的抗坏血酸盐含量非常高(> 400 mg/L)，则不能进行测定。

向已完成反应的试管中添加L-苹果酸（每20uL添加7.5 ug），通过增加的吸光度值进一步验证其他干扰的影响，利用附带的内部的规范质控可以对干扰物质进行鉴定。

通过向样品中添加规范质控做定量回收实验，计算样品在处理和提取时的损失。

安全性:L-苹果酸测定所使用的试剂没有有毒物质。

然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行实验。

试剂盒:MegaQuant TM L-苹果酸含量测定试剂盒可以进行60次的测定实验，并提供有全部的实验方法：58次测定试剂盒(cat. no. K-LMALR)瓶1: 双甘氨肽缓冲液(100 mL, 100mM, pH10.0) +L-谷氨酸(100 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性> 2年，4°C保存。

瓶2: 药片（60粒）-含有心肌黄酶, GOT, INT,FAD和NAD+，使用前要先恢复至室温在打开稳定性> 2年，-20°C。

干燥保存。

瓶3: L-苹果酸脱氢酶(1.3 mL, 15,000 U/mL)稳定性> 2年，4°C保存。

瓶4: L-苹果酸质控规范液(5 mL, 0.375 mg/mL)稳定性> 2年，4°C保存。

瓶5: 药片（65粒）-含有PVPP稳定性> 5年，室温保存。

试剂制备:1. 备用试剂盒中的瓶1溶液随时使用。

每个实验用量1.5 mL，也可以同等量的蒸馏水稀释，然后每个实验用3 mL。

2. 备用试剂盒中的瓶2随时使用。

保存于-20°C下稳定性> 2年。

3. 准备瓶3中的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。

每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。

4. 备用试剂盒中的瓶4溶液随时使用。

使用前恢复到室温，每个实验用量20uL5. 准备瓶5溶液随时使用。

注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了实验，再使用L-苹果酸规范质控溶液进行测定，通过提供的公式计算L-苹果酸的浓度。

实验需要的设备:1. 检测仪中提供有特定的测试用试管(平底。

16 x 100 mm)，同时我们也提供提取用试管(cat. no. G-MQTB25)2. 10 mL聚丙烯试管3. 微量移液器(20 uL).4. 连续分配器5. 玻璃刻度移液管及吸球6. MegaQuant TM测定仪7. 定时钟注意:1.此方法是专门用于测定经过苹果乳酸发酵的葡萄酒，如果葡萄酒中的L-苹果酸浓度> 0.75 g /L，需要对样品进行稀释。

2.稀释葡萄酒或葡萄汁必须使用纯净水（蒸馏水或高质量的水），如果使用饮用水，首先需要用D-果糖规范品验证是否适合使用。

3.测试用试管使用前必须清洗干净并烘干。

操作步骤:去除酚醛树脂:(对于红酒通常需要进行处理)1.取5 mL红葡萄酒加入到10 mL的聚丙烯试管中2.加入1片PVPP药片（瓶5），拧紧试管盖，充分混合5分钟，用WhatmanNo. 1 (9 cm)滤纸过滤，收集大约1 mL的滤液，滤液的颜色不能深于浅粉色（一般处理法），然而，具有深颜色的葡萄酒每5 mL需要加入2片PVPP，充分挤压收集滤液1 mL。

3.取20uL滤液进行测定A. 测试方法A.(简单法–参照图1)1.取1.5 mL 溶液1( ~ 23°C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0 mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。

2.用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。

3.加入20uL葡萄酒样品[经PVPP处理的(未稀释的红/白葡萄酒), 未经PVPP处理的(未稀释的白葡萄酒)或经稀释的葡萄酒或葡萄汁]，充分振荡混合。

4.大约1分钟后，将试管插入到MegaQuant TM测定仪，按下开关直到屏幕上显示‘---’（大约2秒钟）。

5.当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A1）6.取下试管，加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。

7.再次将试管插入MegaQuant TM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示‘1 second’,记录下数值A2。

8.为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值不再变化。

（参考图1和图2）注意:1.如果数值A2 > 1.00，10倍以上稀释样品，并再次测定，如果数值A2 <0.10，样品不要进行过分稀释（将100倍稀释改为10倍稀释）。

2.由于INT对光有敏感性（显色剂在药片中），长时间的反应将导致溶液颜色加深，因此必须按照推荐的操作方法进行测定。

3.在进行实验前，瓶1提前从冰箱中取出，并恢复到室温，如果温度<23°C，反应过程将很快结束。

4.添加药片到1.5 mL溶液1和1.52 mL蒸馏水中，确保药片全部溶解后测定的0 吸光度值作为空白对照，然后加入20uL 的L-苹果酸脱氢酶（瓶3），5分钟后测定增加的吸光度值(A2)，微小的吸光度变化(A2)是没有意义的（如由0.00到0.01）。

计算:ΔA L-苹果酸= 增加的吸光度值(A2)按照常规ΔA L-苹果酸的数值至少要在0.10个吸光单位，才能获得满意的实验结果。

L-苹果酸的含量可以依照下列公式计算（参照图3中的规范曲线）:未经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x ΔA L-苹果酸[g/L]20uL经稀释的样品c = 0.771 x 稀释系数xΔA L-苹果酸[g/L]经PVPP处理过的样品中的L-苹果酸浓度20uL未经稀释的样品c = 0.771 x ΔA L-苹果酸x 102/100[g/L]= 0.786 x ΔA L-苹果酸[g/L]20uL经稀释的样品c = 0.786 x 稀释系数x ΔA L-苹果酸[g/L]注释:102/100 = 经PVPP处理的葡萄酒的容差图1. 用分光光度仪测定(25°C,1 cm管径)的MegaQuant TM L-苹果酸随时间的变化。

注意:用此方法测定的L-苹果酸浓度比图3中测定的浓度要低，是由于此方法中使用的测试管管径为1 cm，而MegaQuant TM测试管大约为1.3 cm.测试方法B (对“缓慢反应”的处理)1.取1.5 mL 溶液1( ~ 23°C或更高)和1.5 mL蒸馏水加入到测试管中，或取3.0 mL用等体积蒸馏水稀释的溶液1（参照试剂配置方法第1点）。

2.用提供的镊子夹取1片药片（瓶2），充分混合1-2分钟至完全溶解。

3.加入20uL葡萄酒样品经PVPP处理的红葡萄酒，充分振荡混合。

4.大约1分钟后，将试管插入到MegaQuant TM测定仪，按下开关直到屏幕上显示‘---’（大约2秒钟）。

5.当屏幕上出现“0.00”松开开关（表示A0），同时记录时间。

6.取下试管5分钟，再次插入试管按下开关直到屏幕上显示‘1 second’，插入试管前不要按压按钮，否则将导致测定仪读取错误,记录下数值A1（经过5分钟由于存在缓慢反应将导致颜色增深）。

7.取下试管，立即加入20uL瓶3溶液（L-苹果酸脱氢酶），充分混匀确保全部全部溶解，同时记录时间。

8.再次将试管插入MegaQuant TM测定仪，5分钟后按下开关直到屏幕上显示吸光度,记录下数值A2。

9.为了确保试剂完全反应完全，在5分钟内每间隔1分钟读取一下数值，直到每间隔1分钟数值变化不超过0.01个吸光单位。