实验五 冰冻切片法
冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作
v1.0可编写可改正冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作实验目的1掌握冷冻切片的方法2掌握冷冻切片的用途实验原理冷冻切片是借助低温使组织冻结达到必定的硬度并经过冰起支撑作用来进行切片的一种方法。
速冻可减小冰晶直径，防止组织细胞损害。
制冷压缩机佛里昂制冷、半导体温差电制冷v1.0可编写可改正实验资料新鲜动物肝脏实验方法1准备将仪器翻开，样品台温度调至 -40 ℃。
2取材组织一定新鲜，尽可能不经水洗。
取材时应防止组织挤压，防备人为设想。
样品大小 5X5X3mm。
3速冻将样品放在样品台上，样品周围加水加固，冷冻5－10min.4切片高升温度至 -15 ℃（视样品而定），约5min 后开始切片，厚度 6-15um。
5制片将切片直接放在载波片上或先放在盛水（固定液）的培育皿中再转移到载波片上。
6染色察看吸干水，加一滴苏木精，加盖玻片，用显微镜察看。
7记录将察看的结果绘于实验报告上，整理自己用过的物件。
附：切片温度的设定脑-12℃肝脏-14℃肾脏-16℃肌肉-20℃皮肤 -25 ℃多脂肪组织-30 ℃经过固定的组织-5 ℃～-10 ℃附：迅速永远制片1固定 70 ％乙醇 5～ 10min ；2水洗 2min ；3苏木精染色 5 ～ 10min；4脱色 %HCl 至变红；5 蓝化变蓝；6 水洗 5 ～ 10s ；7 脱水 70% 2min；8 伊红染色 5 ～ 10min ；9脱水 100%乙醇 2minX2；10透明二甲苯 3min ；11封片中性树胶封片。
冷冻切片机的基本操作：1. 在使用前 2 小时开启电源，并将温度设定在-25 ℃ ;2. 将适合大小和厚度的标本放在蘑菇状杯上，加上冷冻蜡，夹在切片机的固定槽内;3. 准备好玻片，选择切片厚度，摇着手柄，即可做成切片;4. 将做成的切片当心的吸附在玻璃片上;5.使用结束后封闭电源 , 洁净腔体和擦干水气 , 做好使用记录。
6.为让水蒸气蒸发，请不要立刻封闭切片机的上盖移门，应到次日再关。
实验五-冰冻切片法ppt课件
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四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
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五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在 标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
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三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。
切取的组织不能过大，组织过大
快速，用时短。
不容易冻结或者组织冻结不均，
影响切片及染色效果。
组织变化不大。
能很好保存脂肪，类脂等成分。
不容易制作较薄的切片。
能够比较完好地保存各种抗原活性及 组织块在冻结过程中容易产生水
酶类，特别是对于那些对有机溶剂或
的结晶而影响细胞的形态结构及
热的温度耐受能力较差的细胞膜表面
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5
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
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一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
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二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
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抗原物质的定位，并且组织结构
抗原和水解酶保存较好。
也不如石蜡切片清晰。.Fra bibliotek3冰冻切片的适用范围
实验五 冰冻切片法解析
冰冻切片法简介
冰冻切片法是一种在低温条件下使已固定或 新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻快速 冷却到一定硬度，然后在切片机上切片的一 种方法。
冰冻切片的优缺点
优点：
简便，可以不需要对组织固定、脱 水、透明、包埋等手续即可进行切 片，减少了一些中间环节。
快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原活性
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器 冷台 冷刀
制冷调节器 切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导
体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
及酶类，特别是对于那些对有机溶 剂或热的温度耐受能力较差的细胞 膜表面抗原和水解酶保存较好。
缺点：
不容易做连续切片。 切取的组织不能过大，组织过大
不容易冻结或者组织冻ห้องสมุดไป่ตู้不均， 影响切片及染色效果。
不容易制作较薄的切片。 组织块在冻结过程中容易产生水
的结晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位，并且组织结构 也不如石蜡切片清晰。
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右·脂肪组织一般在-35℃以下；
切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
冰冻切片法详细步骤
冰冻切片法详细步骤冰冻切片法是组织化学，特别是酶组织化学最常用的切片技术，固定或未固定的组织样品均可进行冰冻切片，新鲜组织冰冻切片对组织细胞内酶类保存最佳，尤其对热、酸、碱、有机溶剂等耐受能力弱的酶和化学物质更加适用。
冰冻切片也是免疫细胞化学研究中常用的切片方法，能够较完好地保存多种抗原，尤其是表面抗原的抗原性。
在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，往往影响酶和抗原的定位。
一般认为冰晶少而大时，影响较小；冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织脏器如脑、心肌、骨骼肌中上述现象更易发生。
冰晶形成的主要原因是冷冻速度缓慢，温度偏高，细胞内冷冻不均匀所致，常采取以下措施以减少冰晶的形成。
1. 骤冷通常采用骤冷、速冻(1~10°C/s 的冷冻速度）的方法可减少冰晶形成。
(1) 干冰－丙酮（乙醇）法。
将150~200 ml 丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70°C ，用一小烧杯(50~100 ml) 装上异戊烧约50 ml, 再将烧杯缓慢置入干冰－丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烧温度达-70°C 时即可使用。
将组织块（大小为1 cmX0. 8 cmX0. 5 cm) 投入异戊烧内速冻30~60s 后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80°C低温冰箱内贮存。
(2) 液氮法。
将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm) ，如组织块小可适抵加 OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保待原位切勿浸入液氮中， 10~20 s 组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入-80°C 冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
2. 冷冻保护加入冷冻保护物质以防止冻害，并在冷冻情况下保持细胞和组织的活性。
防止冻害的物质有甘油、二甲亚砜(DMSO) 、蔗糖、甘露糖、聚乙烯吡咯烧酮(PVP) 等。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。
固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。
单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。
本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。
对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】1.固定要及时。
2.组织块的大小要合适。
3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6.选择合适的固定液。
7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。
脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。
本实验所用的是乙醇脱水。
乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。
缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。
为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。
冷冻切片方法及注意事项
冷冻切片方法及注意事项冷冻切片是一种常用的组织学研究方法，它能够帮助研究人员观察和分析生物组织的结构和功能。
下面将详细介绍冷冻切片的方法及注意事项。
1.组织采集：首先需要选择适当的生物组织样本，可通过手术切取、尸检或动物献体等方式获得。
2.组织处理：取出组织样本后，应立即进行处理，以防止样本脱水和坏死。
可将组织放入理化盐水或生理盐水中，避免干燥、坍塌或变形。
3.固定组织：使用适当的固定剂对组织进行固定，以保持组织结构的完整性。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛、乙醛等。
固定时间应根据组织大小和厚度进行调节，较小的组织可以固定2-4小时，而较大的组织可能需要24小时以上。
4.预冷冻：固定后的组织应在冷冻前进行预冷冻处理，以提高冷冻切片的质量。
预冷冻的方法包括放入冷冻剂中（如液氮、干冰等）或将其放入冰盒中进行冷藏，使组织完全冷却。
5.冷冻切片：使用冷冻切片机将预冷冻的组织切成薄片。
为了获得更好的切片结果，刀片的角度和厚度需要进行适当的调整。
同时，切制时需要快速而轻柔地移动切片机，以防止组织被拉伸或损坏。
6.切片收集：将切片收集在玻片上，通常使用细长形的切片夹或切片板来收集切片。
确保切片不受损并保持平整。
7.切片保存：将切片放入适当的保存溶液中，如PBS（磷酸盐缓冲液）或甘油等，以防止切片干燥和变形。
可以根据需要选择冷藏或冷冻保存。
冷冻切片需要注意以下事项：1.样本质量：选择新鲜、完整的组织样本，避免坏死、变性或损伤的组织。
2.固定剂选择：选择适当的固定剂进行组织固定，以保持组织结构的完整性。
3.冷冻速度：组织应尽快冷却，以避免组织脱水或破坏。
冷冻速度过慢可能会导致晶体形成，影响切片质量。
4.切片机状态：保持切片机的良好状态，定期检查刀片的锋利度和调整角度，以确保切片的质量。
5.切片技巧：需要轻柔、均匀地切片，避免组织被拉伸或扭曲。
同时，切片过程中需要快速操作，以减少冰晶对组织的破坏。
6.切片收集：收集切片时要避免切片叠加或悬浮，以免影响切片的观察和分析。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤
嘿，咱今儿就来讲讲这冰冻切片实验步骤！
你可别小瞧这冰冻切片，就像是厨师要做出一道美味佳肴，每一步都得精心料理。
首先呢，得准备好新鲜的样本，这就好比是做菜得有好食材呀！把样本修整好，可不能随随便便就扔那儿了。
然后就是冷冻啦！把样本放到那专门的冷冻设备里，让它快速地冻起来，这就像是给样本穿上了一层“冰铠甲”。
接下来，切片环节可就来咯！要小心翼翼地操作，不能切得厚了薄了的，那得跟艺术品一样精致才行。
想象一下，要是切得乱七八糟，那后面还怎么观察呀！
切好片之后呢，还得给它贴上标签，可不能搞混了呀，这就像给每个小宝贝起个名字一样。
再之后，就是染色啦！给这些切片染上漂亮的颜色，让它们能更好地展示出自己的特点。
这就跟给人化妆似的，得恰到好处，才能凸显出美来。
染完色，可不能忘了清洗呀，把多余的染料洗掉，让切片干干净净的。
最后就是观察啦！在显微镜下，仔细地瞅瞅这些切片，看看能发现
啥秘密。
这就像是在寻宝一样，充满了惊喜和期待呢！
做冰冻切片实验呀，就跟走一条小路似的，每一步都得稳稳当当的，要是哪一步出了岔子，那可就前功尽弃啦！所以呀，得打起十二分的
精神来。
总之呢，冰冻切片实验可不简单，但只要咱认真对待，一步一个脚
印地去做，肯定能收获满满的成果呀！加油吧！。
冰冻组织切片样品制备方法
冰冻组织切片样品制备方法组织采集后，经固定、冷冻、切片、晾片，方可进行免疫抗体标记。
1、组织的采集、固定和保存：不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而考虑采用不同的固定和保存方法。
此处介绍几种实验室常用方法。
液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中，并保存于液氮中。
固定法：采取新鲜组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10-30min，20%蔗糖中浸泡1小时或过夜，4︒C保存于20%蔗糖（含0.05%NaN3）中。
2、组织的冷冻和切片：组织的冷冻方法可根据固定和保存条件不同而不同。
使用冷冻切片机，将组织冰切成4-20μm的切片，粘贴于处理过的载玻片上，室温干燥1小时后，可进行免疫标记。
或放入载片盒，-80︒C密闭保存。
气体CO2冷冻法：将样品置于样品台的OCT中，打开钢瓶开关，CO2气体喷出，迅速冷冻组织样品。
干冰冷冻法：（适合小块和致密度低的组织，如胚胎、小块组织、活检组织等）将小组织块放入冷冻包埋模具中，调整切面位置（必要时可在体视镜下操作）后，置于干冰上（暂时无干冰，可置于-80︒C），待冷冻完全后，-80︒C密闭保存。
●直接冷冻法：将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上，于冰切机（箱体温度-80︒C）中直接冷冻。
3、冰冻组织切片的免疫荧光标记：将冰冻组织切片从-80︒C 冰箱中取出，室温放置10min, 待切片回温并干燥，PBS 10min 洗去OCT，可无需Triton处理，即可进行免疫抗体标记，操作步骤与培养细胞反应方法相同。
4、冰冻组织切片的免疫酶反应：（酶联免疫反应，在抗体作用之前或显色时组织样品需进行内源性酶抑制作用，以降低反应背景）碱性磷酸酶（AP）:密封保存的组织切片PBS 5min↓含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr↓一抗（稀释过）室温1-1.5hr或4︒C 过夜↓PBS 10min ⨯ 3↓二抗-AP（稀释过）室温1.5-2hr↓PBS 10min ⨯ 3↓显色: AP-CDS 5min⨯ 2↓NBT4.5μl/ml、BCIP3.5μl/ml in AP-CDS 室温或37︒C 5-30min↓TE 室温10min↓梯度乙醇脱水↓二甲苯透明↓中性树胶封片辣根过氧化物酶（HRP）:密封保存的组织切片PBS 5min↓3%H2O2.10% MeOH in PBS 室温3min↓PBS 5min⨯ 3↓含0.5%NS,1%BSA的PBS中室温封闭30min-1hr↓一抗（稀释过）室温1-1.5hr或4︒C 过夜↓PBS 10min ⨯ 3↓二抗-HRP（稀释过）室温1.5-2hr↓PBS 10min ⨯ 3↓显色: HRP-CDS室温20-30min↓梯度乙醇脱水↓二甲苯透明↓中性树胶封片。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
冷冻切片操作指南
冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。
本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。
一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。
冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。
冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。
二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。
样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。
2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。
冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。
3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。
4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。
通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。
5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。
使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。
6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。
注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。
7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。
三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。
在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。
2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。
过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。
3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。
手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。
冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作
冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作冷冻切片技术是一种常用的生物学实验技术，通过将生物组织或细胞样本在非常低的温度下快速冷冻并切割成薄片，以保持样本的原始结构和化学组成，从而观察细胞或组织的形态结构和功能。
冷冻切片技术广泛应用于组织学、细胞学、免疫学等领域的研究和临床诊断。
冷冻切片机是冷冻切片技术的关键设备，用于将冷冻后的样本切割成薄片。
下面将介绍冷冻切片技术实验的步骤及冷冻切片机的基本操作。
1.样本处理：将待切割的生物组织或细胞样本进行处理，如固定、染色等。
这些步骤可以根据实验需求进行选择，以保持样本的形态和结构。
2.冷冻固化：将处理好的样本通过冷冻剂（如液氮或液氮混合物）迅速冷冻固化。
冷冻速度越快，冰晶越小，样本的结构损伤越小。
3.取样本：将固化好的样本从冷冻剂中取出。
在取样本之前，需注意将取样本的器具和工作台等一同冷冻至与样本相同的温度，以避免样本融化。
4.进样盒固定：将样本放置在迅速冻结剂（如液氮）预冷的进样盒内，并用冷冻剂浸泡样本。
进样盒的固定有助于保持样本的形状和组织结构。
5.冷冻切片：将装有样本的进样盒置于冷冻切片机的切片台上，调节刀片与样本的切割厚度。
通常，切割厚度可根据需要调节，一般在5-100微米之间。
6.切片收集：将切割好的样本切片收集到载玻片中，通常使用水平移动的玻片支托架来收集切片。
收集时需保持切片的顺序，并用特定的液体介质（如生理盐水）浸润切片，以防止切片变形或干燥。
7.染色和显微观察：将切片进行染色处理，如组织染色、免疫染色等，以显示出组织的细胞结构和化学成分。
然后，可以使用显微镜观察和拍摄切片的形态结构和细胞组织分类。
冷冻切片机的基本操作如下：1.准备：打开冷冻切片机电源，确保刀片已经安装，并根据需要调整切割厚度。
检查是否有足够的液氮或其他冷冻剂供应。
2.进样：将待切割的样本放置在切片台上的进样盒中，使用夹具或夹具系统将其固定在进样盒上。
确保样本与刀片的切割平面垂直，并浸泡在冷冻剂中。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤1.准备实验所需材料和设备：包括有机溶剂（如乙醇、氯仿、甲醇等）、30%的蔗糖溶液、液氮、切片刀、显微镜玻片、显微镜载玻片、切片盒等。
2.收集和处理样品：可以选择动植物的组织或细胞作为实验样品。
收集样品后，可以用生理盐水或缓冲液进行清洗和去除杂质。
如果是动物组织，可以选择将其冷冻在液氮中，以保持其完整性。
3.组织固定：将收集到的样品转移到含有组织固定剂的试管中。
常见的组织固定剂包括缓冲液、乙醛或霍乱毒素。
根据所需的实验目的和需要，可以选择适当的组织固定剂。
4.组织固定处理：组织固定的时间因组织类型和目的有所不同，一般在数小时至数天之间。
在固定过程中可以加入一些缓冲液，以维持组织的pH值和渗透压。
5.甘油渗透：将固定的组织置于甘油溶液中。
甘油的作用是提高组织的柔软度和切片的质量。
一般可选择10%左右的甘油溶液。
6.冰冻：将处理好的组织置于液氮中，直到其完全冰冻。
冰冻的温度通常为－20℃。
在冰冻过程中，可以使用冷冻托盘和冷冻盒等设备加快组织的冻结速度。
7.切片：使用预先冷却的切片刀，将冰冻的组织切成所需的薄片。
切片的厚度一般为10-100微米。
为了保证切片的质量，可以在切片过程中使用切片保护剂，如30%蔗糖溶液。
8.华里士染色：将切好的组织切片转移到显微镜载玻片上，使用华里士染色液进行染色。
华里士染色是一种常用的组织染色方法，可以染色细胞核和细胞浆。
9.覆盖玻片：将染色后的切片盖在显微镜玻片上，并使用透明胶片或封口剂固定切片。
10.显微观察：将制备好的切片置于显微镜下，观察和记录感兴趣的细胞或组织结构。
可以使用不同放大倍数的镜头进行观察和分析。
11.结果分析：对观察到的细胞或组织结构进行分析和解释。
可以使用图像处理软件进行图像的分析和处理。
12.结论和讨论：根据实验结果，得出相应的结论并进行讨论。
可以与已有的研究结果进行对比，验证实验的准确性和可靠性。
组织冰冻切片步骤
组织冰冻切片步骤冰冻切片是一种常见的实验技术，用于获取生物样品的细胞或组织的薄片，以便进行进一步的研究和分析。
下面将介绍组织冰冻切片的步骤。
1. 材料准备首先，准备好所需的材料，包括冷冻剂（如液氮或干冰）、组织样品、切片刀、切片刀床、切片刀片、切片缓冲液（如磷酸盐缓冲液）和载玻片。
2. 固定组织样品将待切割的组织样品用适当的方法进行固定，比如使用福尔马林或其他适合的固定剂。
固定的目的是保持组织的形态结构和细胞的染色质形态。
3. 冷冻组织样品将固定后的组织样品置于冷冻剂中，使其迅速冷冻。
常见的冷冻剂包括液氮和干冰，其温度低于零下80摄氏度。
冷冻过程应尽量迅速，以避免组织样品的结构和细胞的形态发生变化。
4. 制备切片刀床和刀片在切片刀床上放置适当大小的切片刀片，确保刀片干净锋利。
切片刀片的角度和刀片的锋利度会影响切片的质量，因此需要定期检查和更换刀片。
5. 切割组织样品将冷冻的组织样品取出，迅速放置在切片刀床上，并用切片刀沿着组织的纵向或横向切割，制备薄片。
切割时要保持手的稳定和力度的均匀，以获得均匀且薄的切片。
6. 收集切片使用切片刀片或刷子将切割好的组织切片收集到切片缓冲液中。
切片缓冲液可以保持组织切片的湿润和形态结构。
7. 制备载玻片在载玻片上涂抹一层适当的胶水或明胶溶液，将收集好的组织切片均匀地放置在载玻片上。
确保组织切片的平整和分布均匀。
8. 干燥和固定切片将载玻片放置在室温下或烘箱中，使其干燥。
干燥后，可以使用染色剂或其他化学试剂对切片进行染色或固定，以便后续的显微镜观察和分析。
9. 显微镜观察和分析将制备好的组织切片放置在显微镜下，观察和分析组织的形态结构、细胞的类型和分布等信息。
可以使用不同的显微镜技术，如光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜，以获得更详细和精确的数据。
10. 结果记录和分析根据显微镜观察和分析的结果，记录和分析组织切片的特征和变化。
可以使用统计学方法对数据进行处理和分析，以得出科学结论和研究结果。
冷冻切片方法及注意事项
一、试验前预备清理试验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度〔- 15~-20 ℃*〕。
预备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后快速取出所需的颖组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材〔24×24×2mm*〕,以防形成冰晶造成切片中形成外形不一的空泡,使细胞内构造移位。
〔注：取材中目的标本既要明确也要确保其构造的完整性，应避开不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
〕三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片〔1~3 分种〕。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，依据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm 间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调整上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向略微用力轻轻一带,可避开组织摊片过程中皱折,保证组织构造的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT 剂、B 超藕合剂以及一般胶水。
B 超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,一般胶水或OCT 剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
〔OCT 包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
〕②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30 秒钟左右待胶凝固时将小组织放上, 组织四周再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
实验五 冰冻切片法
四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在
标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
注意事项
速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现， 软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min；
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右· 脂肪组织一般在-35℃以下； 封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。
冰冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二 氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导 体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技 的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切 片法，正在受到青睐。
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器
冷台 冷刀
制冷调节器
切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造；
练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏
实验用具：载、盖玻片药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。 切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水 龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅 通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流 水量：>400ml/min 将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀 片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切 出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。 切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。 封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明 胶液，
冰冻切片技术
冰冻切片技术1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。
因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。
2：实验步骤：①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。
放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。
④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。
⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。
⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。
⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。
4：结果分析及讨论：①切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。
②切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染④严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5：思考题：①什么时候做冰冻切片：1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤2：判断肿瘤的良恶性2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。
冰冻切片制备 实验步骤
冰冻切片制备实验步骤冰冻切片制备是一种常用的实验技术，用于制备生物样品的切片，以便进行显微镜观察和分析。
下面将按照实验步骤的顺序进行详细介绍。
1. 样品的准备选择合适的样品进行制备。
样品可以是细胞、组织或生物体的一部分。
根据实验的需要，样品可以是新鲜的或者固定的。
2. 样品的固定如果选择的样品是新鲜的，需要先进行固定以保持其形态和结构。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛等。
将样品放入固定剂中，根据样品的大小和种类，固定的时间可以从几分钟到几小时不等。
3. 样品的冰冻将固定后的样品进行冷冻以减少切片时的变形。
可以使用液氮或冰冻机将样品迅速冷冻至零下20摄氏度以下。
冷冻的时间要尽量短，避免冰晶的形成对样品造成损伤。
4. 切片仪的准备将切片仪调整到适当的工作状态。
切片仪的刀片需要保持锋利，切片盒需要清洁干净。
5. 样品的切片将冷冻的样品取出，迅速放入切片盒中。
使用切片仪将样品切片，切割的速度和厚度根据需要进行调整。
切片时要保持手稳定，避免切出的切片变形或损坏。
6. 切片的收集将切下的样品片收集到盛有PBS（磷酸盐缓冲液）的培养皿中。
这样可以避免切片的干燥和变形。
7. 样品的染色根据实验需要，可以对切片进行染色以便于观察。
常用的染色方法有荧光染色、组织学染色等。
染色后的切片需要进行洗涤以去除多余的染料。
8. 切片的保存将染色后的切片放入玻片盒中，用透明胶带密封。
存放在适当的温度和湿度条件下，避免切片的变形和腐败。
通过以上步骤，我们可以得到冰冻切片制备的样品，以供显微镜观察和分析。
冰冻切片制备技术可以用于各种生物学研究，如细胞生物学、组织学和病理学等领域。
它可以帮助我们观察样品的细节结构，了解其功能和病理变化，为科学研究和临床诊断提供重要的依据。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤冰冻切片是一种常用的实验技术，用于研究生物样品的结构和功能。
在冰冻切片实验中，样品必须被快速冻结并制成非常薄的切片，以保持样品的原始结构和形态。
以下是一个冰冻切片实验的一般步骤，供参考。
1.准备工作：-准备所需的实验材料和设备，包括动物或细胞样品、细胞培养基、PBS缓冲液、冷冻剂（如液氮或干冰）、冷冻切片机、切片刀片、切片贴片和载玻片等。
-充分冷却冷冻切片机，并确保切片刀片处于锋利和清洁状态。
-确保实验环境卫生干净，并且操作台面上没有其他杂物和细菌。
2.过度冷冻：-在离心管或培养皿中收集样品，如组织块或细胞团。
-将样品迅速置于冷冻剂中，以快速冷冻样品。
在制备过程中，样品冷冻的速度非常重要，可以使用冰浴或液氮使样品迅速冷冻。
3.制备冷冻样品：-将冷冻固态样品放入冷冻切片机的样品夹内，确保样品与夹具接触良好。
-调整切片刀片的角度和位置，以确保薄片的切割。
-使用冷冻切片机制备冷冻样品，比如用于大脑切片的考尔密斯键切片机。
4.切片过程：-打开冷冻切片机的刀片和样品夹，以容纳载玻片。
-将切片刀片横跨切片机的切片口，并确保刀刃与样品夹接触。
-使用微调装置，轻轻地将切片刀片向下移动，以制备样品切片。
可以根据需要调整切片的厚度。
5.取样和处理：-将切制好的样品轻轻地使用毛刷或细针取下，并将其浸泡在PBS缓冲液或其他处理液中进行进一步处理。
-根据实验需求，可以进行染色、免疫标记和显微镜检查等处理。
6.制备切片贴片和载玻片：-取出切片贴片并将其浸泡在PBS缓冲液中，让其变湿。
-使用镊子或其他工具将处理好的样品放在切片贴片上，然后轻轻地将切片贴片放在载玻片上。
确保样品均匀分布在切片贴片上，并避免形成气泡。
7.干燥和封装：-将切片贴片从PBS缓冲液中取出，用纸巾或吸水纸轻轻地吸去多余的液体。
-将载玻片置于干燥盒中，确保切片在常温下彻底干燥。
-使用合适的密封胶将载玻片封装，以防止切片的氧化和损坏。
总结：冰冻切片实验是一种常用的技术，用于研究生物样品的结构和功能。
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缺点：
不容易做连续切片。 切取的组织不能过大，组织过大 不容易冻结或者组织冻结不均， 影响切片及染色效果。 不容易制作较薄的切片。 组织块在冻结过程中容易产生水 的结晶而影响细胞的形态结构及 抗原物质的定位，并且组织结构 也不如石蜡切片清晰。
冰冻切片的适用范围
在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或 者怀疑时，需要病理确定。 了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需 要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。 在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科 研组织等。 某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法， Hortega氏法和Holzer氏法等。 对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在
标签纸写上验五 冰冻切片法
冰冻切片法简介
冰冻切片法是一种在低温条件下使已固定或
新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻快速
冷却到一定硬度，然后在切片机上切片的一
种方法。
冰冻切片的优缺点
优点：
简便，可以不需要对组织固定、脱 水、透明、包埋等手续即可进行切 片，减少了一些中间环节。 快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原活性 及酶类，特别是对于那些对有机溶 剂或热的温度耐受能力较差的细胞 膜表面抗原和水解酶保存较好。
冰冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二 氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导 体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技 的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切 片法，正在受到青睐。
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器
冷台 冷刀
制冷调节器
切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造；
练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏
实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导 体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。 切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水 龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅 通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流 水量：>400ml/min 将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀 片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切 出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。 切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。 封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明 胶液，
注意事项
速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现， 软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min；
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右· 脂肪组织一般在-35℃以下； 封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。